Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - АНО "НИИ ДПБ", г.  Москва) (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 26 июня 2008 г. N ПВР-1-3.8/02157)

Инструкция
по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ"
(организация-производитель - АНО "НИИ ДПБ", г. Москва)
(утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 26 июня 2008 г. N ПВР-1-3.8/02157)


I. Общие сведения


1. Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ".

2. Состав набора:

1). Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом ИРТ - 2 штуки;

2). Положительный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 0,1 мл -1 пробирка;

3). Отрицательный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 0,1 мл -1 пробирка;

4). Антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена 100-кратный концентрат (Конъюгат), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 0,25 мл - 1 пробирка;

5). 20-кратный концентрат буферного раствора для промывки планшетов (ФСБТ), бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 4 флакона;

6). Сыворотка крови лошади, лиофилизированная (СЛ), гомогенная масса желтоватого цвета, 1,0 мл -1 флакон;

7). Субстратный раствор (СР), бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 1 флакон;

8). Стоп-раствор, бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 1 флакон.

3. Набор "ИРТ-СЕРОТЕСТ" предназначен для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита (ИРТ) в сыворотке крови крупного рогатого скота (КРС) методом иммуноферментного анализа (ИФА) и определения титра антител. Набор рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сыворотки крови (в 2-х повторах) и двух контрольных проб (в 2-х повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

4. Упаковка и маркировка

Компоненты набора выпускают в закрытых флаконах. На флаконы с каждым компонентом наклеивают этикетки с указанием: наименования и товарного знака организации-производителя, краткого названия набора, краткого названия компонента, его номера и количества во флаконе (согласно п. 2 инструкции), номера серии, номера контроля, срока годности (месяц, год). На пакет с полистироловым планшетом наклеивают этикетку с указанием организации-производителя и ее товарного знака, краткого названия набора и названия компонента, номера серии и контроля, срока годности.

На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают: наименование и товарный знак организации-производителя, полное название набора, номер серии и контроля набора, срок годности (месяц, год), условия хранения, обозначение СТО и надпись "для животных"; в коробку вкладывают инструкцию по применению набора.

Примечание: В наборе содержатся все необходимые для проведения анализа реактивы, за исключением дистиллированной воды. В качестве дополнительного оборудования необходимы микропипетки на 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, суховоздушный термостат с температурой 37°С, спектрофотометр с длиной волны 450 нм.


5. Срок годности компонентов набора - 12 месяцев с даты изготовления при условии хранения и транспортирования их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов! Флаконы без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета подлежат выбраковке. Микропанели и контрольные сыворотки обеззараживают 3% раствором хлорамина. Остальные компоненты набора не требуют специальных мер утилизации. Запрещено использовать наборы по окончании срока годности.


II. Принцип метода


6. Метод основан на взаимодействии иммобилизованного на поверхности лунок вируса инфекционного ринотрахеита КРС (BHV1) со специфическими антителами из исследуемой пробы сыворотки и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченными пероксидазой хрена специфическими антителами к IgG крупного рогатого скота). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антител в определяемой пробе.


III. Порядок применения


7. Подготовка биологического материала

Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 час после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре минус 20°С. Перед исследованием замороженные образцы в течение 5-10 минут нагревают в водяной бане при температуре 37°С.

В случае выпадения осадка в пробах сыворотки крови их обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000g.

Не рекомендуется исследование проросших и гемолизированных сывороток, а также многократное замораживание и оттаивание образцов сыворотки крови.

8. Подготовка рабочих растворов

8.1. Перед началом работы все реагенты выдерживают не менее 0,5 ч при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

8.2. Рабочий раствор буфера для отмывания планшетов (ФСБТ). Содержимое флакона N 5 разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. Пример: для получения 500 мл рабочего раствора к 25 мл концентрата добавляют 475 мл воды. Следует иметь в виду, что для обработки одного стрипа требуется примерно 30 мл рабочего раствора. Рабочий раствор стабилен при температуре 4°С в течение 3 суток. Для более длительного хранения раствор замораживают и хранят при температуре минус 20°С.

8.3. Буфер для разведения (БР) испытуемых сывороток и контрольных образцов представляет собой рабочий раствор ФСБТ.

8.4. Буфер для разведения конъюгата (БРК). Представляет собой рабочий раствор ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. БРК готовят в 2 этапа:

1). Во флакон с СП добавляют 1 мл рабочего раствора ФСБТ и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения.

2). Далее готовят необходимое количество БРК, например, для приготовления 10 мл БРК необходимо к 9,5 мл ФСБТ добавить 0,5мл раствора СЛ.

8.5. Рабочий раствор конъюгата. Необходимого количества концентрата конъюгата (флакона N 4) разводят в 100 раз буфером для разведения конъюгата (БРК), приготовленного по п. 8.4.

8.6. Субстратный раствор (СР, флакон N 8) и стоп-раствор (флакон N 9) - готовы к применению.

Внимание. Все компоненты набора стабильны до истечения срока годности. Оставшиеся после частичного использования компоненты должны храниться плотно закрытыми в заводской упаковке. Запрещено переливать в другую посуду и смешивать компоненты из наборов разных серий!

9. Проведение анализа

9.1 Исследуемые и контрольные сыворотки разводят в 100 раз буфером для разведения (БР), приготовленным по п. 8.3.). Пример: для получения 300 мкл пробы сыворотки дпя анализа к 3 мкл сыворотки добавляют 297 мкл буфера для разведения образцов (БР).

9.2. В лунки А1-В1 и C1-D1 вносят по 10  мкл разведенных в 100 раз контрольных проб ().

В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл разведенных исследуемых проб сыворотки (по две лунки на каждый образец).

Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 45 мин при температуре 37°С.

9.3. Планшет 4 раза промывают рабочим раствором ФСБТ, подготовленным по п. 8.2., доверху заполняя лунки и каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

Внимание. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется до начала работы промаркировать каждый стрип для восстановления их первоначального расположения.

9.4. В каждую лунку добавляют по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (см. п. 8.5.).

Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 45 мин при 37°С.

9.5. Планшет 5 раз промывают рабочим раствором ФСБТ (см. этап 9.3).

9.6. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл субстратного раствора. Планшет инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте.

9.7. Останавливают реакцию добавлением 100 мкл стоп-раствора.

9.8. После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм ().

10. Учет и интерпретация результатов

10.1. На первом этапе проводят оценку отрицательного и положительного контролей, входящих в состав набора. Результаты реакции считаются достоверными и могут быть учтены, если контрольные показатели соответствуют следующим критериям:




Если полученные значения не соответствуют вышеуказанным критериям, результаты ИФА считаются недостоверными и реакцию повторяют. Если отрицательного и положительного контролей соответствуют вышеуказанным критериям, далее проводят оценку результатов реакции в лунках с испытуемыми образцами.

Вычисляют среднее значение для каждой опытной пробы ().

Пробу считают отрицательной, если:

Пробу считают положительной, если:

Если: , то проба считается сомнительной и животное рекомендуется исследовать повторно.

10.2. Для определения титра антител в исследуемых образцах, на первом этапе высчитывают коэффициент связывания антигена сывороточными антителами по формуле:



Интерпретацию результатов проводят с использованием прилагаемой таблицы:


Значение Ксв

Титр антител

< 15%

Проба отрицательная

16% - 25%

1/100 проба сомнительная

26% - 40%

1/200

41% - 60%

1/400

61% - 90%

1/800

91% - 100%

1/1600

> 100%


IV. Меры личной профилактики


11. Работу с компонентами набора следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть это место большим количеством водопроводной воды.

12. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.

13. Набор следует хранить в местах, недоступных для детей.


Инструкция разработана АНО "НИИ ДПБ" совместно с фирмой INGENASA (Испания). Юридический адрес: 109518, г. Москва, Грайвороновский 1-ый проезд, д. 2а. Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.


Рекомендовано к регистрации и применению "ФГУ ВГНКИ".


Заместитель Руководителя Россельхознадзора

Н.А. Власов



Разъяснен порядок применения набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ".

Насчитываются 8 наименований предметов: планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом ИРТ, положительный и отрицательный контроль и др. Набор рассчитан на проведение на 1 планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сыворотки крови (в 2-х повторах) и 2-х контрольных проб (в 2-х повторах). Также можно дробно использовать компоненты для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала. В наборе есть все необходимые реактивы, кроме дистиллированной воды.

Срок годности компонентов - 12 месяцев с даты изготовления при условии хранения и транспортирования их в защищенном от света месте при температуре 2-8°С.


Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - АНО "НИИ ДПБ", г. Москва) (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 26 июня 2008 г. N ПВР-1-3.8/02157)


Текст инструкции официально опубликован не был


Откройте нужный вам документ прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Получить доступ к системе ГАРАНТ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.