Купить систему ГАРАНТ Получить демо-доступ Узнать стоимость Информационный банк Подобрать комплект Семинары

Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий (утв. Госкомсанэпиднадзором РФ и Минздравмедпромом РФ 9 июня 1995 г. N 01-19/50-11) (утратила силу)

Инструкция
по организации и проведению противохолерных мероприятий
(утв. Госкомсанэпиднадзором РФ и Минздравмедпромом РФ 9 июня 1995 г. N 01-19/50-11)

ГАРАНТ:

Настоящая Инструкция утратила силу в связи с введением Методических указаний МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры", утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ 15 января 2002 г.

Содержание

 

Приложения

 

1.1.  Перечень  территорий    Российской   Федерации     по  типам       
      эпидемических проявлений холеры                                    
1.2.  Паспорт госпиталя для больных холерой                              
1.3.  Формирование лабораторной базы очага холеры                        
1.4.  Обеспечение   лабораторной   базы  очага холеры  недостающим       
      оборудованием и средствами диагностики                             
1.5.  Паспорт на стационарную точку для отбора проб воды                 
1.6.  Средства     и методы    дезинфекции,   которые   могут быть       
      использованы   при   работе  с объектами, контаминированными       
      холерными вибрионами                                               
1.7.  Режим обеззараживания при холере                                   
1.8.  Расчетные    нормы   расхода   дезинфекционных  средств  для       
      проведения дезинфекционных мероприятий при холере                  
2.1.  Табель оснащения палаты регидратационной терапии                   
2.2.  Перечень  необходимых медикаментов и других материалов   для       
      лечения 100 больных холерой                                        

 

3.1.(2) Формы направлений и учета результатов исследований               
3.3.  Паспорт штамма                                                     
3.4.  Журнал   учета  материала  от  больных  (трупов)    людей  с       
      подозрением на холеру и другие карантинные инфекции                
3.5.  Журнал  регистрации микробиологических исследований объектов       
      окружающей среды                                                   
3.6.  Журнал идентификации культур холерных вибрионов                    
3.7.  Журнал автоклавирования                                            
3.8.  Сведения о работе лаборатории                                      
3.9.  Табель  оснащения  лаборатории  мощностью   200, 500  и  1000      
      анализов на холеру в сутки (продолжительность работы 30 дней)      
3.10. Перечень предметов укладки для  забора материала  на  холеру       

 

Введение

 

Эпидемическая обстановка по холере в России остается неблагополучной и характеризуется завозами инфекции из зарубежных стран, неблагополучных по холере с регистрацией спорадических случаев и крупных вспышек. Отмечен завоз случаев инфекции, обусловленных холерными вибрионами 0139 серогруппы холеры Бенгал. На ряде административных территорий продолжает ежегодно выделять холерные вибрионы из объектов окружающей среды.

Анализ эпидемических осложнений по холере в России подтвердил целесообразность районирования административных территорий по типам эпидемических проявлений холеры с осуществлением дифференцированного объема профилактических мероприятий. Оправдан дифференцированный объем противоэпидемических мероприятий при возникновении очага холеры с учетом вирулентности, токсигенности холерных вибрионов, выделяемых от больных (вибриононосителей).

Вместе с тем, некоторые профилактические и противоэпидемические мероприятия не представлены в инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий (1991 г.) или были включены в другие методические документы. Это затрудняло проведение противохолерных мероприятий.

В инструкцию введены дополнительные разделы о мероприятиях по обеспечению противоэпидемической готовности санитарно-профилактических и лечебно-профилактических учреждений, проведению карантинно-обсервационных мероприятий при возникновении очагов холеры, оценке эффективности противоэпидемических мероприятий, обеспечению режима безопасности работы в госпиталях, изоляторах и обсерваторах. Кроме того, внесены дополнения в разделы эпидемиологического надзора, экстренной профилактики, эпидемиологического анализа.

Представленные в разделе лабораторной диагностики положения включают новые представления о таксономии вибрионов, дифференциации холерных вибрионов от других патогенных для человека винтов. Впервые приведены сведения о новом варианте возбудителя холеры - холерных вибрионах 0139 серогруппы, предложены способы оценки эпидемической значимости холерных вибрионов по наличию гена холерного токсина, выявляемого методом молекулярного зондирования и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того, изложены методы определения чувствительности холерных вибрионов к антибиотикам и представлен раздел организации лабораторных исследований.

В настоящей инструкции учтены требования Санитарных правил по безопасности работ с микроорганизмами I-II групп патогенности (СП 1.2.011-94) ГКСЭН России, Москва, 1994; Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР (1981); Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерных вибрионов (Саратов, 1983) и ряда других нормативно-правовых и инструктивно-методических документов по организации и проведению противохолерных мероприятий и лабораторных исследований при холере.

С выходом настоящей инструкции считать утратившей силу "Инструкцию по организации и проведению противохолерных мероприятий". N 06-14/8-14 от 26.06.91 г. и "Инструктивно-методические указания по лабораторной диагностике холеры", N 04-23/2 от 12.09.83 г.

Профилактические и противоэпидемические мероприятия

 

1. Профилактические мероприятия

ГАРАНТ:

О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил - СП 3.1.1086-02 см. постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 21 января 2002 г. N 4

1.1. Организационные мероприятия

 

1.1.1. Комплекс профилактических мероприятий, направленных на предотвращение случаев завоза и местных заболеваний холерой, их распространение, должен проводиться учреждениями госсанэпиднадзора, здравоохранения и ведомственных служб на территории Российской Федерации в соответствии с Конституцией Российской Федерации, Законом РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", "Основами законодательства Российской Федерации о здравоохранении", "Законом Российской Федерации об охране территории Российской Федерации от завоза и распространения особо опасных инфекционных болезней людей, животных и растений, а также токсичных веществ", "Правилами по санитарной охране территории Российской Федерации от завоза и распространения карантинных и других опасных инфекционных заболеваний", указами Президента Российской Федерации, постановлениями Правительства Российской Федерации, приказами и другими нормативно-правовыми документами Госкомсанэпиднадзора России и Минздравмедпрома Российской Федерации по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

1.1.2. На различных административных территориях (республика в составе Российской Федерации, край, область, автономные образования, город, район в соответствии с документами, перечисленными в п.1.1.1., разрабатываются единые комплексные планы противохолерных мероприятий территориальными, в том числе ведомственными, центрами Госкомсанэпиднадзора, учреждениями здравоохранения, территориальными противочумными учреждениями и другими ведомствами.

1.1.3. Планы должны быть согласованы со службами и учреждениями, привлекаемыми к его реализации, и утверждены соответствующими органами исполнительной власти.

1.1.4. При составлении комплексного плана противохолерных мероприятий необходимо учитывать: к какому типу эпидемических проявлений холеры относится административная территория (приложение 1.1.); результаты анализа инфицированности людей и выделения холерных вибрионов из объектов окружающей среды; санитарно-эпидемическую обстановку по холере на сопредельных административных территориях и в странах, с которыми осуществляются культурные, религиозные и торгово-экономические связи; данные о заболеваемости кишечными инфекциями; климато-географические особенности; социально-экономические условия; транспортные связи, миграционные процессы, санитарно-гигиеническое состояние территории (водоснабжение, канализование, санитарная очистка); характер и условия рекреационного и бытового водопользования; санитарно-гигиенический режим на предприятиях пищевой промышленности, торговли, в пунктах временного и массового пребывания людей (вокзалы, гостиницы, рынки и другие объекты), в пунктах первичного и стационарного размещения беженцев, мигрантов; обычаи и традиции коренного населения.

1.1.5. Планы подлежат ежегодному корректированию на основе действующих нормативных документов, с учетом изменений условий и факторов, перечисленных в п.1.1.4, и при изменении типа территории по эпидемическим проявлениям холеры.

1.1.6. В комплексных планах противохолерных мероприятий особое внимание должно быть уделено:

- организационным мероприятиям по формированию территориальных санитарно-противоэпидемических комиссий (СПК) с ежегодным уточнением их состава; заслушиванию на заседаниях СПК материалов по выполнению мероприятий, направленных на обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия по холере; определению порядка и обеспечения передачи информации на случаи осложнения эпидситуации; определение групп консультантов по организации и проведению клинической и лабораторной диагностики холеры, противохолерных мероприятий;

- вопросам обеспечения готовности и взаимодействия органов и учреждений Госкомсанэпиднадзора России, Минздравмедпрома России, МВД России, Минобороны России, МПС России, ФСК России, ФПС-Главкомата, подведомственных им медицинских учреждений, других министерств и федеральных органов исполнительной власти на случай эпидемических осложнений по холере;

- обеспечению постоянного эпидемиологического надзора за холерой с учетом степени потенциальной опасности реализации ведущих факторов передачи, путей распространения возбудителя инфекции и типа территорий;

- специальной подготовке медицинских и немедицинских кадров;

- санитарно-просветительной работе.

1.1.7. При планировании необходимо определить сроки выполнения мероприятий, ответственных исполнителей от основных и привлекаемых к исполнению органов и учреждений госсанэпиднадзора, здравоохранения и других ведомств.

1.2. Мероприятия по обеспечению противоэпидемической готовности
санитарно-эпидемиологических и лечебно-профилактических учреждений

 

Мероприятия по обеспечению противоэпидемической готовности учреждений представляются в соответствующем разделе комплексного плана противохолерных мероприятий и должны предусматривать:

1.2.1. Формирование противоэпидемической службы очага в составе:

- группы учета и информации о противохолерных мероприятиях;

- групп эпидемиологического обследования выявленных очагов холеры;

- дезинфекционных бригад;

- групп отбора проб материала от людей для лабораторного исследования;

- групп отбора проб из объектов окружающей среды для лабораторного исследования;

- бактериологических лабораторий;

- группы контроля за обеспечением режима безопасности работы в холерном и провизорном госпиталях, изоляторе, бактериологических лабораториях и других медицинских учреждениях, независимо от их ведомственной принадлежности;

- группа эпидемиологического анализа;

- консультантов-эпидемиологов и бактериологов.

1.2.2. Формирование профилактической службы (групп) очага (самостоятельно или в составе противоэпидемической службы) в составе:

- группы надзора за коммунальными объектами;

- группы надзора за предприятиями общественного питания, торговли пищевыми продуктами и другими объектами;

- группы надзора за детскими и подростковыми учреждениями;

- группы надзора за промышленными и другими объектами.

1.2.3. Формирование лечебно-профилактической службы в составе:

- госпитальной базы - холерный стационар с бактериологической лабораторией, провизорный стационар, изолятор для госпитализации общавшихся с больными холерой и вибриононосителями;

- групп учета и информации о лечебно-профилактических, противохолерных мероприятиях;

- группы эвакуации больных холерой, вибриононосителей и контактных с ними;

- групп подворных обходов;

- патолого-анатомической группы;

- консультантов-инфекционистов.

1.2.4. Формирование административно-хозяйственной службы.

1.2.5. Определение мощности стационаров с учетом типа территории по эпидемическим проявлениям холеры, укомплектование кадрами, материально-техническим оснащением, обеспечение резерва средств патогенетической, этиотропной терапии и дезсредств.

1.2.6. Паспортизацию холерного, провизорного стационаров и изолятора (приложение 1.2).

1.2.7. Формирование лабораторной базы с определением ее мощности, обеспечение кадрами (приложение 1.3), необходимым оборудованием и средствами диагностики (приложение 1.4), перераспределение анализов на другие инфекции при перепрофилировании бактериологических лабораторий, составление схем перепрофилирования.

1.2.8. Централизованное обеспечение бактериологических лабораторий питательными средами и другими средствами для диагностики.

1.2.9. Создание областного (республиканского) резерва кадров врачей, лаборантов, помощников эпидемиологов и определение резерва из числа медицинских и немедицинских работников для участия в проведении противохолерных мероприятий на территориях I и II типа.

1.2.10. Определение порядка и обеспечение охраны спецстационаров и бактериологических лабораторий учреждениями МВД.

1.2.11. Определение источников пополнения и расчет автотранспорта для работы в очаге холеры.

1.2.12. Обеспечение противоэпидемической готовности других лечебно-профилактических учреждений - поликлиник, станций и пунктов скорой медицинской помощи, прозектур городских и районных больниц и судебно-медицинских экспертиз; психоневрологических стационаров и диспансеров.

1.2.13. Обеспечение противоэпидемической готовности учреждений Госкомсанэпиднадзора России, в том числе региональных на воздушном и водном транспортах, МВД, МПС, санаторно-курортных учреждений, ВАО "Интурист", а также учреждений и объектов повышенной эпидемической опасности в системе МВД и транспортного обеспечения.

1.2.14. Организация и обеспечение взаимодействия территориальных органов управления учреждений здравоохранения, госкомсанэпиднадзора и ведомственных учреждений на случай возникновения эпидемических осложнений по холере.

1.3. Подготовка кадров

 

1.3.1. На территории всей страны проводится теоретическая и практическая подготовка по холере медицинских работников центров госсанэпиднадзора, общемедицинской сети и ведомственных медицинских служб на курсах специализации по особо опасным инфекциям, семинарах и рабочих местах:

- заместителей главных врачей медицинских учреждений, заведующих врачебными участками и фельдшерско-акушерскими пунктами;

- врачей-инфекционистов, терапевтов и других специалистов, приписанных к стационарам специального назначения (холерный, провизорный стационары, изолятор-обсерватор);

- эпидемиологов, бактериологов, дезинфекционистов;

- врачей станций (пунктов) скорой медицинской помощи, патологоанатомов и судебно-медицинских экспертов;

- прозектур больниц и судебно-медицинских моргов;

- медицинских работников психоневрологических стационаров, центров социальной реабилитации и других учреждений;

1.3.2. На территории всей страны проводится на семинарах подготовка:

- немедицинских работников гражданской авиации, железнодорожного транспорта, речного и морского флота (бортпроводников, проводников, командиров экипажей, помощников капитанов и др.), МВД, ВАО, "Интурист", других работников туристических агентств, осуществляющих сопровождение групп за границу, гостиниц, санаторно-курортных учреждений;

- немедицинских работников, привлекаемых к работе в стационарах специального назначения и в бактериологических лабораториях.

1.3.3. Тренировочные учения и практические занятия для всех категорий обучаемых проводят ежегодно с отработкой функциональных обязанностей и практических навыков на случай выявления больного с подозрением на холеру.

1.4. Эпидемиологический надзор

 

1.4.1. Эпидемиологический надзор за холерой предусматривает систему мер, направленных на предотвращение заноса инфекции, своевременное выявление больных холерой и вибриононосителей, обнаружение холерных вибрионов в объектах окружающей среды, информационное обеспечение, выяснение факторов, определяющих развитие эпидпроцесса, выработку обоснованных рекомендаций к планированию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий с целью локализации и ликвидации возникших очагов холеры и с оценкой эффективности проводимых мероприятий.

1.4.2. Эпидемиологический надзор осуществляют учреждения Госкомсанэпиднадзора России и Минздравмедпрома России на территории всей страны дифференцированно с учетом типов эпидемических проявлений холеры.

1.4.3. При эпидемиологическом надзоре на территории всей страны осуществляется:

1) информационное обеспечение в следующем порядке:

- Госкомсанэпиднадзор России, Минздравмедпром России сообщает об эпидемической обстановке по холере на территории страны центрам госсанэпиднадзора субъектов Российской Федерации, региональным на воздушном и водном транспорте, противочумным учреждениям, органам управления здравоохранения субъектов Российской Федерации, ведомственным медицинским службам;

- Противочумный центр Госкомсанэпиднадзора России информирует учреждения Госкомсанэпиднадзора и Минздравмедпрома Российской Федерации о заболеваемости холерой за рубежом;

- Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт совместно с противочумным центром Госкомсанэпиднадзора России ежегодно сообщают о свойствах культур холерных вибрионов 01 и 0139, выделенных из объектов окружающей среды и от людей на территории Российской Федерации и стран СНГ, центрам Госкомсанэпиднадзора субъектов Российской Федерации, противочумным институтам и станциям, учреждениям Минздравмедпрома субъектов Российской Федерации и ведомственным медицинским службам;

- информацию о каждом случае заболевания холерой или вибриононосительства, выделения холерных вибрионов 01 и 0139 из объектов окружающей среды на подконтрольной территории руководители центров госсанэпиднадзора субъектов Российской Федерации, региональных центров на воздушном и водном транспорте, органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации передают в Госкомсанэпиднадзор России, Минздравмедпром России и Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт.

2) Ретроспективный (за год) и оперативный анализ данных о случаях завоза холеры на подконтрольной административной территории, об инфицированности холерой (больные холерой и вибриононосители) и выделении холерных вибрионов из объектов окружающей среды, заболеваемости острыми кишечными инфекциями установленной и неустановленной этиологии во взаимосвязи с социально-экономическими, климато-географическими, метеорологическими и санитарно-гигиеническими условиями, состоянием всех видов водоснабжения, водопользования и канализования населенных мест с целью установления ведущих путей и факторов передачи возбудителей, условий, способствующих распространению инфекции, обоснования противохолерных мероприятий - учреждениями санитарно-эпидемиологической службы.

3) Комплексная эпидемиологическая оценка санитарно-гигиенических условий населенного пункта в соответствии с "Методическими указаниями по эпидемиологической оценке санитарно-гигиенических условий в целях профилактики кишечных инфекций N 28-6/20 от 06.06.86 г. - учреждениями санитарно-эпидемиологической службы.

4) Бактериологическое обследование на холеру на территории всей страны:

- больных с диареей и рвотой при тяжелом течении болезни;

- граждан Российской Федерации, заболевших острыми кишечными инфекциями в течение 5 дней после прибытия из неблагополучных по холере стран и административных территорий России, а также имевших понос и рвоту в пути следования;

- иностранных граждан, заболевших острыми кишечными инфекциями в течение 5 дней после прибытия из неблагополучных по холере стран, находящихся на стационарном лечении, и при обращении за медицинской помощью по поводу указанного заболевания (при их согласии);

- лиц без гражданства, ищущих убежища (иммигрантов) на территории Российской Федерации (по клиническим и эпидемиологическим показаниям). Бактериологическое обследование на холеру перечисленных контингентов осуществляется трехкратно (с интервалом 3-6 часов), до начала лечения антибиотиками.

1.4.4. На территориях, относящихся к I и II типам, кроме комплекса мероприятий, указанных в п.1.4.3, осуществляется бактериологическое обследование на холеру больных острыми кишечными инфекциями в стационарах, пунктах оральной регидратации и оставленных на дому; лиц с дисфункцией кишечника, при поступлении их в центры социальной реабилитации, учреждения спецрежима, в психоневрологические стационары и диспансеры, в места временного содержания при постах иммиграционного контроля и центрах временного размещения иностранных граждан и лиц, ищущих убежища на территории России - однократно.

1.4.5. При осуществлении эпидемиологического надзора за холерой на территориях, относящихся к III типу, кроме комплекса мероприятий указанных в п.1.4.3, проводится бактериологическое обследование на холеру больных острыми кишечными инфекциями в стационарах, пунктах оральной регадратации и оставленных на дому; лиц с дисфункцией кишечника при поступлении их в центры социальной реабилитации, учреждения спецрежима, в психоневрологические стационары и диспансеры, в места временного содержания при постах иммиграционного контроля и центрах временного размещения иностранных граждан и лиц, ищущих убежища на территории России - при выделении из поверхностных водоемов вирулентных, токсигенных штаммов холерных вибрионов - однократно, а по эпидпоказаниям (при наличии риска инфицирования) - троекратно.

Сроки (сезон года) бактериологического обследования на холеру людей определяются приказами Госкомсанэпиднадзора России и Минздравмедпрома России. При изменении эпидемической обстановки, в том числе на прилегающих административных территориях, они могут уточняться республиканскими, краевыми и областными центрами госсанэпиднадзора и органами управления здравоохранения.

1.4.6. Бактериологическое исследование на холеру материала от умерших, причиной смерти которых явились острые кишечные инфекции неустановленной этиологии, осуществляется на территориях - с учетом эпидобстановки и данных эпидобследования.

1.4.7. Бактериологическое исследование на холеру объектов окружающей среды на территории страны осуществляется дифференцировано, с учетом типов территорий.

1.4.8. Бактериологическое исследование на наличие холерных вибрионов воды поверхностных водоемов осуществляется на территориях I и II типов в точках, указанных в п.1.4.10, на территориях III типа - определяются точки забора с учетом эпидемиологических и санитарно-гигиенических показаний.

1.4.9. Количество точек отбора проб воды для бактериологического исследования на наличие холерных вибрионов определяется для каждого поверхностного водоема территориальным (городским, районным) центром госсанэпиднадзора. При выборе точек учитывается народнохозяйственное назначение водоема, характер водопользования, количество и места сброса в водоем сточных вод и степень их очистки, результаты санитарно-бактериологических исследований воды, гидрологическая характеристика (преимущественно мелководные, застойные участки водоема), а также эпидемическая обстановка по холере. Особое внимание при выборе точек отбора проб обращается на водоемы, берущие начало из сопредельных стран и административных территорий, неблагополучных по холере. Точки забора проб воды утверждаются республиканскими, краевыми и областными центрами госсанэпиднадзора и согласовываются с территориальными противочумными учреждениями.

1.4.10. Обязательному бактериологическому исследованию подлежит вода поверхностных водоемов:

- в зонах санитарной охраны водозабора для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения;

- в местах сброса хозяйственно-бытовых сточных вод независимо от степени их очистки;

- в местах организованного рекреационного водопользования.

1.4.11. На стационарные точки забора проб воды из поверхностных водоемов специалистами территориального центра госсанэпиднадзора составляется паспорт (приложение 1.5). В местах отбора проб воды из поверхностных водоемов осуществляются физико-химические и санитарно-бактериологические исследования в сроки, предусмотренные действующими нормативно-директивными документами.

1.4.12. Сроки и кратность бактериологического исследования на холеру воды поверхностных водоемов устанавливаются с учетом типа территории и определяются приказами Госкомсанэпиднадзора России и Минздравмедпрома России.

1.4.13. Вода для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, хозяйственно-бытовые сточные воды, сточные воды инфекционных стационаров, аэропортов, железнодорожных вокзалов, морских и речных портов, гостиниц, рынков и других объектов, содержимое неканализованных туалетов исследуется по эпидпоказаниям (выявление больных холерой или вибриононосителей на контролируемой территории, при угрозе заноса инфекции, при обнаружении холерных вибрионов 01 и О139 в воде поверхностных водоемов, в местах сброса сточных вод).

1.4.14. Все выделенные из объектов окружающей среды штаммы холерных вибрионов подлежат идентификации, в том числе определению вирулентности, токсигенности. Результаты изучения вирулентности являются основанием для осуществления мероприятий, перечисленных в разделе 1.5.

1.4.15. Результаты эпидемиологического надзора являются основанием для внесения корректив в комплексные планы, направленносгь и объем противохолерных мероприятий.

1.4.16. Среди населения осуществляется санитарно-просветительная работа.

1.5. Мероприятия при выделении холерных вибрионов 01 и 0139
из объектов окружающей среды

 

1.5.1. При выделении вирулентных, токсигенных штаммов холерных вибрионов из поверхностных водоемов, а также до установления вирулентности, токсигенности выделенных культур:

- вводятся ограничительные мероприятия на водопользование поверхностными водоемами в местах, определяемых территориальными органами госсанэпиднадзора;

- увеличивается количество точек забора проб воды поверхностных водоемов и исследования на холеру проводятся ежедневно;

- проводится эпидемиологическое обследование с целью установления источников контаминации поверхностных водоемов;

- осуществляется бактериологическое обследование на холеру больных острыми кишечными инфекциями, поступающих в стационары, на территориях I и II типов - троекратно, III типа - однократно.

1.5.2. При выделении вирулентных, токсигенных штаммов холерных вибрионов из хозяйственно-бытовых сточных вод:

- вводятся ограничительные мероприятия на водопользование поверхностными водоемами в местах сброса сточных вод, из которых выделены холерные вибрионы;

- увеличивается количество точек забора проб поды поверхностных водоемов и проводится их ежедневное исследование ниже сброса сточных вод;

- проводится эпидемиологическое обследование с целью установления источников контаминации сточных вод;

- осуществляется бактериологическое обследование на холеру больных острыми кишечными инфекциями, поступающих в стационары (с учетом данных эпидрасследования) - троекратно;

- мероприятия отменяются после трех последовательно отрицательных результатов анализа.

1.5.3. При выделении слабо- и авирулентных, атоксигенных штаммов холерных вибрионов, мероприятия, указанные в пп.1.5.1 и 1.5.2, отменяются.

2. Противоэпидемические мероприятия

 

2.1. Организационные мероприятия

 

2.1.1. О возникновении очага холеры объявляется решением территориальной (республиканской, краевой, областной, автономной, районной, городской, региональной, на транспорте (водном и воздушном) санитарно-противоэпидемической комиссии (Комиссия) по представлению территориального центра госсанэпиднадзора при регистрации первых случаев заболевания холерой (вибриононосительства) местного и завозного происхождения, независимо от вирулентности, токсигенности выделенных культур холерных вибрионов 01 и 0139.

2.1.2. Комиссия организует и осуществляет общее руководство за проведением комплекса противоэпидемических мероприятий, направленных на локализацию и ликвидацию очага холеры. Медицинский штаб, образуемый при СПК в очаге холеры, осуществляет контроль за выполнением противохолерных мероприятий.

2.1.3. Границы очага холеры определяются территориальным центром госсанэпиднадзора на основании результатов эпидемиологического обследования с учетом выявленных путей распространения и факторов передачи возбудителя инфекции и утверждаются территориальной Комиссией.

2.1.4. Локализация и ликвидация очага холеры проводится по оперативному плану противоэпидемических мероприятий, разрабатываемому медицинским штабом и утверждаемому территориальной Комиссией.

2.1.5. В зависимости от сложности эпидемической обстановки (масштабов и характера очага, социально-экономических и других условий) и необходимости при этом усиления территориальной санитарно-эпидемиологической службы Решением Госкомсанэпиднадзора России в очаг холеры могут направляться специализированные противоэпидемические бригады (СПЭБ), профильные (эпидемические и бактериологические) группы, формируемые на базе противочумных учреждений, а также специалисты лечебно-профилактических, противочумных учреждений и региональных центров Госкомсанэпиднадзора.

2.2. Комплекс противоэпидемических мероприятий,
проводимых в зависимости от вирулентности, токсигенности
выделенных культур холерных вибрионов 01 и 0139

 

2.2.1. При выделении от больных холерой и вибриононосителей вирулентных, токсигенных штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 проводится:

- госпитализация больных холерой, а также вибриононосителей в холерный госпиталь;

- госпитализация больных с тяжелым обезвоживанием в результате острой водянистой диареи в любой возрастной группе в населенном пункте, где холеру ранее не регистрировали, или - с острой водянистой диареей в любой возрастной группе в населенном пункте, где наблюдается вспышка холеры - в холерный госпиталь;

- эпидемиологическое обследование каждого случая холеры и вибриононосительства;

- выявление, изоляция или медицинское наблюдение, трехкратное бактериологическое обследование на холеру и превентивное лечение (по эпидпоказаниям) контактных с больными холерой (вибриононосителями) и лиц, находившихся в одинаковых условиях по риску инфицирования;

- активное выявление, госпитализация в провизорный госпиталь с трехкратным бактериологическим обследованием на холеру всех больных с дисфункцией кишечника и рвотой;

- вскрытие умерших от острых кишечных инфекций с бактериологическим исследованием на холеру;

- оперативный эпидемиологический анализ заболеваемости холерой;

- заключительная дезинфекция в очаге холеры (на дому, по месту работы, учебы и других мест пребывания больного или вибриононосителя);

- увеличение объема бактериологических исследований на холеру объектов окружающей среды;

- введение ограничительных и карантинно-обсервационных мероприятий в зависимости от конкретной эпидемической обстановки;

- усиление санитарного надзора за коммунальными объектами, предприятиями и учреждениями общественного питания, пищевой промышленности и торговли пищевыми продуктами, детскими дошкольными, подростковыми и другими эпидемиологически важными объектами.

2.2.2. При выделении от больных холерой и вибриононосителей слабо- и авирулентных, атоксигенных штаммов холерных вибрионов проводится:

- госпитализация больных холерой и вибриононосителей в холерный госпиталь;

- эпидемиологическое обследование каждого случая холеры и вибриононосительства;

- выявление, однократное бактериологическое обследование и медицинское наблюдение за контактными по месту жительства, работы или учебы;

- изоляция, трехкратное бактериологическое обследование на холеру и превентивное лечение контактных с больными или вибриононосителями, работающих на предприятиях общественного питания, пищевой промышленности, торговли продовольственными товарами и других эпидемиологически важных объектах;

- однократное бактериологическое обследование на холеру больных острыми кишечными инфекциями, поступающих в провизорный госпиталь;

- заключительная дезинфекция в очагах;

- другие профилактические и противоэпидемические мероприятия проводятся в зависимости от эпидемической обстановки по решению территориальной санитарно-противоэпидемической комиссии.

До получения результатов определения вирулентности, токсигенности проводится комплекс противоэпидемических мероприятий, предусмотренных при выделении вирулентных штаммов холерных вибрионов (п.2.2.1).

2.2.3. О каждом случае заболевания холерой или вибриононосительства независимо от вирулентности, токсигенности выделенных культур холерных вибрионов, смертельных исходах немедленно представляется информация в группы учета и информации противоэпидемической и лечебно-профилактической служб территориального (районного, городского, областного, республиканского) медицинского штаба очага. При этом передаются данные о числе больных и вибриононосителей, выявленных за истекшие сутки (на определенный час), а также о числе больных и вибриононосителей от момента регистрации первых случаев заболеваний холерой и вибриононосительства с нарастающим итогом. Далее информация передается по схеме оповещения и в соответствии с п.1.4.3, подпункт 1, дефис - 4.

2.3. Госпитализация больных холерой,
вибриононосителей и изоляция контактных с ними лиц

 

2.3.1. Госпитализацию в стационар больных холерой и вибриононосителей обеспечивают дезинфекционные станции или станции скорой медицинской помощи на автотранспорте этих учреждений бригадами эвакуаторов в составе врача или среднего медицинского работника, санитара, знакомых с мерами безопасности, и шофера.

2.3.2. Больных холерой с обезвоживанием III и IV степени госпитализируют реанимационные бригады на транспорте с регидратационными системами и растворами для пероральной регидратации.

2.3.3. Транспорт для госпитализации больных холерой оснащают подкладной клеенкой, посудой для сбора выделений больного, дезинфицирующими растворами в рабочем разведении, ветошью и гидропультом. Во время транспортировки больных в случае необходимости проводят текущую дезинфекцию транспортного средства.

2.3.4. Лиц, контактировавших с больным холерой (вибриононосителем), направляют в изолятор в сопровождении среднего медицинского работника на транспорте дезинфекционной станции или станции скорой медицинской помощи.

2.3.5. Персонал бригад эвакуаторов должен быть одет в противочумный костюм IV типа (пижама, противочумный или хирургический халат, шапочка или малая косынка, носки и тапочки), кроме того, необходимо предусмотреть хирургические перчатки, клеенчатый фартук, ватно-марлевая маска (на случай рвоты у госпитализируемого).

2.3.6. После госпитализации больных или вибриононосителей и изоляции контактных транспорт и предметы, используемые при транспортировке, обеззараживают силами бригады эвакуаторов на территории больницы на специально оборудованной площадке. Для обработки транспорта выделяют инвентарь (гидропульт или автомакс, а также ветошь и тару для раздельной обработки пола, стен, носилок, предметов ухода).

2.3.7. Персонал, сопровождавший больного после окончания каждого рейса обязан продезинфицировать обувь, руки (в перчатках) и полиэтиленовые (клеенчатые) фартуки. Все члены бригады после смены проходят санитарную обработку.

2.4. Эпидемиологическое обследование

 

2.4.1. Эпидемиологическому обследованию подлежит каждый случай заболевания холерой или вибриононосительства по месту жительства, работы, учебы и других мест пребывания больного (вибриононосителя). Его осуществляют группы эпидемиологического обследования из территориального центра госсанэпиднадзора в составе врача-эпидемиолога и его помощника. При необходимости (с учетом конкретной эпидемической обстановки) к проведению эпидемиологического обследования привлекают врачей по санитарному надзору за коммунальными пищевыми и другими объектами.

2.4.2. Обследование проводится с целью установления источника инфекции, конкретных мест и условий заражения больного или вибриононосителя, выявления контактировавших с ними лиц, а также возможных путей и факторов распространения возбудителя холеры, определения границ очага и объема противоэпидемических мероприятий.

2.4.3. Для достижения целей, перечисленных в п.2.4.2, эпидемиологическое обследование включает: оценку эпидемической ситуации по материалам планового эпидемиологического надзора за холерой и другими кишечными инфекциями; эпидемиологическую оценку эпидемической ситуации по материалам планового эпидемиологического надзора за холерой и другими кишечными инфекциями; эпидемиологическую оценку санитарно-гигиенических условий хозяйственно-питьевого, культурно-бытового водопользования и канализования; социально-экономические условия и миграционные процессы; выяснение обычаев населения; определение наиболее эпидемически опасных участков и объектов риска в пределах очага, а также групп населения, подверженных высокому риску инфицирования и подлежащих медицинскому наблюдению (проживающие вблизи водоемов, контаминированных холерными вибрионами, страдающие анацидными и гипоцидными гастритами, перенесшие резекцию желудка, злоупотребляющие алкоголем, лица без определенных занятий, бомжи), а также проживающие в местах вынужденного размещения.

2.4.4.

При проведении эпидемиологического обследования группа:

- собирает эпидемиологический анамнез;

- проводит отбор проб (продукты, вода, смывы с предметов обихода, содержимое неканализованных туалетов и т.п.), необходимых для бактериологического исследования;

- составляет список лиц, контактировавших с больным или вибриононосителем и находившихся в одинаковых с ними условиях по риску инфицирования, и составляет заключение о том, кто из них нуждается в изоляции, а кто - в медицинском наблюдении;

- выявляет лиц, контактировавших с больным холерой или вибриононосителем, выбывших из очага до начала эпидобследовання с целью направления экстренных извещений в центры госсанэпиднадзора города (района), куда выехали эти лица;

- намечает объем и очередность других противоэпидемических мероприятий с учетом результатов эпидемиологического обследования и определения вирулентности холерных вибрионов, выделенных в очаге;

- дополняет данные эпидобследования сведениями, полученными от госпитализированного больного (вибриононосителя), из истории болезни и амбулаторных карт;

- дает рекомендации главным врачам поликлиник, поликлинических отделений, врачебных амбулаторий, амбулаторий медико-санитарных пунктов предприятий, ФАПов, участковых больниц о порядке медицинского наблюдения за соответствующими контингентами.

2.4.5. По результатам эпидемиологического обследования эпидемиолог заполняет карту эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания, пополненную следующими данными;

- клинической формой и тяжестью заболевания;

- результатами бактериологических исследований на холеру испражнений, рвотных масс, желчи (с указанием дат и часов забора материала);

- выезжал ли больной (вибриононоситель) в течение последних пяти дней (когда, куда);

- кто, когда, откуда приезжал к больному (вибриононоситель) в течение последних пяти дней;

- выделением культур холерных вибрионов из объектов окружающей среды (откуда и когда выделены культуры, их серогруппа, фаговар, вирулентность);

- приемом антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов до госпитализации больного или вибриононосителя (когда, какие, длительность приема);

- имелись ли случаи аварий водопроводной сети, перебоев в подаче воды, нестандартных проб воды, на каком конкретном участке и когда;

- пользовался ли больной (вибриононоситель) водой поверхностного водоема на протяжении последних пяти дней (наименование водоема, место, когда, характер водопользования);

- количество изолированных и находящихся под медицинским наблюдением из числа контактировавших и находившихся в одинаковых условиях по риску инфицирования (по датам начала и окончания наблюдения);

- результатами бактериологического обследования контактировавших;

- сведениями о выезде больного.

2.5. Выявление больных холерой

 

2.5.1. Больные с дисфункцией кишечника и рвотой выявляются активно на всех этапах оказания медицинской помощи в организованных коллективах, на каждом предприятии и в учреждении, а также на наиболее эпидемически опасных участках и объектах риска, выявляемых в процессе эпидемиологического обследования в очаге холеры (см. п.2.4.3.) - путем ежедневных подворных обходов, осуществляемых силами территориальных медицинских объединений с привлечением санитарного актива, учащихся высших и средних медицинских учебных заведений.

2.5.2. При организации проведения подворных обходов врачебные участки разделяют на микроучастки с числом жителей до 500 (для сельской местности и районов индивидуальной застройки) и до 1000 человек (для участков с многоэтажной застройкой). За каждым участком закрепляется бригада в составе одной медицинской сестры и четырех-пяти санитарных активистов или студентов, которые наряду с выявлением больных, контролируют санитарное состояние жилых помещений и туалетов, проводят санитарно-просветительную работу.

2.5.3. Больные с дисфункцией кишечника и рвотой выявляются активно среди поступающих в приемники-распределители и учреждения спецрежима, пункты социальной реабилитации, в психоневрологические стационары и диспансеры, в места временного содержания при постах иммиграционного контроля и центрах временного размещения иностранных граждан и лиц, ищущих убежища на территории России, в субъектах Российской Федерации.

2.5.4. В организованных коллективах, учреждениях и на предприятиях медицинское наблюдение осуществляется путем ежедневного опроса работающих (учащихся и других) медицинскими работниками территориальных медицинских объединений и санитарным активом.

2.5.5. О каждом выявленном больном с дисфункцией кишечника и рвотой в установленном порядке сообщается на станцию скорой медицинской помощи или дезстанцию для госпитализации и представляется экстренное извещение в территориальный центр госсанэпиднадзора.

2.5.6. Сведения о результатах активного выявления больных ежедневно представляют в территориальную поликлинику, которая направляет сводные данные за сутки (на определенный час) по участкам в территориальное медицинское объединение, последнее - в головное. Головное территориальное медицинское объединение передает сведения также за сутки (на определенный час) в медицинский штаб в группу учета и информации.

2.6. Выявление вибрионосителей

 

2.6.1. Обязательному бактериологическому обследованию на вибриононосительство подлежат контактировавшие с больным холерой или вибриононосителем, независимо от того, изолированы они или оставлены на дому для медицинского наблюдения, а также лица, находившиеся с ними в одинаковых условиях по риску инфицирования.

2.6.2. Группы населения, в том числе профессиональные, подлежащие бактериологическому обследованию на холеру, и очередность их обследования, определяются в каждом конкретном случае территориальными центрами госсанэпиднадзора на основании результатов эпидемиологического обследования и анализа данных эпидемиологического надзора за холерой на территориях, где возникли ее очаги, и утверждаются медицинским штабом.

2.6.3. Организация и проведение бактериологического обследования перечисленных контингентов возлагаются на противоэпидемическую и лабораторную службы медицинского штаба.

2.7. Мероприятия в отношении лиц, контактировавших с
больными холерой и вибриононосителями

 

2.7.1. Показания к изоляции контактировавших определяются эпидемиологом с учетом степени контакта с больным (вибрнононосителем), уровня санитарного благоустройства жилищ и мест общего пользования, особенностей профессиональной деятельности и связанной с этим степени их эпидемической опасности.

2.7.2. На лиц, контактировавших с больным холерой и вибрнононосителем, составляют списки с указанием их адреса, места работы, учебы, времени, степени и характера контакта.

2.7.3. Изоляции подлежат лица, имевшие контакт с больным холерой (вибриононосителем) в бытовых условиях: члены семьи больного (вибриононосителя), проживающие в неудовлетворительных санитарно-гигиенических условиях, проживающие в одной коммунальной квартире (общежитии), пользующиеся общим туалетом, кухней и имеющие другие формы непосредственного постоянного контакта, а также лица, подвергавшиеся одинаковому с больным (вибриононосителем) риску инфицирования.

2.7.4. Обязательной изоляции подлежат контактировавшие с больным или вибриононосителем из числа декретированных контингентов.

2.7.5. Допускается оставление на дому одного из трудоспособных членов семьи, подлежащих изоляции, для ведения домашнего хозяйства.

2.7.6. За контактировавшими, которые не помещены в изолятор, устанавливают медицинское наблюдение по месту жительства, в условиях производства, учебы и т.п. в течение пяти суток с трехкратным (на протяжении первых суток наблюдения) бактериологическим обследованием на холеру при выделении от больных (вибриононосителей) вирулентных, токсигенных штаммов холерных вибрионов и однократным;

- при выделении авирулентных, атоксигенных штаммов холерных вибрионов и профилактическим лечением антибиотиками независимо от вирулентности, токсигенности выделенных в очаге штаммов холерных вибрионов.

2.8. Дезинфекционные мероприятия

 

2.8.1. Заключительную дезинфекцию по месту выявления больного (вибриононосителя) обеспечивает бригада дезинфекционистов дезинфекционной станции или отдела дезинфекции территориального центра госсанэпиднадзора.

2.8.2. Заключительную дезинфекцию выполняют по месту жительства не позднее трех часов с момента госпитализации (смерти) больного (вибриононосителя), а по месту работы или учебы - не позднее первых суток после выявления.

2.8.3. При обнаружении больного (вибриононосителя) по месту его работы (учебы) в обязательном порядке проводят обеззараживание в помещении, где находился больной (вибриононоситель) - непосредственно на его рабочем месте, а также в местах общего пользования - буфетах (столовых), душевых и санузлах.

2.8.4. В поликлиниках, амбулаториях, детских консультациях и других лечебно-профилактических учреждениях при обнаружении больного холерой или с подозрением на нее силами персонала этих учреждений проводят дезинфекцию испражнений и рвотных масс, кабинета врача и других помещений, где находился больной, мест общего пользования, спецодежды персонала, участвовавшего в приеме и осмотре больного, инструментария, использованного во время приема больного.

2.8.5. Персонал, осуществляющий дезинфекцию, должен быть одет в противочумный костюм II типа (пижама или комбинезон, носки, тапочки, большая косынка (капюшон), противочумный халат, ватно-марлевая маска, резиновые перчатки, сапоги, полотенце).

2.8.6. По окончании обработки очага бригада дезинфекционистов обязана продезинфицировать обувь, перчатки, резиновые (полиэтиленовые) фартуки, по окончании смены - пройти санобработку.

2.8.7. Перед развертыванием холерного и провизорного госпиталей и изолятора проводят профилактическую дезинфекцию в помещениях и на их территории.

2.8.8. В госпиталях текущую дезинфекцию проводит младший медицинский персонал под непосредственным руководством старшей медицинской сестры отделения. Маточные растворы дезинфицирующих средств готовят централизованно дезинфекторы стационара в специальном помещении.

2.8.9. В госпиталях (холерном и провизорном) проводят:

- санитарную обработку больного I-II степени дегидратации в приемно-сортировочном отделении (при этом душем не пользуются) с последующим обеззараживанием смывных вод и помещения;

- санитарную обработку больных III и IV степени дегидратации проводят в палате;

- вещи больного собирают в клеенчатый мешок и отправляют для обеззараживания в дезинфекционную камеру;

- помещение приемного отделения дезинфицируют после приема больного (вибриононосителя);

- больных (вибриононосителей) обеспечивают индивидуальными горшками или подкладными суднами;

- выделения больных (вибриононосителей) после обеззараживания в емкостях выливают в канализацию или выносят в специально подготовленную водонепроницаемую выгребную яму, а судна и горшки дополнительно обеззараживают погружением и дезинфицирующий раствор в специально выделенном помещении.

2.8.10. При дезинфекции остальных объектов соблюдается режим обеззараживания в соответствии с приложением 1.7.

2.8.11. При закрытии госпиталей и изолятора проводят заключительную дезинфекцию с обязательным бактериологическим контролем ее качества.

2.8.12. Вскрытие, транспортировку и захоронение трупов проводят в соответствии с санитарными правилами "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности", СП 1.2.011-94.

2.8.13. Профилактическую дезинфекцию по показаниям (обеззараживание санитарно-дворовых установок), противомушиные мероприятия в населенных пунктах в период вспышки холеры проводят соответствующие подразделения дезинфекционной и ветеринарной служб.

2.8.14. В сельской местности, включая полевые станы, организация дезинфекционных мероприятий осуществляется так же, как и в условиях города. В случае оставления лиц, контактировавших с больным холерой на дому, после проведения заключительной дезинфекции на период изоляции проводят текущую дезинфекцию их силами.

2.8.15. Методическое руководство за организацией и проведением дезинфекционных мероприятий, а также контроль за качеством дезинфекции осуществляют специалисты дезинфекционных станций и территориальных центров госсанэпиднадзора.

2.8.16. Средства и методы, используемые при дезинфекции, режим обеззараживания различных объектов, расчетные нормы дезинфектантов изложены в приложениях 1.6; 1.7; 1.8.

2.9. Бактериологическое исследование объектов
окружающей среды

 

2.9.1. Обязательному бактериологическому исследованию подлежит вода поверхностных водоемов в местах сброса хозяйственно-бытовых сточных вод, в зонах санитарной охраны водозабора для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, в местах массового организованного рекреационного водопользования и других точках, определяемых по эпидпоказаниям.

2.9.2. Хозяйственно-бытовые сточные воды исследуются с учетом эпидемической обстановки и результатов санитарного надзора за коммунальными, в том числе ведомственными объектами.

2.9.3. Объекты исследования, число точек забора и кратность бактериологического исследования проб из объектов окружающей среды определяются решением медицинского штаба.

2.10. Ограничительные и карантинно-обсервационные
меры при возникновении очагов холеры

 

2.10.1. К ограничительным мерам относятся:

- запрещение водопользования поверхностными водоемами в местах, определяемых органами государственного санитарного надзора независимо от вирулентности, токсигенности выделенных культур холерных вибрионов;

- запрещение убытия на выезд из организованных коллективов (санаторно-курортные учреждения, туристические базы, кемпинги, лагеря труда и отдыха и т.д.) при выявлении в них больных холерой (вибриононосителей) и при угрозе распространения инфекции;

- запрещение размещения в населенных пунктах, особенно курортной зоны, неорганизованно отдыхающих при отсутствии надлежащих санитарно-гигиенических условий;

- запрещение массовых сборов населения при различных ритуальных обрядах (свадьба, похороны и др.);

- прекращение туристических поездок (экскурсионных, религиозных (паломничество) и т.п.), специальных мероприятий (ярмарок, конгрессов, фестивалей, спортивных состязаний и т.п.).

2.10.2. Перечисленные меры вводятся по представлению медицинского штаба решением (областной, краевой, республиканской) Комиссии.

2.10.3. Границы территории, на которой вводятся те или иные ограничительные меры, определяют исходя из конкретной эпидемической обстановки, возможных факторов передачи инфекции, санитарно-гигиенических условий, интенсивности миграции населения и транспортных связей с другими территориями.

2.10.4. В исключительных случаях - при интенсивном и широком распространении инфекции, выраженной миграции (экономическая, военная, туризм) населения, угрозе выноса холеры за пределы очага - санитарно-противоэпидемическая комиссия Правительства Российской Федерации по представлению территориальной (областной, краевой, республиканской) Комиссии определяет необходимость введения карантинно-обсервационных мероприятий в отдельных населенных пунктах и других административных территориях.

2.10.5. Карантинно-обсервационные мероприятия предусматривают комплекс административно-хозяйственных, ограничительных, лечебно-профилактических, противоэпидемических, санитарно-гигиенических мероприятий, направленных на предупреждение выноса холеры за пределы очага.

2.10.6. Обсервацией предусматривается пятидневная изоляция выезжающих, медицинское наблюдение за ними и однократное бактериологическое обследование на холеру в первые сутки пребывания в обсерваторе.

2.10.7. Определение очередности направления на обсервацию, организацию материального обеспечения обсерваторов и питания обсервируемых осуществляет территориальная (районная, городская) администрация.

2.10.8. Обсерваторы могут быть развернуты в приспособленных помещениях (административные здания, гостиницы, общежития, пионерские и спортивные лагеря, базы отдыха и т.п.).

2.10.9. В обсерваторе должны быть предусмотрены следующие помещения: приемная, палаты для размещения обсервируемых, комнаты для медицинского и обслуживающего персонала, для взятия материала, хранения личных вещей обсервируемых, буфетная и другие подсобные помещения.

2.10.10. Перед помещением в обсерватор обсервируемые проходят медицинский осмотр с целью выявления лиц с дисфункцией кишечника. В обсерватор допускаются только здоровые люди.

2.10.11. Заполнение обсерватора проводится одновременно. Обсервируемые размещаются небольшими группами с принятием мер к ограничению общения между ними.

2.10.12. Выявленные среди обсервируемых больные холерой или вибриононосители переводятся в холерный госпиталь, а лица, контактировавшие с ними, - в изолятор.

2.10.13. При выявлении в обсерваторе больного с дисфункцией кишечника он переводится в провизорный госпиталь. Контактировавшие с ним изолируются на месте до получения результата бактериологического исследования материала от заболевшего. В случае получения отрицательного результата срок обсервации не изменяется.

2.10.14. Лица, прошедшие обсервацию, получают справки и вывозятся за границу очага в условиях, исключающих возможность заражения.

2.10.15. После освобождения обсерватора проводится заключительная дезинфекция, затем возможно его дальнейшее использование.

2.10.16. Для работы в обсерваторе разрешается привлечение медицинских работников и другого вспомогательного персонала из числа обсервируемых.

2.10.17. Медицинский и обслуживающий персонал обсерватора находится на казарменном положении. С целью исключения контакта обсервируемых с населением очага обсерватор круглосуточно охраняется.

2.10.18. Функционально-должностные обязанности медицинского и другого обслуживающего персонала обсерватора, территориальных центров госсанэпиднадзора, служащих управления МВД, обеспечивающих охрану обсерваторов:

а) территориальные медицинские объединения обеспечивают:

- строгий противоэпидемический режим работы обсерватора;

- медицинское наблюдение за обсервируемыми в течение пяти суток;

- забор материала и доставку его в бактериологическую лабораторию территориального центра госсанэпиднадзора;

- оказание первой медицинской помощи соматическим больным и при необходимости дальнейшее направление их в соответствующее лечебно-профилактическое учреждение;

- активное выявление лиц с дисфункцией кишечника, изоляция и госпитализация их в провизорный госпиталь для дальнейшего лечения;

- госпитализацию выявленных вибриононосителей в холерный госпиталь и изоляцию лиц, контактировавших с ними для дополнительного пятидневного медицинского наблюдения и повторного лабораторного обследования;

- проведение текущей и заключительной дезинфекции;

- выдачу медицинской документации (справки) лицам, прошедшим обсервацию;

б) территориальные центры госсанэпиднадзора обеспечивают:

- контроль за соблюдением режима безопасности работы в обсерваторе;

- проведение бактериологических исследований на холеру;

- своевременную выдачу результатов лабораторных исследований;

- проведение заключительной дезинфекции при выявлении больных холерой или вибриононосителей после их госпитализации;

- контроль качества текущей и заключительной дезинфекции;

в) милицейские посты обеспечивают:

- охрану территории обсерватора с целью недопущения контакта с местным населением;

- запрещение самовольного ухода обсервируемых;

- строгий контроль за въездом и выездом обсервируемых, вывозом имущества отъезжающих.

2.10.19. При введении ограничительных и карантинно-обсервационных мероприятий в населенных пунктах или на отдельных объектах устанавливаются соответствующие указатели, посты силами органов внутренних дел и контрольно-пропускных пунктов для транспортных средств на всех магистралях.

2.11. Экстренная профилактика

 

2.11.1. Экстренной профилактике подвергаются контактировавшие с больным холерой (вибриононосителем) в семье, квартире, по месту работы, учебы, отдыха, лечения, а также лица, находившиеся в одинаковых условиях по риску инфицирования (по эпидпоказаниям).

2.11.2. Для экстренной профилактики с учетом антибиотикограммы циркулирующих в очаге штаммов назначают один из следующих препаратов:

 


Препараты
Разовая
доза в г.
Кратность
применения
в сутки
Средняя
суточная
доза, в г.
Продолжитель-
ность примене-
ния, днях
Тетрациклин 0,5-0,3 2-3 1,0 4
Доксициклин 0,1* 1-2 0,12 4
Левомицетин 0,5 4 2,0 4
Эритромицин 0,5 4 2,0 4
Ципрофлоксацин 0,5 2 1,0 4
Фуразолидон 0,1 4 0,4 4

 

------------------------------

* - В первые сутки - 0,2

 

Детям назначают:

 

     15-17 лет             3/4 дозы взрослых
     8-14 лет              1/2 дозы взрослых
     7 лет                 1/3 дозы взрослых
     5-6 лет               1/4 дозы взрослых
     4 года                1/6 дозы взрослых
     2-3 года              1/8 дозы взрослых
     1 год и младше        1/12 дозы взрослых

2.11.3. При выделении в очагах холеры штаммов холерных вибрионов, устойчивых к указанным препаратам, лечебно-профилактической и противоэпидемической службами медицинского штаба в каждом конкретном случае рассматривается вопрос о смене препарата.

2.12. Санитарно-гигиенические мероприятия в очаге холеры

 

2.12.1. Санитарно-гигиенические мероприятия в очаге холеры направлены на устранение выявленных и предполагаемых факторов передачи возбудителя инфекции и условий, способствующих дальнейшему распространению инфекции.

2.12.2. Санитарно-бактериологическое исследование (коли-индекс) в зоне санитарной охраны водозаборов для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения проводится ежедневно, а в разводящей сети - при аварийных ситуациях и по санитарно-эпидемиологичеcким показаниям. Физико-химические показатели воды из указанных объектов определяются не реже 2-х раз в месяц.

2.12.3. Санитарно-бактериологические исследования в зонах рекреации проводятся в местах, определяемых ГОСТом 17-1.5.02-80 "Гигиенические требования к зонам рекреации водных объектов" не реже одного раза в неделю в период купального сезона, а физико-химические исследования - не реже одного раза в месяц.

2.12.4. Профилактическая служба медицинского штаба обеспечивает санитарный надзор за:

- санитарно-бактериологическими показателями водопроводной воды перед поступлением в разводящую сеть и питьевой воды в нецентрализованных источниках водоснабжения;

- содержанием остаточного хлора в отдаленных и тупиковых точках водопроводов, количество которого должно быть не менее 0,3-0,5 мг/л по свободному хлору или 0,8-1,2 мг/л по связанному хлору;

- качеством очистки и обеззараживания хозяйственно-бытовых сточных вод и санитарной очистки территории;

- санитарно-гигиеническим состоянием детских дошкольных учреждений, школ, летних оздоровительных учреждений для детей и подростков, домов отдыха, санаториев, пансионатов, кемпингов, домов для престарелых и инвалидов, рынков и предприятий коммунального хозяйства и другими объектами;

- соблюдением технологических и санитарных норм и правил, включая профилактическую дезинфекцию, на предприятиях пищевой промышленности, общественного питания и торговли пищевыми продуктами с использованием санитарно-бактериологических методов исследования;

- за рыночной и уличной торговлей продуктами питания с запретом розничной торговли продуктами, употребляемыми в пищу без термической обработки, различными напитками (пиво, квас и другие) без герметической упаковки;

- санитарно-гигиеническим состоянием железнодорожных вокзалов, пассажирских поездов, стоянок туристических поездов, аэровокзалов, речных, морских и автодорожных вокзалов, а также объектов общественного питания на транспорте;

- сливом фановых вод из речных и морских судов, определяемых территориальными центрами госсанэпиднадзора;

- санитарным состоянием и профилактической дезинфекцией туалетов общественного пользования, особенно в местах массового скопления людей.

2.12.5. Проводится санитарно-просветительная работа среди населения по профилактике холеры и других острых кишечных инфекций с использованием всех форм и методов санитарного просвещения.

2.13. Обеззараживание сточных вод в очаге холеры

 

2.13.1. В очагах холеры все хозяйственно-бытовые сточные воды, а также сточные воды отдельных предприятий и учреждений, в том числе стоки холерных стационаров подлежат обеззараживанию перед отведением в наружную канализацию, определяют территориальные центры госсанэпиднадзора и коммунального хозяйства с учетом сложившейся эпидемической обстановки.

2.13.2. Для обеззараживания сточных вод применяют химические (хлорирование, подкисление, хлорирование с подкислнением) методы дезинфекции.

2.13.3. Из дезинфицирующих средств используют препараты, включенные в приложение 1.6.

2.13.4. Сточные воды обеззараживают в контактных резервуарах (отстойниках), а при их отсутствии - непосредственно в канализационных коллекторах. Режим обеззараживания определяют в зависимости от происхождения сточных вод, степени их очистки и возможной продолжительности контакта с дезинфицирующими веществами.

2.13.5. Обеззараживание городских сточных вод и сточных вод холерного и провизорного госпиталей, изолятора, прошедших полную биологическую очистку, проводят путем хлорирования с таким расчетом, чтобы концентрация остаточного хлора составляла 1,5 мг/л после 30 мин. контакта, а коли-индекс в сбрасываемой воде не превышал 1000.

В случае ограничения времени контакта биологически очищенных сточных вод с дезинфицирующими веществами до 15 мин., следует проводить хлорирование с одновременным подкислением обеззараживаемой жидкости до рН 5,5-6,0 с таким расчетом, чтобы концентрация остаточного хлора составляла 1,0 мг/л, а коли-индекс в сбрасываемой воде не превышал 3000 (замкнутые канализационные системы).

2.13.6. Обеззараживание городских сточных вод и сточных вод холерных стационаров, прошедших только механическую очистку проводят путем хлорирования с таким расчетом, чтобы концентрация остаточного хлора составляла 4,5 мг/л, а коли-индекс в сбрасываемой воде не превышал 3000.

В отдельных случаях по согласованию с органами государственного санитарного надзора для обеззараживания механически очищенных сточных вод путем хлорирования допускается уменьшение концентрации остаточного хлора до 2,5 мг/л после контакта 30 мин. или 3,5 мг/л при времени контакта 15 мин. При одновременном подкислении сточных вод концентрацию остаточного хлора следует уменьшать до 1,5-2,0 мг/л при времени контакта 30-15 мин. Коли-индекс в сбрасываемой воде не должен превышать 10000.

2.13.7. Обеззараживание сточных вод банно-прачечных учреждений проводят путем хлорирования с таким расчетом, чтобы концентрация остаточного хлора составляла 5,0 мг/л после 15 мин. контакта, а коли-индекс в сбрасываемой воде не превышал 10000.

2.14. Эпидемиологический анализ и оценка
эффективности противоэпидемических мероприятий

 

2.14.1. Эпидемиологический анализ в очаге холеры осуществляется от момента его возникновения до полной ликвидации.

2.14.2. Эпидемиологический анализ проводят с целью выяснения возможных путей завоза холеры в населенный пункт, причин и условий, способствующих возникновению местных случаев, установления действующих путей и факторов передачи возбудителя инфекции, а также для обоснования тактики и объема противоэпидемических мероприятий, направленных на локализацию и ликвидацию очага, и оценки их эффективности.

2.14.3. Эпидемиологический анализ осуществляет группа специалистов во взаимодействии с группой учета и информации об эпидемической обстановке и противохолерных мероприятиях при медицинском штабе.

2.14.4. Для эпидемиологического анализа необходимы следующие данные:

- географическое расположение, природно-климатические и метеорологические условия административной территории;

- демографическая характеристика населенного пункта;

- миграция населения: туризм (экскурсионный, курортный, рекреационный, деловой, религиозный (паломничество), посещение специальных мероприятий (ярмарки, конгрессы, спортивные состязания и другие), экономическая (миграция рабочих, служащих и других контингентов к месту работы (постоянной и временной), военная и политическая (беженцы, мигранты и др.); миграция по продолжительности: ежедневная (маятниковая), периодическая (включая сезонную);

- транспортные связи с территориями и странами, в первую очередь, неблагополучными по холере;

- социально-экономические условия;

- условия хозяйственно-питьевого водоснабжения, культурно-бытового водопользования (их оценка), канализования и санитарной очистки;

- инфицированность (число больных (со дня заболевания) и вибриононосителей (со дня забора материала) по дням вспышки (в абсолютных и относительных показателях на 10000, 100000 населения) для слежения за уровнем и динамикой эпидпроцесса;

- территориальное распределение случаев заболеваний холерой и вибриононосительства, выявление "территорий риска";

- возрастная структура больных и вибриононосителей по возрастным группам за каждый день вспышки в абсолютных и относительных показателях на 10000 и 100000 каждой возрастной группы; "группы риска";

- социальная (профессиональная) структура во взаимосвязи с возрастной "группы риска";

- распределение больных и вибриононосителей по полу;

- пути и факторы передачи возбудителя инфекции, удельный вес их ("факторы риска");

- очаговость холеры (семейная, производственная, в организованных коллективах и т.д.);

- тяжесть течения холеры;

- результаты исследования проб из объектов окружающей среды на холеру в очагах больных (вибриононосителей);

- результаты бактериологического исследования на холеру людей за период вспышки:

1) больных острыми кишечным инфекциями, из них госпитализированных в провизорный госпиталь, оставленных на дому;

2) больных с дисфункцией кишечника и рвотой, поступающих в приемники-распределители и учреждения спецрежима, в психоневрологические стационары и диспансеры, первичные пункты и стационарные центры приема беженцев и мигрантов;

3) результаты бактериологического обследования на вибриононосительство среди декретированных групп населения, выезжающих из очага и других "групп риска", определяемых в каждом конкретном очаге с учетом эпидситуации;

- результаты исследования проб из объектов окружающей среды (в соответствии с разделом 2.9) на холеру в населенном пункте;

- характеристика культур холерных вибрионов (серогруппа, биовар, вирулентность, токсигенность, чувствительность к антибиотикам), выделенных от людей и их объектов окружающей среды (в динамике);

- сравнительная характеристика холерных вибрионов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды;

- источники контаминации холерными вибрионами объектов окружающей среды;

- анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями в сравнении с состоянием ее за аналогичный период предшествующего года;

- сроки заключительной дезинфекции в очагах больных и вибриононосителей.

2.14.5. Для эпидемиологического анализа используются:

- карты эпидемиологического обследования очага больного холерой (вибриононосительства);

- истории болезни;

- данные о числе исследованных проб (вода, пища, смывы и другие объекты) в очаге больного (вибриононосителя) и в населенном пункте (в соответствии с разделом 2.9) и числе выделенных культур холерных вибрионов (по датам забора материала);

- число обследованных на холеру различных контингентов населения и количество выделенных культур холерных вибрионов;

- данные бактериологических исследований на холеру пищевых продуктов и других проб, исследуемых по эпидпоказаниям;

- результаты санитарно-бактериологических и физико-химических исследований воды источников (поверхностных и подземных) централизованного и нецентрализованного водоснабжения, воды хозяйственно-питьевых водопроводов, поверхностных водоемов, используемых в рекреационных целях, и сточных вод;

- материалы санитарно-эпидемиологического надзора за коммунальными объектами, предприятиями пищевой промышленности, общественного питания, торговли продовольственными товарами, местами массового отдыха, детскими дошкольными и подростковыми учреждениями, вокзалами (аэро- и железнодорожными, речными, морскими) и другими эпидемиологически важными объектами;

- данные по заключительной дезинфекции в очагах больных холерой и вибриононосителей;

- результаты проверок режима безопасности работы в госпиталях, изоляторе, обсерваторе, бактериологических лабораториях.

2.14.6. Оценка эффективности противоэпидемических мероприятий включает:

- своевременность госпитализации больных холерой (со дня заболевания, обращения и активного выявления);

- своевременность госпитализации вибриононосителей (со дня забора материала и со дня подтверждения культуры);

- своевременность проведения заключительной дезинфекции в очаге, результаты его контроля;

- результаты активного выявления больных холерой на этапах оказания медицинской помощи и при осуществлении подворных обходов (выявление больных с поносом и рвотой со дня заболевания);

- число выявленных больных холерой среди провизорно госпитализированных;

- предотвращение инфицирования холерой в холерном, провизорном госпиталях, изоляторе, обсерваторе, бактериологических лабораториях, на эвакотранспорте и в других медицинских учреждениях;

- результаты обследования на вибриононосительство различных групп населения;

- результативность бактериологических исследований на холеру, санитарно-бактериологических и других лабораторных исследований проб из объектов окружающей среды;

- полноту и объем мероприятий, направленных на механизм передачи возбудителя инфекции;

- эффективность экстренной профилактики;

- выполнение ограничительных и карантинно-обсервационных мероприятий;

- санитарно-просветительную работу.

2.14.7. Результаты эпидемиологического анализа оформляются в виде объяснительной записи с графиками, таблицами, картами, докладываются ежедневно в медицинский штаб и являются основанием для внесения соответствующих корректив в направленность, объем и организацию противоэпидемических мероприятий.

2.14.8. Очаг считается ликвидированным через 10 дней после госпитализации последнего больного (вибриононосителя) независимо от вирулентности, токсигенности выделенных штаммов холерных вибрионов и проведения заключительной дезинфекции в очаге. Холерные и провизорные госпитали, изоляторы продолжают работу до выписки последнего больного (вибриононосителя).

2.14.9. После ликвидации очага холеры медицинским штабом представляется в установленном порядке в Госкомсанэпиднадзор России и Минздравмедпром России заключительный отчет, в котором освещаются вопросы, указанные в пунктах 2.14.4, и 2.14.6.

3. Мероприятия в населенных пунктах после ликвидации
очага холеры

 

3.1. Мероприятия в отношении лиц, перенесших холеру
или вибриононосительство

 

3.1.1. Лиц, перенесших холеру или вибриононосительство, после выписки из стационаров допускают к работе (учебе), независимо от профессии и ставят на учет в территориальных центрах санэпиднадзора и кабинетах инфекционных заболеваний поликлиник по месту жительства; на каждого из них составляется карта (форма N 30а) и устанавливается диспансерное наблюдение сроком на 3 месяца.

3.1.2. Диспансерное наблюдение проводится кабинетом инфекционных заболеваний; при отсутствии кабинета наблюдение осуществляет участковый врач (терапевт, педиатр).

3.1.3. В первый месяц проводится бактериологическое исследование испражнений один раз в 10 дней. В дальнейшем испражнения исследуют один раз в месяц. Первый забор испражнений производится после дачи слабительного (сернокислая магнезия - 30 г для взрослых, детям - в соответствии с возрастом).

3.1.4. В случае выявления вибриононосительства у реконвалесцентов они госпитализируются для лечения в холерный госпиталь, после чего диспансерное наблюдение за ними возобновляется.

3.1.5. Лица, перенесшие холеру или вибриононосительство, снимаются с диспансерного учета при отсутствии выделения холерных вибрионов на протяжении срока диспансерного наблюдения. Снятие с учета осуществляется комиссионно главным врачом поликлиники, инфекционистом и эпидемиологом.

3.2. Профилактические мероприятия в населенных пунктах
после ликвидации очага холеры

 

3.2.1. Медицинский штаб на основании эпидемиологического анализа в очаге холеры разрабатывает на период после ликвидации очага комплекс мероприятий, направленных на устранение причин возможного возникновения эпидемических осложнений и оформляет их приказом руководителя территориального органа здравоохранения и центра госсанэпиднадзора. В комплексный план противохолерных мероприятий вносят соответствующие коррективы.

3.2.2. Территориальные центры госсанэпиднадзора:

- осуществляют эпидемиологический надзор за холерой в соответствии с приказом территориального центра госсанэпиднадзора и комплексным планом по осуществлению противохолерных мероприятий на период после ликвидации очага;

- обеспечивают постоянный надзор за эпидемиологически важными объектами (объектами риска);

- проводят ежемесячно эпидемиологическую оценку условий хозяйственно-питьевого водоснабжения населения, рекреационного водопользования, канализования населенного пункта;

- осуществляют усиленный контроль за эффективностью очистки и обеззараживания хозяйственно-бытовых сточных вод, санитарно-гигиеническим состоянием детских дошкольных, школьных, оздоровительных учреждений, психоневрологических стационаров, первичными пунктами и стационарными центрами приема беженцев и мигрантов, условиями размещения временных (сезонных) рабочих, санитарно-гигиеническими условиями на путях передвижения и в местах временного проживания работников отгонного животноводства.

3.2.3. Продолжается проведение санитарно-просветительной работы по профилактике холеры.

Патогенез, клиника и лечение

 

1. Патогенез

 

1.1. Холерные вибрионы проникают в организм человека через рот с инфицированной водой или пищей. Вероятность заражения и тяжесть течения холеры зависит от вирулентности вибрионов, заражающей дозы и восприимчивости организма. Заражающая доза вибрионов огромна и при эффективной барьерной функции желудка колеблется от 10 до 100 миллиардов микробных тел.

Возможность сохранения вибрионов в желудке и проникновение их в жизнеспособном состоянии в тонкий кишечник резко повышается при сопутствующих заболеваниях желудочно-кишечного тракта, сопровождаемых снижением кислотности желудочного сока, его неравномерной секрецией, ускоренной перистальтикой, в случае злоупотребления алкоголем, после перенесенной резекции желудка. Для таких пациентов заражающая доза вибрионов уменьшается в сто тысяч раз и составляет около 1 млн. микробных тел. Эти лица болеют холерой чаще и более тяжело. Ведущая роль желудочного барьера в защите от заражения холерой доказана в экспериментальных исследованиях на собаках и наблюдениях на добровольцах.

Проникнув в дистальные отделы тонкого кишечника, вибрионы прилипают (адгезируются) к слизистой оболочке, интенсивно размножаются, образуя холерный токсин. Холерный энтеротоксин (синонимы: экзототоксин, холероген) является причиной развития острой диареи, приводящей к дегидратации и нарушению баланса электролитов. В механизме возникновения диареи ведущая роль отводится гиперсекреции эпителиальных клеток крипт тонкого кишечника. Холероген вызывает активацию фермента аденилатциклазы, обусловливающую накопление циклического 3', 5' -аденозинмонофосфата, что приводит к гиперсекреции электролитов и воды. При этом всасывание ионов страдает в гораздо меньшей степени, хотя оно не в состоянии компенсировать чрезмерный объем секреции. Всасывание ионов натрия восстанавливается наиболее быстро, особенно в условиях приема глюкозы. Указанный патофизиологический механизм лежит в основе эффективности оральной терапии глюкозо-электролитными растворами.

Всасывание ионов калия и бикарбоната нарушается в значительно большей степени и восстанавливается медленно, что способствует развитию гипокалиемии и метаболического ацидоза. Поражение эпителия тонкого кишечника сопровождается изменениями в мембранах клеток, повышается активность некоторых групп простагландинов и других внутриклеточных медиаторов.

1.2. Для холеры характерны потери жидкости и электролитов с испражнениями и рвотными массами, которые в короткий срок достигают объемов, практически не встречающихся при других патологических состояниях.

В некоторых случаях объем теряемой жидкости (на фоне регидратационной терапии) может в два раза превышать массу тела больного. Дегидратация и дисбаланс электролитов, ацидоз и гипокалиемия являются ведущим звеном в патогенезе холеры. Другие механизмы (интоксикация, аллергия и т.д.) имеют второстепенное значение. Гиповолемический шок, метаболический ацидоз, острая почечная недостаточность развиваются лишь при декомпенсированном обезвоживании.

1.3. Установление случаев заболевания холерой имеет важное значение для того, чтобы незамедлительно начать лечение и уменьшить возможность заражения окружающей среды.

В соответствии с "Руководством по борьбе с холерой", ВОЗ считает: заболевание холерой следует подозревать, если у больного в возрасте старше пяти лет наступает обезвоживание организма вследствие острой водянистой диареи и рвоты, или обнаруживается диарея в местности, где наблюдается вспышка холеры.

2. Клиника

 

2.1. Инкубационный период при холере в зависимости от заражающей дозы, вирулентности вибрионов и восприимчивости организма человека длится от 1 до 5 дней (чаще 1-2 дня).

Возможна различная клиническая картина болезни - от легких форм до тяжелейших состояний, протекающих с резким обезвоживанием и нарушением функции жизненно важных органов. Тяжесть клинического течения болезни и интенсивность терапии определяются в первую очередь выраженностью обезвоживания. Степень обезвоживания устанавливается на основании клинической картины болезни, результатов клинико-физиологических исследований и для удобства оценки объема раствора, необходимого для регидратации, выражается в процентах дефицита массы пациента.

Различают 4 степени обезвоживания:

Дегидратация I степени

Дегидратация II степени

Дегидратация III степени

Дегидратация IV степени, или декомпенсированное обезвоживание.

2.2. У больных с дегидратацией I степени жидкий стул и рвота обычно не повторяются чаще 2-4 раз, и общая потеря жидкости не превышает 3% массы тела. Самочувствие больных, как правило, удовлетворительное, жалобы сводятся к ощущению слабости, сухости во рту, жажды. Физико-химические показатели крови не отклоняются от показателей здоровых лиц. Длительность болезни чаще ограничивается 1-2 днями. При таком течении холеры больные обычно не обращаются за медицинской помощью, выявление их связано с наибольшими диагностическими трудностями, поскольку без бактериологического обследования зачастую невозможно отличить холеру от желудочно-кишечных заболеваний другой этнологии. Холера с дегидратацией I степени встречается наиболее часто - в 50-60% случаев и регистрируется, главным образом, в разгаре и на спаде эпидемии.

2.3. При дегидратации II степени, наблюдаемой у 15-20% больных, потери жидкости составляют 4-6% массы тела. Заболевание начинается остро, чаще всего с появлением обильного стула, который становится более частым - 10-15 раз в сутки, постепенно теряет каловый характер и приобретает вид рисового отвара. Иногда стул может иметь желтоватый, коричневатый и красноватый оттенок, в редких случаях вследствие примеси крови он может иметь вид "мясных помоев". Понос обычно не сопровождается болями в животе, тенезмами, хотя умеренные боли могут иметь место. Вскоре к поносу присоединяется обильная рвота, которая редко сопровождается тошнотой. Наблюдается быстрое нарастание явление обезвоживания. Больные жалуются на недомогание, резкую слабость, головокружение, сухость во рту, жажду. Кожа сухая, как правило, бледная. Часто наблюдается нестойкий цианоз, преимущественно губ и пальцев рук, охриплость голоса, возможно снижение тургора кожи. У отдельных больных появляются кратковременные судороги икроножных мышц, кистей, стоп, судорожные подергивания жевательных мышц. Преобладает тахикардия, нередко имеет место гипотония и олигоурия Признаки сгущения крови минимальные, возможно ее компенсаторное разжижение. Нарушения электролизного состава крови непостоянны и носят транзиторный характер, чаще наблюдается гипокалиемия и гипохлоремия. Заболевание продолжается в среднем 3-4 дня.

2.4. Больные с дегидратацией III степени (наблюдается в 10-15%) теряют жидкость в объеме 7-9% массы тела. От двух начальных степеней эта форма холеры отличается наличием выраженных симптомов обезвоживания и состоянием неустойчивой компенсации, вместе с тем, в отличие от IV степени, отсутствуют вторичные нарушения гомеостаза и органная патология, эксикоз и дефицит электролитов исчезают более быстро в процессе регидратационной терапии. Водянистый характер, большая частота и объем испражнений и рвотных масс уже с первых часов болезни характерны для данной формы. Больных беспокоят неутолимая жажда, постоянные позывы на рвоту, судороги мышц верхних и нижних конечностей сопровождаются мучительными болями и периодическим возбуждением больных. Выражены и другие симптомы эксикоза: цианоз носогубного треугольника, акроцианоз, снижение тургора кожи (кожная складка сохраняется длительное время), осиплость голоса, вплоть до афонии. Отмечается падение артериального давления, слабый частый пульс, нередко коллаптоидное состояние, снижение температуры тела до 35,5-36 градусов. Язык сухой, при пальпации живота определяется урчание, возможна легкая болезненность в эпигастральной и околопупочной области. Сгущение крови умеренно выражено, плотность плазмы равняется 1028-1032 г/л, индекс гематокрита - 0,48-0,55 л/л. Концентрация ионов калия и хлора в крови снижается при относительной гипернатриемии.

2.5. Дегидратация IV степени или декомпенсированное обезвоживание (алгид) встречается в 8-15% и характеризуется стремительным развитием болезни, беспрерывными дефекациями и обильной рвотой. Уже в первые 10-12 часов развивается обезвоживание, достигающее 10 и более процентов массы тела. У некоторых больных к моменту поступления в стационар, вследствие паретического состояния желудочно-кишечного тракта, понос и рвота могут прекратиться, появляясь вновь в процессе регидратации или после ее окончания. Все симптомы эксикоза бывают выражены в полной мере: заостряются черты лица, появляется симптом "темных очков" вокруг глаз, кожные покровы - холодные на ощупь, липкие, наблюдается их общая синюшность. Судорожные сокращения распространяются на основные группы скелетных, а иногда и гладких мышц, становятся продолжительными, периоды расслабления - почти не выражены, наблюдается вынужденное положение конечностей. Характерна гипотермия, афония, резкое снижение тургора кожи, самопроизвольное сморщивание ее в виде "руки прачки". Больные находятся в состоянии прострации. Сопорозное состояние или даже кома развиваются лишь незадолго до смерти. Пульс частый, слабого наполнения, нередко не прощупывается. Артериальное давление - резко снижено или не определяется, дыхание - поверхностное, до 50-60 в минуту, развивается гиповолемический шок, анурия, предсмертная асфиксия.

     2.6. При исследовании  периферической  крови  выявляется  увеличение
                          -6                                  -3
числа эритроцитов (от 7х10   в 1 мкл), лейкоцитов (до 20-60х10   в 1 мкл)
нейтрофильный сдвиг лейкоцитарной формулы, повышенная агрегация форменных
элементов  крови,  значительная  гемоконцентрация  (индекс  гемокрита   -
0,5-0,7 л/л,  плотность  плазмы  -  1035-1042      г/л), гилокалиемия (до
2,5 ммоль/л), метаболический ацидоз. По данным  ЭКГ  отмечаются  признаки
диастолической перегрузки правых отделов сердца и тахикардия. Больные III
и  IV  степенью  обезвоживания  нуждаются  в  немедленном      проведении
регидратации.

2.7. У детей в возрасте до 3 лет холера протекает наиболее тяжело, что обусловлено наряду с обезвоживанием поражением центральной нервной системы: наблюдается адинамия, клонические судороги, конвульсии, нарушения сознания, возможно развитие комы, отчасти связанное с развивающейся гипогликемией.

У детей раннего возраста из-за высокой физиологической лабильности водно-солевого баланса определение небольшого дефицита жидкости при начальных степенях дегидратации представляет известные трудности, особенно при невозможности проведения специальных лабораторных исследований. В этих случаях на практике возможно выделение трех степеней дегидратации, определяемых на основании клинических признаков (табл.2.1)

3. Лечение

 

3.1. В связи с ведущим значением обезвоживания в патогенезе холеры лечебные мероприятия должны быть направлены в первую очередь на восстановление водно-солевого баланса. Правильно проведенная регидратационная терапия даже без дополнительных методов лечения может снизить летальность при холере практически до нуля. Лечение проводится в регидратационных палатах, оснащенных в соответствии с приложением 2.1, имеющим в наличии необходимое количество медикаментов и других материалов (приложение 2.2)

3.2. Водно-солевую терапию необходимо начинать в максимально ранние сроки от начала болезни. Промедление в несколько часов может оказаться роковым дня больного. При обезвоживании III-IV степени уже во время транспортировки больного в стационар должно быть начато внутривенное или оральное введение жидкости. Водно-солевая терапия проводится в два этапа: первый этап - регидратация - восстановление исходных потерь жидкости в течение первых часов после начала терапии, второй этап - коррекция продолжающихся потерь воды и солей, которая проводится весь последующий период до прекращения диареи.

3.3. Регидратация у взрослых должна быть проведена в течение 1-3 часов в объеме, который соответствует исходному дефициту массы тела. Терапевтическая тактика при этом всецело определяется состоянием больных и, прежде всего, степенью обезвоживания.

3.4. Больным с обезвоживанием I и II степени регидратацию проводят путем перорального введения жидкости. Показано назначение отечественного официального препарата "Глюкосолан", который растворяют в питьевой воде при Т 40-42°С непосредственно перед употреблением. Приготовленный раствор содержит натрия хлорида - 3,5 г, натрия бикарбоната - 2,5 г, калия хлорида - 1,5 г, глюкозы - 20,0 г на 1 литр питьевой воды.

При отсутствии официального препарата возможно приготовление в аптеке навесок солей для разового применения. Ввиду неспособности солевых растворов, которые содержат натрий бикарбонат, храниться в течение длительного времени, в последние годы вместо натрия бикарбоната в состав солевой смеси стали вводить натрий цитрат в дозе 2,9 г. В аптечной сети распространяются препараты "Регидрон" и "Циклоглюкосолан", которые содержат натрий цитрат. Взрослому приготовленный раствор назначается для питья, исходя из оптимальной объемной скорости 1-1,5 л/час. Больные обычно пьют по 200 мл каждые 8-12 минут, в течение 2-3 часов. Расчет объема раствора, который необходимо ввести перорально за 1 час, производится по формуле, которая учитывает массу тела больного и степень его обезвоживания:

                                  Р х П
                         мл/час = ----- х 10, где
                                    6

 

мл/час - необходимая скорость перорального введения регидратационного раствора;

Р - масса тела больного в кг;

П - процент дефицита массы больного, который обусловлен обезвоживанием. В ряде случаев регидратацию целесообразно проводить путем введения глюкозо-электролитного раствора через назогастральный зонд. При повторяющейся рвоте, нарастающих потерях жидкости, а также у больных сахарным диабетом и престарелых следует переходить на внутривенную инфузию полиионных растворов.

3.5. Больным с обезвоживанием III-IV степени в периоде регидратации абсолютно показано внутривенное струйное введение полийонных растворов. При этом раствор, подогретый до 36-38°С, вводится струйно с объемной скоростью 70-120 мл за 1 минуту (до 5-7 литров за 1-1,5 часа).

Наиболее адекватное замещение теряемых ионов и оптимальная коррекция нарушений гомеостаза достигается при внутривенной инфузии раствора "Квартасоль", который содержит натрия хлорида - 4,75 г., натрия ацетата - 2,5 г., натрия бикарбоната - 1,0 г., калия хлорида - 1,5 г на 1 литр апирогенной воды.

3.6. Струйное введение жидкости должно прекращаться после нормализации пульса, восстановления артериального давления, ликвидации гиповолемии гемоконцентрации, ацидоза и легочной гипертензии.

3.7. Коррекцию продолжающихся потерь воды и солей в тяжелых случаях проводят в течение нескольких суток. При этом объем вводимой жидкости находится в прямой зависимости от объема испражнений и рвотных масс, которые измеряются по 4-6 часовым интервалам и фиксируются в реанимационной карте. В эту карту вносятся сведения о пульсе, артериальном давлении, частоте дыхания, температуре тела, а также физико-химические показатели крови: плотность плазмы, индекс гематокрита, концентрации электролитов, показатели кислотно-щелочного равновесия. С учетом исследованных показателей проводится индивидуальная коррекция потерь жидкости и метаболических нарушений.

Коррегирующую терапию обычно проводят путем внутривенной капельной инфузии указанных полиионных растворов или, если позволяет состояние больного, переходят на оральное введение указанных выше глюкозо-электролитных растворов.

3.8. Водно-солевая терапия при холере у детей также проводится внутривенным вливанием раствора "Квартасоль" с добавлением 15-20 г глюкозы на 1 литр раствора. Регидратация у детей до двух лет осуществляется капельной инфузией и продолжается 6-8 часов, причем в первый час вводится лишь 30% объема жидкости, необходимого для регидратации. Возмещение потерь жидкости у детей с дегидратацией I и II степени целесообразно проводить путем питья или вливания глюкозо-электролитного раствора через назогастральный зонд.

3.9. Водно-солевая терапия должна прекращаться после значительного уменьшения объема стула, появление испражнений калового характера при отсутствии рвоты и преобладания количества мочи над количеством испражнений в течение последних 6-12 часов.

3.10. Суммарный объем растворов, вводимых взрослому больному холерой за 3-5 дней лечения, составляет 10-30 литров и более.

3.11. Больным холерой, у которых была дегидратация II-IV степени, в период реконвалесценции показаны продукты, содержащие соли калия (курага, черная смородина, виноград, картофель и др.), а также перорально назначается оротат калия или панангин по 1-2 таблетки 3 раза в день. 10%-ные растворы уксуснокислого или лимонно-кислого калия по 1 столовой ложке 3 раза в день.

3.12. При лечении декомпенсированного обезвоживания назначение сердечно-сосудистых средств не показано. Прессорные амины противопоказаны. Они усугубляют нарушения микроциркуляции и способствуют развитию острой почечной недостаточности.

3.13. Помимо регидратационной терапии больным холерой независимо от тяжести течения назначают перорально один из следующих препаратов:

- тетрациклин по 0,3-0,5 г через каждые 6 часов;

- доксициклин по 0,1 г каждые 12 часов в первые сутки лечения, а в последующие дни по 0,1 г - один раз в сутки;

- левомицетин по 0,5 г через каждые 6 часов;

- эритромицин по 0,5 г через каждые 6 часов;

- фуразолидон по 0,1 г через каждые 6 часов:

- ципрофлоксацин по 0,5 г через каждые 12 часов.

Дозы указанных препаратов для детей определяют в соответствии с п.2.11.2. первой части Инструкции. Продолжительность применения антибиотиков в зависимости от тяжести заболевания - 3-5 дней.

При выборе препарата следует учитывать данные о чувствительности к антибиотикам циркулирующих в очаге штаммов, в связи с чем антибиотикограмма первой культуры должна быть определена в течение 24 часов после ее выделения. В дальнейшем контроль за чувствительностью выделяемых в очаге холерных вибрионов необходимо проводить не менее одного раза в неделю. В случае обнаружения холерных вибрионов, устойчивых к применяемым антибиотикам, в каждом конкретном случае лечебно-профилактической и противоэпидемической службами медицинского штаба решается вопрос о смене препарата с учетом антибиотикограммы циркулирующих в очаге штаммов.

3.14. Бактериологическое обследование вибриононосителей проводят до начала лечения антибиотиками. Дня лечения назначают один из препаратов, указанных в п.3.13. Антибиотики применяют по схемам, рекомендованным для больных. Длительность антибиотикотерапии вибриононосителей - 3 дня, при микст-инфекциях или хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта - 5 дней.

3.15. Выписка больных холерой (вибриононосителей) производится после их выздоровления, завершения регидратационной и этиотропной терапии и получения отрицательных результатов бактериологического исследования.

3.16. Контрольное бактериологическое обследование перед выпиской из стационара производится через 24-36 часов после окончания лечения антибиотиками. Исследованию подлежат: испражнения - троекратно, ежедневно, а у лиц из числа декретированных контингентов также порции В и С желчи - однократно.

3.17. Выписку из истории болезни перенесших холеру (вибрионосительство) главный врач больницы направляет в установленном порядке заведующему территориальным лечебным учреждением (больница, поликлиника) по месту жительства выписываемого.

3.18. В выписке из истории болезни указываются: клинический (с указанием степени дегидратации) и бактериологический диагноз перенесенного основного и сопутствующих заболеваний; данные о проведенном лечении; результаты всех исследований, выполненных в момент выписки и указания о необходимости диспансерного наблюдения.

4. Режим работы в холерном, провизорном госпиталях,
изоляторе и оксерваторе

 

Извлечения из СП 1.2.011-94

 

4.1. Больных или подозреваемых на холеру, а также контактировавших с ними и выезжающих из зон карантина, помещают в специальные лечебные учреждения.

4.2. Госпиталь для больных холерой может быть организован на базе инфекционной или многопрофильной больницы. Разрешается организация временного госпиталя в изолированных помещениях типа школьных зданий, общежитий и т.п., а также в палатках с обязательным выделением отдельного обслуживающею персонала и соблюдением настоящих правил.

4.3. В заразном отделении холерного госпиталя предусматривают:

а) приемно-сортировочное отделение с отдельным входом для больных и кладовой для хранения одежды больных до отправки ее в дезкамеру;

б) отделение для больных, в котором должны быть предусмотрены палаты (боксы) для раздельного размещения больных по срокам поступления, степени тяжести болезни;

в) раздаточную пищи;

г) комнату для обеззараживания инфекционного материала (выделения больных, судна, белье и т.д.);

д) ванные и туалетные комнаты;

е) процедурную;

ж) помещения для выписки больных с санитарным пропускником;

з) санпропускник для персонала (комнат для надевания и снятия защитной одежды, душевая).

4.4. В приемно-сортировочном отделении осматривают поступающих больных, оказывают экстренную помощь, берут материал для бактериологического исследования, проводят санитарную обработку, переодевают больного, готовят одежду больного к отправке в дезкамеру, начинают специфическое лечение и составляют первичную документацию на поступившего больного. Приемное отделение оборудуют в соответствии с его назначением и необходимостью проведения текущей и заключительной дезинфекции.

В кладовой одежду хранят в индивидуальных мешках, сложенных в баки или полиэтиленовые мешки, внутренняя поверхность которых обработана раствором инсектицида.

4.5. В отделении госпиталя должны быть палаты для больных со смешанными инфекциями, для беременных и рожениц, а также вся аппаратура и инструментарий для оказания экстренной хирургической акушерско-гинекологической помощи. В палатах для больных должны быть созданы все условия для их лечения, индивидуального обеспечения предметами личного пользования, текущей и заключительной дезинфекции.

4.6. Больные не должны пользоваться общими туалетами. Ванные и туалеты должны быть постоянно закрыты на ключ, который хранят у ответственного за соблюдение биологической безопасности. Туалеты открывают для слива обеззараженных растворов, а ванны - для санобработки выписываемых.

4.7. Пищу для больных доставляют в посуде кухни к служебному входу незаразного блока и там переливают и перекладывают из посуды кухни в посуду отделений и направляют в раздаточную отделения, где пищу распределяют по порциям и разносят по палатам. Посуду, в которой пища поступила в отделение, обеззараживают кипячением, после чего бак с посудой передают в буфетную, где ее моют и хранят до следующей раздачи. Раздаточная должна быть снабжена всем необходимым для обеззараживания остатков пиши. Индивидуальную посуду обеззараживают кипячением.

4.8. В незаразной половине располагают помещения для обслуживающего персонала:

а) гардеробная для верхнего платья;

б) санпропускник (желательно отдельно для мужчин и женщин);

в) туалетные;

г) буфетная;

д) бельевая;

е) комнаты для дежурного персонала (для оформления историй болезни, другой документации и для отдыха);

ж) другие подсобные помещения (аптека и т.п.).

4.9. На территории госпиталя оборудуют площадку со стоком и ямой для дезинфекции транспорта, используемого для перевозки больных.

4.10. Постельные принадлежности выписанного из госпиталя реконвалесцента сдают в дезинфекционную камеру, кровать и тумбочку обеззараживают (приложение 1.7).

ГАРАНТ:

См. "Режимы обеззараживания различных объектов, зараженных патогенными микроорганизмами", приложение 5.4. к СП 1.2.011-94

4.11. В госпитале, где находятся больные холерой, весь персонал работает в костюме IV типа, а при проведении туалета больных, взятии ректального материала - надевают резиновые перчатки. Младший персонал дополнительно надевает клеенчатый (полиэтиленовый) фартук, резиновую обувь, а при обработке выделений больного - маску.

По окончании работы защитный костюм, кроме пижамы, подлежит обеззараживанию.

4.12. Персонал холерного стационара работает по режиму, установленному для отделений с острыми кишечными заболеваниями.

4.13. Больных острыми кишечными инфекциями, подлежащих провизорной госпитализации, размещают индивидуально или небольшими группами по срокам поступления и, желательно, по клиническим формам и по тяжести заболевания.

4.14. Устройство, порядок и режим работы провизорного госпиталя устанавливают таким же, как и для инфекционного госпиталя.

4.15. При подтверждении в провизорном госпитале предполагаемого диагноза больных переводят в холерный госпиталь.

В палате провизорного отделения после перевода больного проводят дезинфекцию в соответствии с характером инфекции. Остальным больным (контактным) проводят санобработку, переодевают в чистое белье, по возможности, переводят в другую палату и приступают к профилактическому лечению.

При исключении подозреваемого диагноза персонал работает в костюме, соответствующем диагностируемому заболеванию.

4.16. Сроки выписки больных из провизорного госпиталя определяют конкретно в каждом случае, но он не должен быть менее инкубационного периода подозреваемого заболевания, исчисляемого после выявления последнего случая в этом госпитале.

4.17. Устройство и режим изолятора такой же, как и в инфекционном госпитале.

4.18. В изоляторе для контактировавших с больными холерой обслуживающий персонал работает в костюме IV типа.

4.19. В госпитале и изоляторе, особенно в палатах для больных и изолированных, не должно быть лишних предметов. Вся обстановка госпиталя и изолятора должна состоять из таких предметов, которые могут быть легко обеззаражены.

4.20. Выделения больных и изолированных (рвотные массы, моча, испражнения и т.д.) подлежат обязательному обеззараживанию. Методы обеззараживания применяются в соответствии с приложением 1.7.

4.21. В госпитале и изоляторе ежедневно проводят тщательную текущую дезинфекцию, после освобождения их - заключительную дезинфекцию.

4.22. Режим биологической безопасности инфекционного, провизорного госпиталя и изолятора находится под систематическим контролем противочумного учреждения; где нет противочумных учреждений - под контролем территориальных центров Госсанэпиднадзора.

4.23. Обсерваторы развертывают в приспособленных помещениях (административных зданиях, школах, профилакториях, гостиницах, детских и спортивных лагерях, пассажирских судах и т.п.).

4.24. В помещении обсерватора должны быть предусмотрены приемная, палаты для обсервируемых, комнаты для медицинского и обслуживающего персонала, комнаты для взятия материала, хранения личных вещей обсервируемых, буфетная, санпропускник и подсобные помещения.

4.25. Помещаемые в обсерватор проходят медицинский осмотр с целью выявления лиц с желудочно-кишечными расстройствами. В обсерватор допускаются только здоровые люди.

4.26. Заполнение отделений или палат обсерватора проводят одномоментно. Обсервируемых размещают по срокам поступления, по возможности небольшими группами с принятием мер к исключению общения с типами из других помещений.

4.27. При выявлении в обсерваторе больного с острым кишечным заболеванием его переводят в провизорный госпиталь. Лиц, контактировавших с заболевшим, изолируют на месте до получения результатов бактериологического исследования.

При недостаточной разобщенности обсервируемых срок обсервации возобновляют с момента вывода последнего больного и проведения заключительной дезинфекции. В случае получения отрицательных результатов лабораторного исследования срок обсервации не изменяют.

4.28. После освобождения отделения обсерватора проводят заключительную дезинфекцию и повторное его заполнение.

4.29. Для работы в обсерваторе разрешается мобилизация медицинских работников и другого обслуживающего персонала из числа обсервируемых.

4.30. Стационары круглосуточно охраняют воинские или милицейские наряды.

Лабораторная диагностика

 

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимают лабораторные методы исследований, основным из которых является бактериологический.

Исследования проводят с целью:

- выявления больных холерой и вибриононосителей;

- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, погибших от подозрительного на холеру заболевания;

- бактериологического контроля за эффективностью лечения больных холерой и вибриононосителей;

- бактериологического контроля за зараженностью объектов внешней среды;

- бактериологического контроля за эффективностью обеззараживания в очаге инфекции.

Серологические методы исследовании, как правило, имеют дополнительное значение и лишь в отдельных случаях результаты их использования могут быть решающими для ретроспективной диагностики заболеваний или вибриононосительства.

 

I. Бактериологический анализ

 

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, смывы с объектов внешней среды, пищевые продукты, мухи и др.

 

1.1. Забор и доставка материала на исследование

 

1.1.1. Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность отбора проб, хранения их и доставки в лабораторию.

     Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных  вибрионов  к
дезинфицирующим  средствам  и  кислотам,  возможность  антагонистического
действия  сопутствующей  микрофлоры  и  концентрацию  возбудителя       в
исследуемом материале. Если в материале от больных алгидной формой холеры
                                     6    9
концентрация возбудителя достигает 10 - 10  КОЕ в 1 мл, то в испражнениях
больных  легкой  формой  и  леченных  антибиотиками,  реконвалесцентов  и
                                              4    2
носителей количество их обычно не превышает 10 - 10  КОЕа 1 г.

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую даже следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств для забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2% содовом растворе.

Материал для исследования должен быть доставлен не позже, чем через 2 часа после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1% пептонная вода (рН 8,4 +- 0,2).

В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000-1:200000 или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1% - 0,2%. В отдельных случаях для транспортировки материала могут быть использованы солевые консерванты (раздел 4).

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты приготовления ее.

В стационарах среды для отбора проб рекомендуется сохранять не более 2-х суток при температуре не выше (10 +- 1)°С.

При наличии у больного диареи материал забирают в количестве 10-20 мл, у больных легкими формами энтерита - 1-2 г испражнений. От больных с тяжелой формой диареи материал направляют в лабораторию нативным и в 1% пептонной воде. В транспортную среду вносят 1-2 мл или 1-2 г на 5-6 мл среды.

1.1.2. При обследовании на вибриононосительство материал в стационарах забирает медицинский персонал этих учреждений, в очаге - создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.

Материал в количестве 1-5 г может быть доставлен на исследование нативным, в 1% пептонной воде или в другой транспортной среде.

Во всех случаях приема обследуемым слабительного пробу испражнений немедленно помещают в 1% пептонную воду.

1.1.3. Способы отбора проб.

1.1.3.1. Испражнения и рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением.

1.1.3.2. Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер N 26 или 28, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения собирают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.

1.1.3.3. Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5-6 см и собирают им содержимое со стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1% пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.

1.1.3.4. Стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед забором материала смачивают стерильным физиологическом раствором и вводят в прямую кишку на 8-10 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1% пептонной водой.

1.1.3.5. Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

1.1.3.6. От умерших с подозрением на холеру берут отрезки верхней, средней и нижней частей тонкого кишечника длиной около 10 см. Отрезки вырезают между двойными лигатурами, наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника.

Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в пробирку с 1% пептонной водой.

Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

1.1.4. Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортировки металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Формы направлений даны в разделе 5.3.

ГАРАНТ:

По-видимому, в предыдущем абзаце речь идет о Приложении 3.1. к настоящей Инструкции

1.1.5. Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в предварительно простерилизованную посуду с непромокаемой пробкой.

Из водопроводных кранов отбор проб воды производят после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 минут при полном открытии крана.

1.1.6. Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л также в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10х15 см в 10-15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.

1.1.7. Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.

Исследовать их можно групповым методом, объединяя в один посев содержимое кишечника от 10-15 экземпляров, отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном сосуде. 1.1.8. Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 1% пептонной водой с поверхности площадью 2 0,5х0,5 м . Тампон опускают во флакон или пробирку с 1% пептонной водой.

1.1.9. Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1% пептонную воду с 1% сахара.

1.1.10. Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают.

1.1.11. Пробы объектов внешней среды этикетируют, заполняют направление (раздел 3.3.) и отправляют в лабораторию с нарочным.

ГАРАНТ:

По-видимому, в предыдущем абзаце речь идет о Приложении 3.2.

1.2. Порядок исследования

 

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие контрольный номер ОБК, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, предусмотренной действующей инструкцией (приложение N 1).

ГАРАНТ:

По-видимому, в предыдущем абзаце речь идет о разделе 4 настоящей Инструкции

Приготовленные в лаборатории питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые для диагностики холеры, подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке (1.7.). Питательные среды разливают в стерильную лабораторную посуду.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С.

Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1% пентонной воде 6-8 часов, в пентонной воде с теллуритом калия 12-18 часов, на щелочном агаре - не менее 14-16 часов, а на плотных элективных средах - 18-24 часов. Теллурит калия следует добавлять в 1% пентонную воду с рН не ниже 8,3 +- 0,1 до внесения в него исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2-х суток при условии содержания их в холодильнике.

1.2.1. Исследование материала от больных, трупов и подозреваемых на вибриононосительство.

 

I этап:

 

а) испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию из кусочков слизистой кишечника трупа засевают в 50-100 мл накопительной среды и петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS, среда Монсур и др.). При исследовании материала от борных, подозрительных на заболевание холерой, не допускается использование 1% пентонной воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды;

б) при исследовании материала от больных с подозрением на холеру применяют ускоренные методы исследования нативного материала; иммуннолюминесцентный, иммобилизации, РНГА (см. п.1.4.). Бактериоскопию мазков и препаратов "висячей капли" из нативного материала проводить нецелесообразно;

в) при исследовании материала от подозреваемых на вибриононосительство испражнения засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах, в 100 мл - при групповых.

Материал, доставленный в 5 мл 1% пентонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 л 1% пентонной воды во флаконе и доставки не позже 2-х часов после забора пробы, флакон помещают в термостат для накопления возбудителя.

 

II этап (через 6-8 часов от начала исследования):

 

а) с первой среды накопления производят высев на щелочной агар и в 5-8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

Если на первом этапе при исследовании нативного материала от больного ускоренными методами (иммуннолюминесцентная микроскопия, иммобилизация и др.) получены положительные результаты, то допускается возможность исключения 2-ой накопительной среды;

б) при отрицательных результатах ускоренных методов исследования нативного материала, их повторяют в случае необходимости после 6-ти часов инкубации первой среды накопления.

 

III этап (через 12-14 часов от начала исследования):

 

а) высев со второй среды накопления на щелочной агар.

 

IV этап (через 18-24 часа от начала исследования):

 

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды натирного материала, а также в высевах из 1 и 2 накопительных сред:

При исследовании материала от больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний можно начинать уже на III этапе (через 10-12 часов от начала исследования). В остальных случаях - по истечении 18-24 часов инкубировании посевов:

а) чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косопроходящем свете (раздел 5) и отбирают колонии дня выделения и идентификации культуры.

Колонии холерных вибрионов в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и серо-голубые под стереоскопическим микроскопом. Колонии на элективных средах TCBS И СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом фоне среды, полупрозрачные. На среде Монсур колонии бесцветные, полупрозрачные с темным центром. Размеры колоний через 10-12 часов инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18-24 часам инкубации достигают 2-3 мм в диаметре.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичпые колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые.

б) При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу с использованием одиокомпонентного реактива (без альфа-нафтола) или индикаторных бумажек (СИБ-1 - набор для идентификации вибрионов). Колонии отсевают сразу после появления положительной реакции. С колониями, обнаруженными на элективных средах, не рекомендуется ставить пробу на оксидазу.

в ) Подозрительные колонии проверяют в реакции агглютинации на стекле (далее "слайд-агглютинация") с сывороткой холерной 01 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с вариантоспецифическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении и приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки люминесцирующей сывороткой. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют с холерными сыворотками 0-139 и R0 в слайд-агглютинации.

Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной 01 сывороткой в разведении 1:100 и вариантоспецифической в разведении 1% 50 или положительная реакция с люминесцирующими антителами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона 01, а в случае положительной реакции с сывороткой 0139 - холерного вибриона 0139 серогруппы.

г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными 0,1, RO и 0139 сыворотками, отсевают на одну из полиугеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя, Клиглера или др.) или на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры и ее идентификации.

 

V этап (через 24-36 часов от начала исследования):

 

Отбор культур для идетинфикации. На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичным для вибрионов характером роста:

- на двууглеводных средах (лактозо-сахарозная, глюкозо-лактозная) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа;

- трехуглеводная среда Клинглера полностью желтеет без образования газа и сероводорода.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы. Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных по этим признакам культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах с помощью мазков, окрашенных по Граму.

Культуры, дающие характерные изменения на полиугеводных средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной реакции агглютинации с холерными сыворотками 0,1, RO, Инаба и Огава. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой 0139.

На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками 01 серогруппы (01, Инаба, Огава) выдают предварительный или окончательный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона 01 соответствующего серовара (см. раздел 1.3.7.2.).

Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой 0139 при отрицательных результатах с сыворотками 01 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона 0139 серогруппы.

Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками 01 и 0139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной или полной схеме (см. рис.1 и раздел 1.3 настоящей инструкции). VI этап (через 36-48 часов от начала исследования. Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы: 01 (Инаба, Огава, Гикощима) или 0139 с указанием эпидемической значимости штамма по тесу гемолитической активности, чувствительности к антибиотикам. Для культур холерных вибрионов 01 называют принадлежность к биовару. Идентификацию культур, агглютинирующихся RO-сывороткой (см. в разделе 1.3.).

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующиеся холерными сыворотками (01 и 0139), выдают ответ о выделении холерных вибрионов не 01 и не 0139 серогрупп (так называемых НАГ-вибрионов). При наличии инбрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам).

 

Pиc.3.1. Схема лабораторного исследования на холеру

 

/----------------------\
| Исследуемый материал |-------------------------------\
\----------------------/                               |
   |          |/----------------------------\          |
   |        /---\           /----\       /- - - - - - - - \
/----\      | I |---------- | II |-------    Ускоренная
| ЩА |      \---/           \----/       |   диагностика  |
\----+----\ /----\          /----\       \- - - - - - - - /
   | | ЭС | | ЩА |          | ЩА |
   | \----/ \----+----\     \----/
   |           | | ЭС |       |
   |           | \----/       |
   |           |              |
- отбор колоний;
- высев подозрительных колоний
на ЩА и ПУС;
- отбор культур по ПУС и ОП.
   /-------------------------------------------\
/------\ /------\ /-----\ /------\ /------\ /------\
| ПУС+ | | ПУС+ | | ОП+ | | ПУС- | | ПУС+ | | ПУС- |
| ОП+  | | *    | | *   | | ОП+  | | ОП-  | | ОП-  |
\------/ \------/ \-----/ \------/ \------/ \------/
   ---------------------------        |        не исследуют
                 |
              /-----\                 исследуют на
        /-----| ОРА |---------------\ кишечную группу
        |     \-----/               |
        |                           \----------------\
        |                                            |
/-----------------------------------------\      /----------------------\
|сокращенная|- развернутая реакция|       |      |  АГ-ПУС+ПУС-ОП+ОП+   |
|схема иден-|  агглютинации  с сы-|       |      |----------------------|
|тификации  |  воротками  01, Ога-|       |      |определение принадлеж-|
|           |  ва, Инаба, 0139;   |       |      |ности  к  роду  Vibrio|
|           |- проба  с диагности-|       |      |виду   V.cholerae  или|
|           |  ческими фагами;    |полная |      |другим видам  патоген-|
|           |- группа Хейберга.   |схема  |      |ных вибрионов.        |
|-----------+---------------------|иденти-|      \----------------------/
|           |- гемагглютинация;   |фикации|
|           |- чувствительность  к|       |
|биовар     |  полимиксину;       |       |
|           |- гемолиз  Грейга / в|       |
|           |  пробе;             |       |
|           |- Ф-П реакция        |       |
\-----------------------------------------/

 

Условные обозначения: I и II - среда накопления; ЩА - щелочной агар; ЭС - элективная среда для выделения вибрионов; ПУС - полиуглеводная среда; ОП - оксидазная проба; ОРА - ориентировочная реакция агглютинации; АГ - агглютинация; Ф-П - реакция Фогес-Проскауэра на образование ацетилметил-карбинола;

 

------------------------------

* - в случае использования для отбора колоний только ПУС или ЩА.

1.2.2. Исследование объектов окружающей среды.

Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы исследования материала от больных только на I этапе. II-IV этапы изложены в разделе 1.2.1.

1.2.2.1. Вода поверхностных водоемов и водопроводная. В зависимости от времени доставки пробы возможны варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов.

а) К исследуемой воде добавляют раствор основного пентона до 1% концентрации.

Определяют рН в случае необходимости подщелачивают 10% раствором едкого натрия до рН - 8,3 +- 0,1. Анализ пробы (1 л) проводят в 2-х объемах по 500 мл. Время инкубации в таком объеме - 8 - 10 часов, 2-я среда накопления - в объеме 10 мл. Время инкубации в среде без теллурита калия 6 часов, с теллуритом калия - 18 часов.

б) В исследуемую воду (в 2-х объемах по 500 мл) добавляют раствор основного пентона до 1% концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными проверки. Устанавливают рН - 8,3 +- 0,1. Время инкубации 18-24 часа; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации 6-8 часов.

Исследование проб воды можно также проводить с использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства "Прогресс" в концентрации - 0,1-0,2%.

в) После установления щелочной реакции и добавления раствора основного пептона до 1% концентрации пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 250С) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1% пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления через 6 часов инкубации.

г) Воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или N 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски холерной люминесцирующей сывороткой, а также ставить РНГА, РКОА и другие реакции.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать III среду накопления.

1.2.2.2. Хозяйственно-бытовые сточные воды

 

Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

После добавления к пробам основного раствора пептона до 1% концентрации устанавливают рН 8,3 +- 0,1 и инкубируют в объемах по 500 мл 8-10 часов (1 среда накопления) или с добавлением теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18-24 часа.

При заборе сточных вод марлевыми тампонами, последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл).

1.2.2.3. Гидробионты

 

- Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом иглы в спинной мозг. Животное фиксируют за лапки на препаровальной доске брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом, ножницами делают медиальный разверз от анального отверстия до грудной полости. Пинцетом берут желчный пузырь, отсекают от печени, разрезают стерильными ножницами и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50-100 мл 1% пептонной воды (I среда накопления). Стерильными ножницами разрезают желудок, содержимое которого засевают в 1% пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель ножницами в верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.

- У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10-20 экз. в одной пробе и делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1% пептонную воду.

- Дафний и рачков растирают в ступке и засевают петлей в 1% пептонную воду.

- У раков исследуют кишечник, делая посев содержимого в среду накопления и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.

1.2.2.4. Пищевые продукты

 

- Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.

- Молоко в количестве 5 мл сеют в 50-100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1% концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5-10 мл засевают в 1% пептонную воду.

- Твердые пищевые продукты измельчают и растирают в ступке с физиологическим раствором и засевают в количестве 10 г в 100 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

- Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5-10 г, размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его кусков.

После посева продукта устанавливают рН среды 8,3 +- 0,1.

1.2.2.5. Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1% пептонную воду и исследуют по обычной схеме.

1.2.3. При осуществлении эпиднадзора за холерой и отсутствием возможности 2-х сменной работы лаборатории исследование материала обследуемых контингентов, предусмотренных в первой части настоящей инструкции, можно проводить в условиях односменной работы по одному из приведенных ниже вариантов (пп.1.2.3.1. или 1.2.3.2.).

1.2.3.1. В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1% пептонную воду (рН 8,2-8,4) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.

Вопрос о выборе среды для транспортирования и порядке исследования решают в зависимости от разницы разрыва во времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1% пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлена в таблице 3.1.

 

Таблица 3.1.

 

Порядок забора и исследования материала в зависимости
от времени доставки его в лабораторию в 1% пептонной воде
(примерная схема)

 

N
вари-
анта
Время
взятия
материала
Время
доставки
в лабораторию
Среда для
взятия проб
Назначение
среды
1 2 3 4 5
1. 6.00-10.00 До 10.00 1. 1% п.в. 50
мл (не более 3-
х часов хране-
ния) 2. 1% п.в.
5-10 мл
1. Среда накоп-
ления
2. Транспортная
среда
2. 10.00 до конца
рабочего дня
лаборатории
После 10.00 в те-
чение рабочего
дня
1% п.в. 5-10 мл Транспортная
среда
3. По окончании
рабочего дня
лаборатории
До 10.00 следую-
щего дня
1% п.в. 5-10 мл Транспортная
среда
4. Выходные дни
лаборатории
До 10.00 1% п.в. с Т.К.
50 мл
- " -

 

N
вари-
анта
I среда на-
копления
II Среда накопле-
ния. Высев с I
I среды накопления
накопления
Высев со II среды
накопления на щелоч-
ной агар
1 6 7 8
1. 1. Среда с дос-
тавленным мате-
риалом
2. Посев в 50
мл 1% п.в.
Через 6 ч. инкубаций пе-
ресев 1% п.в. с Т.К. и
высев на щелочной агар и/
или Э.С.
В начале следующего ра-
бочего дня
2. 5-10 мл среды с
материалом в 50
мл 1% п.в. с
Т.К.
9.00 следующего дня пере-
сев в 1% п.в. высев на
щелочной агар и/или Э.С.
Через 6 ч. инкубации
3. 5-10 мл с мате-
риалом в 50 мл
1% п.в
Через 6 ч. инкубации пе-
ресев 1% п.в. с Т.К. и
высев на щелочной агар и/
или Э.С.
В начале следующего
рабочего дня
4. - " - - " - - " -

Обозначения: Т.К. - теллурит калия; п.в. - пептонная вода; Э.С. - среда элективная для выделения холерного вибриона.

 

В течение рабочей недели для отбора проб используют 1% пептонную воду без теллурита калия в объеме 5-10 мл, налитую во флаконы или пробирки (транспортная среда).

Пробы до отправления в лабораторию сохраняют при комнатной температуре 24 +- 1°С) в биксах, ящике, шкафу и т.д. в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок. Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 часов.

В случаях, когда температура в помещении превышает 25°С, материал следует брать в 5-10 мл 1% пептонной воды с теллуритом калия.

В пробы во флаконах в лаборатории доливают соответствующую среду накопления в количестве 50 мл, а из пробирок все 5-10 мл транспортной среды с материалом переносят в 50 мл среды накопления.

На период выходного дня лаборатории в порядке исключения допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1% пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое время сохранения проб до начала исследования при температуре 20 +- 1°C - 60 часов (27 +- 3)°C - 48 часов; в лаборатории 3 мл поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1% пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной схеме.

1.2.3.2. Исследование материала от людей и объектов внешней среды можно проводить с использованием 1% пептонной воды высокой щелочности (рН 9,5 +- 0,5) соответственно "Методическим рекомендациям по проведению и организации бактериологических исследований на холеру" (Ставрополь, 1989), утвержденным МЗ СССР 04, 1988 N 26-47.

Пептонную воду подщелачивают до необходимого уровня рН с помощью 10-20% NaOH. Основной раствор пептона и 1% пептонную воду с рН 9,5 +- 0,5 можно готовить впрок по общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и последующей стерилизацией при 120°С - 20 минут.

Пептонную воду с повышенным рН в качестве накопительной среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с удлинением срока инкубации ее до 18-24 часов. Дальнейшее исследование проводят в соответствии с п.3.2.1. настоящей инструкции для второго и последующего этапов.

1.3. Идентификация культур холерных вибрионов

 

1.3.1. Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к роду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (01.0139 или других).

1.3.2. К виду V.cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и в анаэробных условиях до кислоты (без газа), декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не обладающие дигидролазой аргинина, относящиеся к 1 (реже ко 2-й) ферментативной группе по Хейбергу. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены в таблицах NN 3,2-3,4 и рис.3.2.

1.3.3. Возбудителями холеры являются V.cholerae серогруппы 01 (биоваров холеры и эльтор; сероваров Инаба, Огава и Гикошима) и 0139 серогруппы.

1.3.4. Токсигенные (содержащие ген холерного токсина vct+) варианты холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп вызывают заболевания холерой, склонные к широкому эпидемическому распространению.

1.3.5. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина - vct-) варианты холерных вибрионов 01 и других серогрупп могут вызывать спорадические (единичные) или групповые заболевания (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к широкому эпидемическому распространению.

1.3.6. Предварительную идентификацию проводят по комплексу признаков, включая морфологию колоний, морфологию и подвижность микробных клеток, пробу на оксидазу и агглютинацию на стекле (слайд-агглютинация) с сыворотками 01 (1:100), RO (1:50) и 0139 (в разведении, соответствующем обозначенное на этикетке). Для культур, положительно реагирующих с сывороткой 01, усганавливают принадлежность к серологическим вариантам (Инаба и Огава) также в слайд-агглютинации.

1.3.7. Окончательную идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.

1.3.7.1. Сокращенная идентификация предусматривает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками 01, Инаба, Огава и RO, определение чувсгвительности к диагностическим монофагам и принадлежность к биохимической группе Хейберга. Культуры, агглютинирующиеся не менее чем до 1/2 титра сыворотками 01 и одной из вариантоспецифических сывороток, относят к V.cholerae 01 серовара Огава или Инаба. Культуры агглютинирующиеся сыворотками обоих сероваров не менее чем 1/2 титра, относят к серовару Гикошима.

Для подгверждення выделенной культуры холерных вибрионов к 0139 серогруппе достаточно положительного результата в слайдагглютинации с соответствующей сывороткой.

 

Рис.3.2.

Таксономия вибрионов
по Bergey's manual of systematic Bakteriology, 1984
по дополнительным данным из публикаций после 1984 г.

 

 /--------------------------\
 |  Семейство Vibrionaceae  |          Другие роды:
 |  Shewan a. Veron, 1965   |------  - Aeromonas Kluyver
 \--------------------------/          et van Niel, 1936
              |                      - Plesiomonas Habs
              |                        et Shubert, 1962
              |                      - Photobacterium
   /---------------------\             Beijerinck, 1889
  /|    Типовой род      |
  || Vibrio Pacini, 1854 |
  |\---------------------/
  |           \-----   ------------\
 Другие виды                       |
 патогенных для            /----------------\      V.cholerae non 01:
 человека вибрионов:       | Типовой род    |    - 02 - 0139...
 - V.alginolyticus         | Vibrio cholerae|      (по международной
 - V.anguilarum (2)        | Pacini 1854    |      классификации)
 - V.cincinnatiensis (1)   \----------------/    - 02 - 084...
 - V.carcharia (1)                 |               (по классификации
 - V.damsela (2)          /- V.cholerae 01 -\       Рос. НИПЧИ
 - V.fluvialis        /------------\/------------\ "Микроб" и Ростовского
 - V.furnisii         |  серовары: ||  биовары:  |  н/Д НИПЧИ) (3)
 - V.hollisae         |- V.cholerae||- V.cholerae|
 - V.mimicus          |  Inaba     ||  cholerae  |
 - V.metschnikovii    |- V.cholerae||  (класси-  |
 - V.orientalis       |  Ogawa     ||  ческий)   |
 - V.parahaemolyticus |- V.cholerae||- V.cholerae|
 - V.salmonicida(1)   |  Hikojima  ||  eltor     |
 - V.vulnificus       \------------/\------------/

 

Примечания:

(1) - Предложены после издания Bergey's manual of systematic Bakteriology, 1984

(2) - Предложено Mcdonell M.T. a. Colwell R.R., 1985 отнести к новому роду Listonella;

(3) - Типовые штаммы 02.039, кроме 012, 023 и 026, соответствуют Sakazaki R., 1970, 040.083 не изучены в сравнении с международной коллекцией; 084 соответствует 0139 серогруппе.

 

Таблица 3.2.

 

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio
и родственных микроорганизмов

 





Признаки
Роды сем. Vibrionaceae
Vibrio, в т.ч.

Aerom
onas


Plesi
omo
nas


Photob
acreriu
m


Entero
bacteri
aceae


Pseudomo
nas
V.chl
orae
другие
виды
1. Морфология,
окраска по
Граму
Грамотрицательные полиморфные прямые или слегка изогну-
тые палочки
Подвижность + + +(-) + + +- +
Оксидаза + +(-) + + + - +(-)
Рост на сре-
дах без NaCl
+ -(+) + + - - -
Чувствитель-
ность к 0-129
+ + - +(-) + - -
О/ф глюкозы в
среде Хью-
Лейфсона
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/-
Газ из глюкозы - -+ +(-) - + +- -
Лизиндекарбокс
илаза
+ +(-) -(+) _ + +- -(+)
Аргининдигидр
олаза
- -(+) + + + -+ +-
Ферментация:              
маннита - + +(-) - - +(-) +-
Арабинозы - -(+) +(-) - - +(-) -(+)
сахарозы + +(-) + - -(+) +- -
инозита - -(+) - + - -+ х
Образование:              
ацетилметил-
карбинола
+(-) +(-) +(-) - + -(+) х
индола + +(-) +(-) - - - +-
нитратредук-
тазы
+ +(-) + + +(-) + +-
бета-гактози-
дазы
+ +(-) + + + +(+) х
желатиназы + +(-) + - + -(+) +-
Биолюминес-
ценция
-(+) _(+) - - + - -
Mол. % G+C в
ДНК
38 51 57-63 51 40-44 39-59 58-70

 

Условные обозначения: х - нет данных; + положительный результат в 90%; - отрицательный результат в 90%, +- положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени; +(-) или -(+) в скобках редко наблюдаемый результат.

 

Таблица 3.3.

 

Дифференциация патогенных для человека
видов вибрионов рода Vibrio

 



Признаки
Виды рода Vibrio
V.cho
lerae
V.algi
nolyti
cus
V.an-
guilla
rum
V.cin-
cinna-
tiensis
V.da
msela
V.flu-
vialis
V.fur-
nisii
V.hol
-lisae
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки
Морфология  
Подвижность + + + + + + + +
Роение на агаре - + - - - - - -
Индефеноло-
ксидаза
+ + + + + + + +
Образование:  
газа из глюкозы - - - - d - + -
Индола + + + - - - +(-) +
Ацетилметил-
карбанола
+(-) + + + + - - -
ферментация:  
Лактозы -(+) - - - - - - -
Арабинозы - - +- + - + + +
Сахарозы + + + + - + + -
Целлобиозы - - + + - -(+) -(+) -
Маннита +(-) + + - - + + -
Салицина - - - + - + - -
аргинидигодро-
лаза
- - + - + + + -
лизиндекарбо-
ксилаза
+ + - + +(-) - - -
орнитиндекарбо-
ксилаза
+ + - - - - - -
бета-галакто-
зидаза
+ - + +- - + + -
нитраредуктаза
амилаза
+
+
+
+
+
+
+
+
+
x
+
+
+
d
+
x
желатиназа d + + - - + d -
Рост в %
пептонной в оде
c NaCl
               
- " - 0%
- " - 3%
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-(+)
+
-(+)
+
-
+
- " - 6% d + +- + + + + d
- " - 10% - + - - - -(+) - -
Рост при 4°C - - - - - - - x
20°C + + + - - + + x
35°С + + + + + + + x
42°C + + - - - d - x
45°С - - - - - d - x
Биолюминесценция -(+) - - - - - - -

 



Признаки
Виды рода Vibrio
V.met
schni-
kovii
V.mi-
micus
V.or-
dallei
V.pa-
rahae
moly-
ticus
V.sal-
moni-
cida
V.car-
charie
V.vul
nifi-
cus
1 10 11 12 13 14 15 16
Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки
Морфология  
Подвижность + + + + + + +
Роение на агаре - - - d - - -
Индефеноло-
ксидаза
- + + + + + +
Образование:  
газа из глюкозы - - - - x x -
Индола +(-) + - + - x +
Ацетилметил-
карбанола
+ - - - - + -
ферментация:  
Лактозы +(-) -(+) - - x x d
Арабинозы - d - +- x x -
Сахарозы + - + - x x -
Целлобиозы - - - - x x +
Маннита + + + + x x +(-)
Салицина - - - - x x +
аргинилигодро-
лаза
-(+) - - - - - -
лизиндекарбо-
ксилаза
+(-) + - + x + +
орнитиндекарбо-
ксилаза
- + - + x x +
бета-галакто-
зидаза
d d - - - x +
нитраредуктаза
амилаза
-
+
+
-
+-
-
+
+
-
x
x
x
+
+
желатиназа + d + + - x +
Рост в %
пептонной воде
c NaCl
             
- " - 0%
- " - 3%
-(+)
-(+)
+
+
-
+
-
+
-
+
x
x
-
+
- " - 6% + -x x + - + d
- " - 10% - - x - - x -
Рост при 4°C - - - - + x -
20°C + x + + + x +
35°С + + - + - x +
42°C d d - d - x d
45°С d x - - - x -
Биолюминесценция - - - - x - -

Обозначения: см. обозначения к табл.2

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте документа допущена опечатка. Речь идет об обозначениях к табл. 3.2. настоящей Инструкции

 

Таблица 3.4

 

Распределение патогенных вибрионов по группам Хейберга

 

Виды
вибрионов
Ферментация Группа
Хейберга
араби-
нозы
ман-
нозы
саха-
розы
V.cholerae 01 - +(-) + I(II)
V.cholerae non 01 - +(-) + I(II)
V.mimicus - + - V
V.metschnikovii - +- + I, II
V.fluvialis + + + III
V.vulnificus - + - V
V.alginolyticus -+ + + I, III
V.parahaemolyticus +(-) + - VII(V)
V.hollisae + -(+) - VIII(VII)
V.furnisii + +(-) + III(IV)
с образованием газа
V.damsela - + - V
с образованием газа у некоторых штаммов
V.anguillarum +- x + X
V.cincinnatiensis + x + X
V.ordallei - - + II
V.salmonicida x - x X
V.carcharie x x x X

Обозначения: ( ) в скобках указаны редко встречающиеся варианты

1.3.7.2. При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворотками 01 или 0139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток культур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпидемических мероприятий.

Достоверность таких результатов повышается при использовании ускоренных методов диагностики: люминесцентно-серологического, иммобилизации соответствующими сыворотками, КО-агглютинации и др.

Выделенные культуры передают для полной идентификации в назначенные для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения.

1.3.7.3. Полная идентификация культур, агглютинирующихся холерными сыворотками 01 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к поликсимину, реакция Фогес-Проскауэра).

1.3.7.4. Культуры холерных вибрионов, чувствительные к монофагу эльтор, изучают по отношению к холерным диагностическим фагам - ХДФ 3.4.5.

1.3.7.5. Культуры V.cholerae 01 и 0139 серогрупп изучают по гемолиnической активности в пробе Грейга и чувствительности к антибиотикам, используемым в клинической практике для лечения холеры.

1.3.7.6. На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические и культуральные признаки, относящиеся к 1 группе по Хейбергу, агглютинирующисся 01 и одной из вариантом специфических сывороток не менее чем до 1/2 титра, лизирующихся и не лизирующихся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой 0139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и ориентировочно определяя эпидемическую значимость (по результатам пробы Грейга).

Токсигенные штаммы холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана, в отличие от гемолизпозитивных нетоксигенных штаммов.

Для холерных вибрионов 01 серогруппы, кроме того, указывают биовар на основании чувствительности к одному из диагностических фагов (эльтор или классическому) и/или по дополнительным признакам для фагорезистентных культур (см.табл.3.5.).

1.3.7.7. Определение вирулентности культуру холерных вибрионов 01 комплексным методом проводят в соответствии с наставлением к препаратам фагов ХДФ.

1.3.7.8. Для полной характеристики культур холерных вибрионов 01 в специализированных лабораториях, располагающих необходимыми индикаторными штаммами холерных вибрионов и набором типирующих холерных фагов, определяют фаготип.

Также в специализированных лабораториях проводят изучение культур холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на токсигенность методом молекулярного зондирования или в полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие гена холерного токсина (vсt-гена) и на экспериментальных животных.

1.3.7.9. Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и клеток, тесту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными сыворотками 01 и 0139 серогрупп, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим принадлежность к роду Vibrio и виду V.cholerae культуры изучают в пробе с диагностическими фагами. При выделении чувствительных к пробе к холерным диагностическим монофагам не агглютинирующихся холерными сыворотками 01 серогруппы культур особое значение имеет изучение их клеточного состава, т.к. популяции таких штаммов могут находиться типичные холерные вибрионы 01 группы.

     Если культура по совокупности признаков относится  к  виду  холерных
вибрионов,  ее  изучают  в  реакции  агглютинации  с  набором  вибрионных
диагностических сывороток О2 - О83, выпускаемых институтом "Микроб".

 

Таблица 3.5.

 

Признаки, дифференцирующие биовары V.cholerae 01

 


Признаки
Биовары V.cholerae 01
eltor cholerae
Лизабельность монофагами:    
классическим - +
эльтор + -
Чувствительность к 30 ед/мл полимиксина В -(+) +
Агглютинация куриных эритроцитов +(-) -
Образование ацетилметилкарбинола +- -

 

На культуры, агглютинирующиеся одной из вибрионных сывороток, выдают ответ о выделении V.cholerae 02....05 или другой серогруппы.

Если культуры не типируются известными вибрионными сыворотками или они отсутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают обобщенно V.cholerae поп 01 (так называемые НАГ-вибрионы). Штаммы V.cholerae поп 01 кроме того типируют набором фагов ТЭПВ и определяют их чувствительность к антибиотикам.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не 01 группы преимущественно относятся к 02, 05, 06, 08, 09, 014, 017, 024, 028, 034, 036, 041, 042, 047 и 050 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ I, IV, VII.

1.3.7.10. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не агглтинирующихся холерными 01 и 0139 сыворотками, целесообразность полной таксономической характеристики определяется индивидуально для конкретных территории и объектов с учетом частоты встречаемости аналогичных вариантов и эпидситуации по холере.

 

1.3.8. Идентификация атипичных культур холерных вибрионов

 

1.3.8.1. К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся по отдельным признакам, определяющим принадлежность к соответствующей таксономической категории. Это различные антигенные варианты (с ослабленной или утраченной агглютинабельностью сыворотками 01, Инаба, Огава), а также RO и R-варианты, агглютинирующиеся соответствующей сывороткой при наличии, снижении или отсутствии агглютинабельности сыворотками 01 серогруппы. В последние годы среди эпидемических и неэпидемических штаммов заметно возросла частота встречаемости холерных вибрионов, рсзистентных холерным диагностическим фагам. В то же время встречаются слабо агглютинирующиеся сывороткой 01 штаммы, но сохранившие чувствительность к холерным диагностическим фагам.

Антигенная вариабельность нередко сочетается с изменчивостью по тем или иным культурально-морфологическим, биохимическим признакам и чувствительности к фагам.

Определенные трудности для идентификации представляют штаммы холерных вибрионов, измененные по культурально-морфологическим признакам, образующие шероховатые, мутные, пигментированные, карликовые колонии. В мазках, сделанных из таких культур, наблюдаются удлиненные, спиралевидные, шаровидные клетки. Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у которых отмечается ослабление или утрата способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (маннит, маннозу, сахарозу, крахмал), аминокислоты (лизин, орнитин, триптофан) и другие субстраты.

1.3.8.2. Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение их по ряду дополнительных признаков, определяющих принадлежность к роду Vibrio и виду холерных вибрионов (определение декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, оксидазной активности, типа расщепления глюкозы в среде Хью-Лейфсона и др.)

1.3.8.3. Культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше признаками рода Vibrio и вида cholerae, агглютинирующиеся сыворотками 01 до 1/4 титра, лизирующиеся диагностическими монофагами в диагностическом титре, следует относить к серовару 01.

1.3.8.4. Вышеуказанные и другие атипичные варианты культур холерных вибрионов следует направлять для дальнейшего изучения в специализированные лаборатории.

1.3.8.5. Для подтверждения принадлежности к V. cholerae 01 слабо агглютинирующихся, диссоциируюших и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных серологических методов (иммуноферментного, специфической иммобилизации вибрионов, РНГА, иммунопреципитации в геле, ПЦР со специфическими праймерами и др.). Рекомендуется при изучении культур, атипичных по тестам серологической идентификации, кроме того, использовать реакцию перекрестной адсорбции агглютининов по Кастеляни, реакции агглютинации с убитыми кипячением культурами, иммунофлюоресценции с соответствующими иммуноглобулиновыми препаратами и пробу с комплементами.

1.3.8.6. Для культур холерных вибрионов, агглютинирующихся только RO сывороткой, обязательно дополнительное подтверждение специфичности их взаимодействия в реакции иммобилизации вибрионов или преципитации в геле.

1.3.8.7. Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся культур применяют РНГА, иммунопреципитацию или реакцию агглютинации с использованием осажденной культуры и 0,3% р-ра хлористого натрия для разведения диагностических сывороток и приготовления взвеси изучаемой культуры (см. раздел 1.6.1.3.).

1.3.9. Ускоренная идентификация культур

Отдельную колонию или чистую культуру отсевают в 3 мл питательного бульона и после 3-х часовой инкубации изучают по тестам:

- агглютинабельности 0-холерными диагностическими сыворотками в 1% пептонной воде;

- чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам;

- принадлежности к биохимической группе (по Хейбергу), используя соответствующие дифференциальные среды Гисса в объеме 1 мл с учетом результатов через 3-6 часов инкубации при 37°С.

1.4. Порядок учета анализов, оформления и выдачи результатов

 

1.4.1. Ответ о положительном результате может быть предварительным и окончательным.

1.4.2. Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивання его в пептонной воде с помощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайдагглютинации сыворотками 01 и 1039 подозрительных на холерный вибрион колоний.

Предварительный ответ сообщают устно и только в случаях проведения срочных анализов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпидемических мероприятий.

1.4.3. Окончательный положительный ответ выдают по результатам полной, сокращенной или ускоренной идентификации выделенной культуры (через 18-48 часов).

1.4.4. Отрицательный ответ может быть дан только по окончании исследования по полной схеме через 36-48 часов при осуществлении эпиднадзора в условиях односменной работы лаборатории, допускающей использование теллурита калия, продолжительность анализа увеличивается до 3-4 суток.

Запрещается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного исследования (иммунолюминесцентного, РНГА и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при эпиднадзоре.

1.4.5. При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а соответственно и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного (см. раздел 3.3.). При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

1.4.6. При проведении большого объема исследований на холеру больных острыми кишечными заболеваниями в очаге направления к анализам и ответы на них оформляют списком (раздел 3.3.).

1.4.7. Учет анализов и культур ведут по установленным формам (раздел 3.3.). Обязательным является ведение рабочих записей исследования подозрительных культур.

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анализов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за каждый день подшивают отдельно.

1.5. Методы ускоренной диагностики

 

При поступлении материала от больных с подозрением на холеру, от трупов лиц, умерших от острых кишечных заболеваний, наряду с классическими методами используются ускоренные методы диагностики.

1.5.1. Люминесцентно-серологический метод

Метод дает возможность выявить возбудителя холеры в S-форме при содержании его в исследуемом материале не менее чем 106 м.кл. в 1 мл. Исследованию подлежит нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.

Порядок приготовления мазков, их люминесцентная окраска, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в "Наставлениях по применению сыворотки диагностической холерной люминесцирующей".

Положительный результат может быть получен через 1,5-2 часа от начала исследования.

При осмотре мазков, обработанных холерной люминесцирующей сывороткой, особое внимание следует обратить на морфологию святящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве "гасителя" бычий альбумин, меченный родамином. Методика его использования описана в "Наставлениях по применению сухого альбумина, меченного родамином".

Для выявления в исследуемом материале холерных вибрионов 0139 серогруппы, в связи с отсутствием в настоящее время препарата специфических люминесцирующих антител, при наличии агглютинирующей сыворотки к вибрионам этой серогруппы возможно использование непрямого метода иммунофлюоресценции, который описан в "Наставлении по применению сыворотки диагностической антивидовой против иммуноглобулинов человека (или различных животных) люминесцирующей".

1.5.2. Метод иммобилизации вибрионов под влиянием специфической холерной 01-сыворотки.

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких 5 минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10 клеток на 1 мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или верхнего слоя 1-й и 2-й пептонной воды.

Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю 01 сыворотки в разведении 1:100, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении 400-600х, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй наблюдается иммобилизация отдельных микробных клеток и образование микроагглютинатов немедленно или в течение 1-2 минут. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15-20 минут от начала исследования. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1% пептонной воде.

При отрицательном результате исследования необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой к 0139 серогруппе, которую разводят 1:5.

1.5.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием холерного иммуноглобулинового зритроцитарного диагностикума.

Порядок полготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в "Наставлении по применению диагностикума холерного эритроцитарного антительного", прилагаемого к препарату.

Наряду с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом может быть использован холерный иммуноглобулиновый диагностикум на основе полимерных микросфер (разработка и мелкосерийное производство Ростовского НИПЧИ). Препарат предназначен для объемной реакции агглютинации (РОА) по типу РНГА. К препарату прилагается наставление по его применению.

1.6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

 

1.6.1. Серологические свойства изучают в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с выпускаемыми Российским НИПЧИ "Микроб" и Иркутским НИПЧИ холерными агглютинирующими сыворотками 01, Инаба, Огава, RO, а также выпускаемыми Ростовским НИПЧИ холерной сывороткой 0139 cepoгруппы.

1.6.1.1. Слаид-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и/или агаровую 12-18 часовую культуру и сыворотки 01 серогруппы в разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку 0139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в физиологическом растворе.

При наличии КОА-иммуноглобулинового холерного-диагностикума, сопровождаемою сертификатом качества, он может быть использован для серологической идентификации холерных вибрионов в слайд-агглютинации. Результаты при этом более демонстративны и не требуют подтверждения в развернутой агглютинации.

1.6.1.2. Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с наставлением к диагностической сыворотке.

1.6.1.3. Развернутая реакция агглютинации в 0,3% NaCL с осажденной культурой.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3% раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в этом же растворе с концентрацией более 1 млрд/мл в объеме 8-10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1-1,5 часов. В реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенный 0,3% раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд/мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3% раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции. Использование 0,3% раствора натрия хлорида дает возможность исключить спонтанную агглютинацию.

1.6.1.4. Метод экспрессной серологической идентификации холерных вибрионов с помощью фазово-контрастного устройства по феномену микроагглютинации и иммобилизации (1.5.2.).

1.6.1.5. Люминисцентно-серологический метод см.1.5.1.

1.6.1.6. Реакция непрямой гемагглютинации с диагностикумом холерным эритроцитарным иммуноглобулиновым и реакция объемной агглютинации с холерным иммуноглобулиновым на основе полимерных микросфер в соответствии с наставлением к препаратам.

1.6.2. Биохимические свойства

1.6.2.1. Определение индофенолоксидазы.

Реактивы:

- двухкомпонентный: 1% водный раствор пара-аминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) и 1% спиртовой раствор 1-нафтола;

- однокомпонентные: 1% водные растворы диметил-пара-феннлендиамина, тетраметил-пара-фениленднамина (гидрохлорида) или этилокси-пара-фенилендиамина сернокислого (из набора для обработки бумаги "фотоцвет").

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

а) на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на чашке наносят каплю 1% спиртового раствора пара-аминодиментиланилина (гидрохлорида или оксалата) и 1 каплю 1% водного раствора 1-нафтола.

Положительная реакция на индофенолоксидазу - ярко-синяя окраска культуры через 1-2 минуты.

При использовании однокомпонентных реактивов этим же методом в положительных случаях - красное окрашивание культуры.

б) Для постановки пробы на оксидазу можно использовать специальные реактивные бумажки из набора СИБ или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2-3 каплями 1% водного раствора диметил-пара-фенилендиамина. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой) стеклянной или деревянной палочкой и размазывают в виде небольшого пятнышка. Через 10-30 секунд появляется пурпурно-красное или синее (в зависимости от реактива) окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции. Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Plesiomonas, а отрицательную - все Enterobacteriaceae.

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами Vibrio или Pseudomonas, и Enterobacteriaceac, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

1.6.2.2. При отсутствии реактивов на оксидазу можно использовать пробу "тяжа". На чашку Петри наносят каплю 0,5% водного раствора дезоксихолата натрия или 2,5°/о водного раствора моющего средства "Прогресс" и в ней суспендируют 18-часовую агаровую культуру исследуемого штамма. При положительной реакции суспензия немедленно теряет мутность, становится слизистой и вязкой - тянется за петлей, что характерно для вибрионов.

Проба позволяет дифференцировать вибрионы не только от Еnterobacteriaceae, но и от других родственных грамотрицательных микроорганизмов, которые не образуют "тяжа". Исключение составляют лишь некоторые штаммы Aeromonas, которые в течение примерно 60 секунд образуют слабо тянущуюся нить.

1.6.2.3. Определение декарбоксилазной активности проводят на специальных средах. В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5 - 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при температуре 37+-0,5°С 1-4 дня. Окисление определяют по желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

1.6.2.4. Определение декарбоксилазной активности проводят на специальных средах. В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин, засевают по полной петле 18-часовой культуры и заливают 0,5-1 мл стерильного вазелинового масла, включая контроли сред. Инкубируют посевы при 37°С. Учет результатов ежедневно, при отрицательном результате - наблюдение до 1-4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при декарбоксилированни аминокислот накапливаются амины и происходит защелачивание среды.

1.6.2.5. Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Изучаемую культуру выращивают в течение 12-20 часов на плотной или 3-4 часа на жидкой питательной среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при 37°С и учитывают через 6-18 часов.

1.6.2.6. Определение диастатической активности. Культуру засевают в среду с крахмалом и индикатором Андреде, инкубируют 12-18 часов при 37°С. При разложении крахмала среда краснеет.

1.6.2.7. Определение протеолитических свойств. В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 22 +- 0,5°С или 37 +- 0,5°С в течение 18 часов. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 минут. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

1.6.2.8. Определение образования индола. Холерные вибрионы обладают ферментом триптофаназой и при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образованием индола, что является с помощью индикаторных бумажек (раздел 4) или реактива Эрлиха.

1.6.2.9. Определение образования сероводорода. Холерные вибрионы не продуцируют фермента тиосульфатредуктазы, т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера - это является дифференциальным признаком. Однако они, также как некоторые другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за счет которою способны образовывать сероводород из серосодержащих аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне Хоттингера, Мартена и некоторых др. средах. Способ приготовления индикаторных бумажек см. в разделе 4.

1.6.2.10. Выявление способности фосфоресцировать. Изучаемые штаммы засевают в 1% пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре 37 +- 0,5°С в течение 18 часов. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5-10 минутной адаптации в темноте.

1.6.2.11. Для определения оксидазы, уреазы, индолообразования, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно также использовать Систему индикаторную бумажную (СИВ).

1.6.3. Определение чувствительности к диагностическим фагам. В лабораторной диагностике холеры используют бактериофаги С и Эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясо-пептонном бульоне.

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 минут при 37°С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5 - 0,7% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45°, добавляют 0,10,2 мл 3-4 часовой бульонной культуры, тщательно смешивают и выливают на поверхность агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 минут. В центр квадратов наносят штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре 37 +- 0,5°С. Результаты учитывают через 2-4 и 18-20 часов. Наличие лизиса в виде одного "стерильного" пятна или группы мелких негативных колоний оцениваются как положительный результат.

1.6.4. Дополнительные тесты дифференциации биоваров V.cholerae 01 серогруппы.

1.6.4.1. Определение чувствительности к полимиксину. В расплавленный и остуженный до 45-50°С питательный агар (рН 7,1 +- 0,1) добавляют полимиксин М или В из расчета 30 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среду развивают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносят обычной бактериологической петлей 18-ти или 3-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубирования посевов при 37°С в течение 18 часов. Холерные вибрионы биовара cholerae не растут на полимиксиновом агаре, биовара eitor - по-разному.

1.6.4.2. Постановка реакции гемагглютинации. На предметное стекло в чашке Петри помещают каплю физиологического раствора и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5% взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раствором. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 минуты наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю физиологического раствора добавляют каплю 2,5% взвеси эритроцитов; б) в капле физиологического раствора суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательны.

1.6.4.3. Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетиметилкарбинол). Испытуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре 37 +- 0,5°С в течение 1-3 суток. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40% раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 1 час. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.

1.6.5. Оценка вирулентности холерных вибрионов

1.6.5.1. Определение вирулентности холерных вибрионов эльтор по фаговому тесту и гемолитической активности проводится в соответствии с наставлением, прилагаемым к препаратам диагностических ХДФ фагов. Для постановки пробы с фагом используют 1,5-2,0% щелочной агар рН 7,4 +- 0,2, приготовленный на любой основе. Агар разливают в чашки Петри и подсушивают перед употреблением. В пробирку с 4 мл 0,7% щелочного агара, расплавленного на водяной бане и остуженного до 45°С, добавляют 0,2-0,3 мл 3-4 часовой бульонной культуры изучаемого штамма, тщательно смешивают и выливают на поверхность агаровых пластин. После застывания полужидкого агара чашки вновь подсушивают с полуоткрытой крышкой при комнатной температуре, готовят десятикратные разведения фагов ХДФ-3, ХДФ-4 и ХДФ-5 до ДРТ, указанного для каждого из них. Петлей или штампом-репликатором наносят фаги из всех разведений на поверхность полужидкого агара, в первом случае дно чашки расчерчивают на квадраты с учетом количества разведений фагов, во втором отмечают положение репликатора и начало рядов разведений каждого из фагов. После подсыхания капель фагов на поверхности агара чашки закрывают, переворачивают кверху дном и инкубируют при температуре 37 +- 0,5°С 16-18 часов, в экстренных случаях результаты можно учитывать через 3-4 часа. Оценку результатов производят по четырехбалльной системе: 4 - полный; 3 - множественные негативные пятна, полусливной лизис; 2 - пятно лизиса со значительным вторичным ростом или изолированные негативные колонии. Положительным считают лизис культуры на 4 и 3+ фагом в ДРТ.

1.6.5.2. Определение гемолитической активности (по Грейгу). К 1 мл суточной культуры, выращенной в 4-5 мл мясо-пептонного бульона или сердечно-мозгового инфуза, добавляют 1 мл 1% взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь микробов и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 +- 0,5°С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 часа, окончательный - следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (бульон - -1 мл + 1 мл взвести эритроцитов) гемолиз отсутствует. Вирулентность культуры определяют по совокупности признаков, указанных в наставлении к препаратам фагов ХДФ.

1.6.5.3. Определение вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков.

Исследования могут проводить в лабораториях, имеющих разрешение на экспериментальную работу с возбудителями 1-2 групп патогенности.

Внутрикишечно зараженные кролики-сосунки являются наиболее чувствительной моделью экспериментальной холеры. Использование этой модели для оценки вирулентности холерных вибрионов требует строгой унификации всех этапов исследования и единого подхода к оценке результатов.

     Для заражения животных используют  4-х  часовую  агаровую  культуру,
выращенную  при  температуре (37  +-  0,5)°С  или  18-ти  часовую  -  при
температуре (20 +- 2)°С.  Необходимо  использовать  две  заражающие  дозы
    5       7
1.10  и 1.10  , которые  вводят  внутрикишечно  в  объеме     0,2 мл двум
кроликам. Кроликов 10-12  дней,  весом  130-160  г,  фиксируют  к  станку
брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном  поле  и  смазывают  его
йодом. Дают эфирный или тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1% р-ра  на  100  г.
веса в/м), накрывают стерильной салфеткой  с  разрезом посередине.  После
засыпания животных, делают разверз длиной 1 см по средней линии живота на
уровне пупка. Через  небольшой  разрез  брюшной  стенки  извлекают  петлю
тонкого кишечника на  длинной  брызжейке,  фиксируют  с  помощью  мягкого
пинцета и вводят взвесь вибрионов. Петлю  погружают  в  брюшную  полость,
брюшную  стенку  и  кожу  послойно  зашивают.  Шов  смазывают      йодом.
Оперированных крольчат кормят с помощью шприца  молоком  и  наблюдают  48
часов. Всех погибших и умерщвленных через 48  часов  животных  вскрывают.
Наиболее выраженные изменения наблюдаются в  толстом  кишечнике,  который
растянут   бесцветной   или   светло-желтой   прозрачной   или     слегка
опалесцирующей жидкостью. Слепая  кишка  и  прилегающие  отделы  толстого
кишечника могут быть настолько растянуты, что через них видны  подлежащие
петли кишечника, что  создает  видимость  полной  прозрачности  кишечного
содержимого. Тонкий кишечник расширен  и  также  заполнен  полупрозрачным
содержимым. Возможна  инъекция  сосудов  брызжейки.  Описанные  изменения
характерны для  "синдрома  холерогенности",  наблюдаемого  при  заражении
эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.
     Вирулентные штаммы вызывают гибель большинства зараженных  животных,
                        5       7
зараженных  дозами  1.10 ,  1.10  м.кл.в  течение  первых  двух  суток  с
типичным "синдромом холерогенности".
     Слабовирулентные вибрионы обусловливают гибель  единичных  животных,
                      5      7
зараженных дозами 1.10 , 1.10  м.кл. Содержимое кишечника мутное,  иногда
желтого, коричневого или зеленоватого цвета.

Авирулентные штаммы не вызывают заболевания, гибели крольчат и макроскопических изменений в кишечнике.

Вирулентные штаммы выделяются преимущественно от больных и носителей холеры, а также из объектов окружающей среды в очагах холеры.

Слабо и авирулентные штаммы изолируют главным образом из объектов окружающей среды и изредка от людей при единичных случаях заболеваний или вибриононосительства.

Обязательной проверке вирулентности на модели кроликов-сосунков подлежат следующие штаммы V.cholerae 01 серогруппы:

а) Выделенные от людей:

- гемолиз позитивные штаммы холерных вибрионов;

- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов, атипичные по серологическим свойством и отношению к бактериофагам.

б) Выделенные из объектов окружающей среды:

- гемолизотрицательные вирулентные по фаговому тесту штаммы холерных вибрионов, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере;

- гемолизотрицательные, типичные по серологическим свойствам, чувствительные к диагностическому фагу эльтор, но слабовирулентные по комплексному методу.

Обязательной проверке вирулентности на модели кроликов-сосунков подлежат также все штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенные как от людей, так и из объектов окружающей среды.

1.6.5.4. Оценка холерных вибрионов на наличие гена холерного токсина с целью определения эпидзначимости выделенных штаммов проводится методом молекулярного зондирования с помощью ДНК-зонда, сконструированного в институте им. Н.Ф.Гамалеи. В связи с отсутствием в настоящее время коммерческих комплектов "холодных" зондов молекулярное зондирование на наличие vct-гена у свежевыделенных штаммов холерных вибрионов проводит Ростовский научно-исследовательский противочумный институт при условии своевременной доставки культур или отпечатков их на нитроцеллюлозных фильтрах, обработанных по специальной методике для обеспечения специфической стерильности и безопасности при пересылке почтой.

Для получения отпечатков 3-6 часовую бульонную культуру холерных вибрионов, выращенную при температуре (37 +- 0,5)°С, наносят бактериологической петлей или штампом-репликатором на поверхность щелочного агара и выращивают при температуре(37 +- 0,5)°С 18-24 часа для получения колонии 2-3 мм в диаметре. Нитроцеллюлозный фильтр (Hybond С или Schleicher a. Schuel Germany) накладывают на поверхность агара с колониями, через 1 мин (после промокания фильтра) снимают и помещают отпечатками колоний вверх на фильтровальную бумагу, смоченную тем же раствором, и выдерживают еще 5 мин. При этом происходит лизис клеток (визуально - колонии принимают вид капель слизи) и денатурация ДНК.

Фильтр переносят на фильтровальную бумагу, смоченную нейтрализующим буфером 1. Процедуру повторяют 3-4 раза с интервалом в 5 мин, всякий раз используя свежую бумагу, смоченную этим буфером.

Фильтр подсушивают на воздухе на сухом листе фильтровальной бумаги в течение 5-10 мин и промывают 2-3 раза по 10 мин при комнатной температуре в 20-30 мл нейтрализующего буфера 2. Фильтр сперва помещают колониями вверх на поверхность раствора и через 1-2 мин погружают в него.

     Фильтр  высушивают  на  воздухе  и  прогревают  при      температуре
(80 +- 0,5)°С в течение 1,5-2 часов для  фиксации  денатурированной  ДНК.
Обработанный  таким  образом  фильтр  помещают  между  двумя      листами
фильтровальной бумаги в полиэтиленовый пакет, запаивают  и  пересылают  в
плотной упаковке (желательно картонной).

 

Приготовление буферных смесей

Нейтрализующий буфер 1 (0,2 М трис-HCL, рН 7,5 +- 0,1 + 1М NaCL):

1М трис-HCL - 20 мл

5М NaCL - 20 мл

Н2О - до 100 мл

 

Для приготовления исходного 1М трис-HCL буфера рН 7,5 +- 0,1 навеску сухого трис-основания (121,1 г) растворяют в 600 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7,5 +- 0,1 соляной кислотой, затем доводят общий объем раствора до 1 л.

 

     Нейтрализующий буфер 2 (2хSSC + 50mМ ЭДТА + 25 mM  калий  фосфатный
буфер рН 7,0

 

     20хSSC - 50 мл
     0,5 ЭДТА - 50 мл
     1М К-фосф. буфер рН7,0 - 12,5 мл
     Н20 - до 500 мл
     20хSSC
     NaCL - 175,5 г
     цитрат натрия - 88,3
     Н2О - до 1 л
     Для приготовления 1М калий-фосфатного буфера рН7,0 смешивают  61  мл
1М КН2РО4 (34,8 г/200 мл воды)  с 39 мл  КН2РО4  (27,2  г/200 мл  воды) и
проверяют рН с помощью рН-метра, подводя к     7,0 добавлением одного или
другого раствора
     05 М ЭДТА
     К 93 г ЭДТА-Na   добавляют  300-350 мл  подогретой  дистиллированной
                   2
воды и постепенно приливают концентрированный  раствор  NaOH  до  полного
растворения   и   далее  до  рН 7,5 +- 0,1.  Общий объем доводят водой до
500 мл.

1.6.5.5. Ген холерного токсина может быть выявлен в полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами.

Для определения могут быть использованы культуры холерных вибрионов или их отпечатки на нитроцеллюлозных фильтрах (см.1.6.5.3.).

1.6.6. Фаготипирование холерных вибрионов.

Определение фаготипа циркулирующих штаммов холерных вибрионов в условиях эпидемических вспышек помогает выявлять источники инфекции и пути ее распространения внутри относительно изолированного очага и устанавливать эпидемические связи между отдельными очагами.

Исследование и учет результатов проводят в соответствии с инструкцией по использованию препаратов.

1.6.7. Определение чувствительности холерных вибрионов к антибиотикам и химиопрепаратам.

Чувствительность холерных вибрионов к антибиотикам и химиопрепаратам определяют количественным методом серийных разведений в питательной среде или методом диффузии в агар с использованием дисков и системой полуколичественного учета результатов.

     1.6.7.1. Метод диффузии  в  агар  с  использованием  дисков
     Степень    чувствительности    микроорганизмов    к    антибиотикам,
определяемая методом диффузии в агар, зависит  от  соблюдения  условий  и
стандартности   применяемых   препаратов.   При   постановке       метода
используют "сухой питательный агар  для  определения  чувствительности  к
антибиотикам"   (АГВ)  Дагестанского  НИИПС  и  диски   производственного
изготовления. Среду из сухого питательного агара (АГВ), приготовленную по
прописи, указанной на этикетке, разливают тонким слоем в  чашки  Петри  и
подсушивают. Из той же основы (АГВ) готовят  полужидкий     (0,7%) агар и
разливают по 3 мл в пробирки. Взвесь исследуемого штамма  в  концентрации
  8
10  м.кл./мл или 3-4 часовую бульонную  культуру  в  количестве    0,3 мл
вносят в 3 мл расплавленного и остуженного до     45°С полужидкого агара,
перемешивают и выливают на поверхность основного слоя питательного  агара
в  чашке  Петри.  Приоткрытые  чашки  с  нанесенным  полужидким   агаром,
содержащим изучаемую  культуру,  подсушивают  при  комнатной  температуре
10-15 минут. Затем на поверхность засеянной  Среды  накладывают  диски  с
антибиотиками (не  более  6)  и  в  перевернутом  кверху  дном  положении
помещают в термостат при температуре (37 +- 0,5)°С на 10-12 часов.

Зоны задержки роста культуры вокруг дисков измеряют по наиболее четкому контуру с помощью линейки с точностью до 1 мм. При наличии больших колоний по периферии зоны границы ее определяют по внутреннему краю этой группы колоний. Наличие колоний по всей зоне задержки роста при исключении загрязнения посторонней микрофлорой свидетельствуют о гетерогенности популяции исследуемого штамма.

Оценка результатов производится по таблице 3.6 с отнесением штаммов к чувствительным или устойчивым в отношении антибактериального препарата. В таблице так же указаны значения МПК, коррелирующих с диаметром зон задержки роста вокруг диска с антибиотиком. В случае необходимости МПК антибиотика вычисляют по уравнению регрессии, подставив в него значение величины зоны задержки роста.

Пример расчета минимальных подавляющих концентраций (МПК) препаратов при величине диаметра стерильной зоны 20 мм:

     20 = 24,7 - 2,1x
     2,1x = 24,7 - 20 или 2,1x = 4,7
     x = 4,7: 2,1 = 2,2
     следовательно log2  МПК около 2

 

 

Шкала для перевода значения log МПК в МПК

2

МПК в
мкг/мл
0,032 0,063 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 16 32 64 1,28
Величина
х или
log2 МПК
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7

 

Таблица 3.6

 

Пограничные (критические) значения диаметров зон задержки роста,
их корреляция с МПК и уравнения регрессии для определения
чувствительности к антибиотикам вибрионов

 




Антибиотик

Содержа-
ние ан-
тибиоти-
ка в
диске,
мкг
Пограничные значения

Уравнение
регрессии
диаметров зон задержки
роста (в мм) для штам-
мов
МПК (в мкг/мл
для штаммов)
устой-
чивых
умерен-
но-устой-
чивых
чувст-
вите-
льных
устой-
чивых
чувст-
вите-
льных
Тетрациклин 30 16 17-21 22 12 4 y=24,7-2,1x
Левомицетин 30 17 18-20 21 16 8 y=24,7-1,4x
Ампициллин 30 14 15-18 19 32 8 y=23,1-1,7x
Стрептомицин 30 16 17-20 21 16 6 y=24,1-1,6x
Неомицин 30 16 17-20 21 32 8 y=23,0-1,2x
Канамицин 30 16 17-20 21 24 6 y=23,1-1,3x
Гентамицин 10 17 18-19 20 6 4 y=21,3-1,0x
Полимиксин М 300 ЕД 9 10-12 13 50
ЕД/мл
- y=20,9-1,9x
Эритромицин 15 20 21-25 26 8 2 y=26,2-1,5x
Рифампицин 5 19 20-24 25 8 2 y=26,7-2,1x

1.6.7.2. Метод серийных разведений в агаре

     Для определения  используют  сухой  питательный  агар  (АГВ),  сухой
щелочной   агар   на   основе   ферментативного   пептона   с   дрожжевым
экстрактом (Московский НИИВС им.Мечникова), сухой щелочной дрожжевой агар
(НИИВС          Ставропольский). Навеску антибактериального препарата или
содержимое  флакона  растворяют  в  дистиллированной  воде  и      случае
необходимости дополнительно разводят с  таким  расчетом,  чтобы  основной
раствор содержал 2000 ед. или мкг  в  1  мл.  Для  растворения  некоторых
препаратов   применяют   специальные   растворители:   для   рифампицина,
доксициклина и нитрофуранов - диметилформамид, левомицетин и  эритромицин
предварительно растворяют  в  минимальном  количестве  этилового  спирта,
добавляя до нужного объема дистиллированную воду. В случае  использования
таблетированных  форм  препаратов  таблетку  измельчают  и     растворяют
полностью или в целях экономии препарата взвешивают, делят величину  веса
на активность и получают поправочный коэффициент для определения величины
навески препарата, необходимой  для  приготовления  раствора  с  заданной
активностью. Например, таблетка эритромицина  с  активностью  100000  ед.
весит  16 мг  (160000 мкг).  При  делении  веса  на  активность  получаем
величину поправочного коэффициента       1,6, который определяет, что для
получения концентрации 2000 ед/мл в объеме 10 мл нужно взять  навеску  32
мг (2000 мкг/мл х 10 мл х 1,6 = 32000 мкг =  32     мг). Основной раствор
антибиотика  титруют  двукратно  в  физиологическом  растворе  отдельными
пипетками для получения ряда  концентраций,  в  10  раз  превышающих  те,
которые нужно получить в 1 мл агаровой  среды.  Затем,     1,5 мл каждого
разведения антибиотика выливают в стерильную чашку Петри, добавляя   13,5
мл расплавленного агара, тщательно перемешивают,  дают  застыть  агару  и
подсушивают. Для посева используют  3-4  часовые  агаровые  культуры  или
                                         8
взвеси шаровых культур в концентрации  10   м.кл./мл.   Посев  производят
петлей на секторы или штампом-репликатором. На одну чашку  можно  нанести
до 20-25 культур. Чашки инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С -  16-20
часов. Минимальную  подавляющую  концентрацию  определяют  по  наименьшей
концентрации ингибирующей рост культуры на поверхности агаровой среды. По
величине МПК оценивают  степень  чувствительности  испытуемых  штаммов  к
конкретным препаратам (таблица 3.7).

 

Таблица 3.7

 

Показатели пограничных значений минимальных
подавляющих концентраций для деления микроорганизмов на
группы по степени чувствительности к антибактериальным
препаратам в мкг/мл или ЕД/мл

 

Антибиотики и
химиопрепараты
Пограничные значения МПК, соответствующие:
чувствительным
культурам
устойчивым
культурам
Антибиотики
Азлоциллин <8 >64
Ампициллин <8 >32
Амикацин <16 >32
Бензилпенициллин <1 >8
Гентамицин <4 >8
Доксициклин <4 >8
Канамицин <16 >32
Карбенициллин <16 >32
Левомицетин <16 >32
Рифампицин <2 >16
Стрептомицин <6 >16
Сизомицин <3 >8
Тетрациклин <4 >16
Эритромицин <2 >8
Цефогаксим <8 >32
Цефалотин <8 >32
Химиотерапевтические препараты
Сульфаниламиды <256 >512
Сульфатон <2/38 >4/76
Триметоприм <8 >16
Налидиксовая кислота <15 >32
Ципрофлоксацин <4 >8
Метранидазол <4 >64
Нитрофуран <4 >128

1.7. Порядок контроля качества диагностических питательных сред

 

1.7.1. Готовые питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке с целью контроля качества приготовления на местах (сухие среды производственного выпуска) или определения их чувствительности, ингибирующих или консервирующих свойств (среды лабораторного изготовления).

1.7.2. Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae Р-1 (145) и Vibrio cholerae eltor M878, а также лаборатории особо опасных инфекций ЦГСЭН, ведомственных учреждений с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не 01 серогруппы.

1.7.3. Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая контрольный N ОБК и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.

1.7.4. При положительном результате контроля пробы соответствующая серия среды считается пригодной к реализации, причем серия производственного выпуска только при тех же условиях изготовления. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий средоварения, независимо 01 времени предыдущей проверки.

1.7.5. При положительном результате контроля производственной серии среды по истечении установленного времени хранения срок годности ее продлевают на 3 месяца.

1.7.6. Срок хранения готового щелочного агара 3 месяца, основного раствора пептона - 6 месяцев от времени проверки. По истечении этого срока среда подлежит дополнительному контролю ежемесячно.

1.7.7. Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходимо направить повторно на бактериологический контроль эту же серию сухой среды и образец новой варки из нее;

- при получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, считать данную серию сухой питательной среды пригодной и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления;

- при получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес института-изготовителя.

1.7.8. На проверку отправляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. На этикетке следует указывать название среды, номер серии, срок годности сухой среды и дату варки контролируемой. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.

1.7.9. Оптимальный срок проверки питательной среды 10-14 дней после приготовления.

1.7.10. Щелочной агар и основной раствор пептона, приготовленный из сухих питательных сред производственного выпуска, проверяют с использованием одной дозы (10 м.кл.) одного тест-штамма (Vibrio cholerae cholerae Р-1 145 или Vibrio cholerae не 01 9741).

1.7.10.1. Для контроля среды используют 3-х часовую культуру тест-штамма, выращенную на агаровой среде, разлитой в чашки за 30-40 мин. до посева 18-20 часовой агаровой культуры II-IV пассажа.

     1.7.10.2. Из  рабочей  культуры  готовят  взвесь  в    0,9% растворе
хлористого натрия рН (7,1 +- 0,1) концентрацией 1 млрд м.кл.  в  1  мл по
стандарту  мутности  5  единиц  ГИСК  им.Л.А.Тарасевича.   Приготовленную
суспензию последовательно разводят, перенося по 0,5 мл в      4,5 мл 0,9%
хлористого натрия до  концентрации  100  м.кл.  в  1  мл  (8-я  пробирка,
             -7
разведение 10  , см. табл.3.8).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка и речь идет о табл. 3.10 настоящей Инструкции

     1.7.10.3. Для контроля щелочного агара 10 м.кл. тест-культуры   (0,1
мл   из   разведения   10")   засевают   на   каждую   из   3-х     чашек
(свежеприготовленных и тщательно подсушенных) проверяемой  и  контрольной
                                           -6
среды и 1000 м.кл. (0,1 мл из разведения 10  ) только на  контрольную.  В
качестве последней используют заранее проверенный  качественный  щелочной
агар.  Посевной  материал  распределяют  шпателем  и  инкубируют      при
температуре (37 +- 0,5)°С в течение 12 часов.

1.7.10.4. Результат проверки оценивают по показателям прорастания колоний тест-культуры на проверяемой и контрольной среде с учетом фактической величины посевной дозы:

- проверяемые плотные питательные среды считают пригодными для выделения возбудителя холеры, если после 12 часов инкубации при температуре (37 +- 0,5)°С на всех чашках вырастают типичные по морфологии колонии, диаметром не менее 1 мм.

     1.7.11.  Основной   раствор   пептона   производственного   выпуска,
подлежащий проверке и используемый в качестве контрольной среды, разводят
до 1% концентрации, устанавливают рН (8,3 +- 0,1) и разливают в колбы или
флаконы по 100 мл в количестве 3 - для опытной и 6 - для контрольной.  Во
все рабочие объемы испытуемой и 3 объема  контрольной  среды  наносят  по
                                                               -7
10 м.кл.  тест-культуры (0,1 мл, пробирка N  8,  разведение  10  )  и  по
                                                -6
100 м.кл. (0,1 мл. пробирка N 7,  разведение  10  )  в  другие  3  объема
контрольной среды.
     1.7.11.1. Для  контроля  посевной  дозы  по         0,1 мл суспензии
                           -7     -6
тест-культуры разведений 10   и 10   (10 и 100 м.кл.) переносят на  чашки
контрольного щелочного агара (по 3 на каждую дозу равномерно распределяет
и инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С 12-14 часов.

1.7.11.2. Посевы в 1% пептонной воде инкубируют в течение 6 часов при температуре (37 +- 0,5)°С с последующим высевом из поверхностного слоя каждого петлей N 5 (5 мм) на агаровые пластинки контрольной среды и после выращивания при температуре (37 +- 0,5)°С 12-14 часов учитывают результаты:

- проверяемый основной раствор пептона следует считать пригодным для выделения возбудителя холеры, если из всех посевов 10 м.кл. тест-культуры в 1% пептонную воду с 6-часовой инкубацией на агаровых пластинках вырастают типичные по морфологии колонии диаметром не менее 1 мм;

- во всех посевах из контрольной накопительной среды должны вырастать типичные колонии диаметром не менее 1 мм в количестве единичных для посевной дозы 10 м.кл. и не менее 10 для дозы 100 м.кл.;

- основной раствор пептона следует признать непригодным для выделения возбудителя холеры, если при соответствии установленным требованиям величины посевной дозы и качества контрольных питательных сред колонии тест-культуры вырастают менее чем на 3 чашках или диаметром менее 1 мм;

- при несоответствии контрольных показателей исследование повторяют.

1.7.12. Бактериологический контроль щелочного агара и основного раствора пептона непроизводственного изготовления проводят по методике, указанной в предыдущем разделе с использованием 2 тест-штаммов (Vibrio cholerae cholerae P-1 145 и Vibrio cholerae eltor M-878) в дозах 10 и 100 м.кл. оценку результатов контроля для каждого тест-штамма проводят по критериям, предусмотренным для аналогичных сред производственного изготовления, проверяемых двумя дозами. Годными для выделения возбудителя холеры считаются среды, соответствующие установленным требованиям (1.7.10.4 и. 1.7.11.2.).

1.7.13. Бактериологический контроль питательных сред с ингибиторами посторонней микрофлоры, солевых консервантов, теллурита калия проводят в соответствии с "Инструкцией по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона" (1983 г.).

1.7.14. При осуществлении всех видов бактериологического контроля питательных сред обязательно соблюдать требования к тест-штаммам, порядок их хранения и подготовки рабочей культуры, определяемые вышеупомянутой инструкцией (1.7.13.).

1.7.15. Полиуглеводные среды, используемые для отбора колоний для идентификации, проверяют на местах с использованием штаммов холерных вибрионов не 01 кишечной палочки.

1.8. Обеспечение биологической безопасности в
лабораториях, выполняющих исследования на холеру

 

1.8.1. Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить лаборатории, имеющие разрешение:

- бактериологические лаборатории территориальных ЦГСЭН, лечебно-профилактических учреждений, ведомственных - на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

- лаборатории особо опасных инфекций ЦГСЭН (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственные - на проведение диагностических исследований на холеру;

- лаборатории противочумных учреждений - на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры;

- в условия эпидемиологических осложнений временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическими лабораториями территориальных ЦГСЭН, функционирующим в составе лабораторной службы очага, представляют решением территориальной санитарно-эпидемической комиссии.

1.8.2. Порядок получения разрешения для всех лабораторий определен "Санитарными правилами по безопасности работ с микроорганизмами "Часть I - "Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности" (1993 г.).

1.8.3. Организацию и выполнение диагностических исследований на холеру осуществляют в соответствии с требованиями, регламентированными:

- для бактериологических лабораторий территориальных ЦГСЭН, лечебно-профилактических и ведомственных учреждений - инструкцией "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР (1991 г.);

- для лабораторий особо опасных инфекций ЦГСЭН (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственных и противочумных учреждений - санитарными правилами "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности" (Москва, 1994 г,).

1.8.4. Для всех лабораторий правила обращения с культурами (в том числе холерных вибрионов) регламентированы в санитарных правилах "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности" (1995 г.).

1.8.5. Установленные правила биологической безопасности распространяются на все учреждения на территории Российской Федерации независимо от подчиненности.

1.8.6. Государственный санитарно-эпидемиологический надзор за соблюдением правил биологической безопасности в учреждениях возложен на органы и учреждения Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляемый:

- центрами Госсанэпиднадзора - на обслуживаемой территории;

- противочумными учреждениями ГСЭН РФ (Противочумный Центр, противочумные станции и противочумные научно-исследовательские институты), во взаимосвязи с областными (городскими, краевыми, республиканскими) ЦГСЭН - на курируемой территории.

1.8.7. Порядок контроля за обеспечением биологической безопасности в лабораториях очага холеры определяется решением территориальной санитарно-противоэпидемической комиссии.

2. Серологическая диагностика

 

Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке больных, переболевших, вибриононосителей, а также у вакцинированных специфические антитела: агглютинины, вибриоцидины, антитоксины.

У больных холерой на 5-7 день после начала заболевания появляются агглютинины и вибриоцидные антитела в высоких титрах. Титры антитоксинов нарастают более медленно.

Исследовать надо парные сыворотки с интервалом в 7-10 дней. Первая проба должна быть взята на 3-5 день болезни.

Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности или при работе в полевых условиях - из пальца. Из вены берут 1-5 мл крови и после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56 +- 0,5)°С 30 минут.

Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10-15 минут при 3000 об/мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при температуре (4 +- 0,5)°С. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл физиологического раствора (1 : 5).

При работе в полевых условиях несколько капель капиллярной крови из пальца наносят на лист простерилизованной писчей бумаги, подсушивают при комнатной температуре, помещают в пробирку и направляют в лабораторию. При исследовании кружки бумаги с каплями крови вырезают и заливают каждый кружок 0,9 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия (разведение (1 : 10) и после 3-4 часов экстрагирования в условия холодильника инактивируют 30 минут при температуре (56 +- 10,5)°С 30 и исследуют.

 

2.1. Определение агглютининов в сыворотке крови

 

2.1.1. Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции агглютинации. Исследуемую сыворотку разводят 1% пептонной водой (рН 7,5 +- 0,1) в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3-х часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге, или исследуют в 2-х рядах с культурами сероваров Огава и Инаба. В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 час в термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4 +- 0,5)°С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.

При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3-4 креста.

Результат исследования сыворотки больного при положительной реакции агглютинации в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее, чем 4-х кратное нарастание титров антител.

2.1.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с антигенным холерным эритроцитарным диагностикумом. РНГА предназначена для выявления полных антител в сыворотке крови. Это достаточно специфичная и чувствительная двухкомпонентная реакция. По чувствительности значительно превосходит реакцию агглютинации. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму холерному антигенному эритроцитарному.

2.1.3. Реакция нейтрализации антигена (РНАг) для выявления антител в сыворотке крови с использованием холерного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума. РНАг - высокоспецифическая трехкомпонентная реакция. Ее принцип заключается в специфической нейтрализации добавляемого антигена полными и неполными антителами, содержащимися в сыворотке, необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму холерному иммуноглобулиновому эритроцитарному.

При использовании системы реакций РНГА и РНАг отпадает необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные результаты.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-х кратное нарастание титров антител при исследовании парных сывороток в РНГА и РНАг.

2.2. Определение токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови

 

РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД) предназначена для определения в сыворотке больных холерой, вибриононосителей и привитых холероген-анатоксином антител, нейтрализующих холерный токсин. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5-6 день болезни, достигают максимума на 14-21 день, а затем их титры снижаются. Диагностическим титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160. Целесообразно исследовать парные сыворотки.

С помощью этой реакции можно также выявлять токсиннейтрализующие антитела в сыворотке крови больных и вибриононосителей, у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами 0139 серогруппы. Методика постановки РНГА с ЭХЭД прилагается к комплекту диагностикума.

2.3. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови (РВА).

 

                                                                       -1
Вибриоцины в крови больных обнаруживаются с 1-3 дня болезни в титрах 10
  -3                                      -4   -8
10   и достигают максимальных значений (10   10   к 10-12   дню). Принцип
метода во всех  его  вариантах  заключается  в  том,  что  в  присутствии
вибриоцидных антител не происходит размножения холерных вибрионов.
     При проведении серологических исследований  в  очаге,  обусловленном
возбудителем холеры определенного серовара,  в  реакции  используют  один
штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных -  два штамма
обоих сероваров.
                                                                       -4
     У переболевших титр вибриоцидных антител может  составлять  от  10
  -6                                          -4   -7
10   в первые 3-4 недели, а вакцинированных 10   10   и выше.

2.3.1. Определение вибриоцидных антител (РВА).

2.3.1.1. Материалы и оборудование:

- исследуемые сыворотки;

- инактивированные прогреванием 30 минут при температуре (56 +- 0,5)°С;

- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20;

- 0,9% раствор хлорида натрия рН(7,2 +- 0,1);

- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные, в S-форме, не чувствительные к комплементу;

- чашки Петри со щелочным агаром;

- лоток со льдом;

- термостат на (37 +- 0,5)°С.

2.3.1.2. Методика постановки реакции. Комплимент, разведенный физиологическим раствором 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного -10 перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10 , получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в физиологическом растворе, содержащую в 1 мл 10000-20000 м.кл. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой. Необходимы следующие контроли:

а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры;

б) контроль сыворотки (0,8 мл физиологического раствора, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры);

в) контроль культуры (0,9 мл физиологического раствора и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 час помещают в водяную баню или термостат при температуре 37 +- 0,5°С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения).

Через 1 час штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку с щелочным агаром рН(7,7 +- 0,1). Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18-24 часа в термостат при температуре 37 +0,5°С, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

В посевах из контрольных пробирок должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения.

2.3.1.3. Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента.

     Пример вычисления: при посеве  из  опытных  пробирок  с  разведением
            -1    -2    -3    -4    -5     -6     -7
сыворотки 10  , 10  , 10  , 10  , 10  ,  10  ,  10    и  т.д.  на  чашках
соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве
из пробирки  контроля  комплемента  также  после  часовой  инкубации  при
температуре 37 +- 0,5°С выросло 36 колоний,  50%  от  этого  числа  будет
оставлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15  колоний,  т.е.  меньше  50%  от
количества колоний в контроле (18), в следующей  -  30,  т.е.  более  50%
                                                                       -5
этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет  10
                                                                     -5
следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10  .

2.3.2. Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов. Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.

2.3.2.1. Материалы и оборудование:

- сыворотка крови, взятая из вены или пальца, инактивированная при 56 +- 0,5°С;

- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;

- комплемент, разведенный 1:20 1% пептонной водой, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;

- термостат на 37 +- 0,5°С.

     2.3.2.2. Методика постановки реакции. Комплемент, разведенный   1:20
1% пептонной  водой  с  сахарозой  и  индикатором  Андреде,  разливают  в
пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку  добавляют     0,05 мл исследуемой
сыворотки и после тщательного перемешивания переносят     0,5 мл смеси во
                                                             -8      -9
вторую пробирку,  из второй в третью и т.д. (до разведения 10  ,   10  ).
Готовят суспензию 18-20 часов  агаровой  культуры  холерного  вибриона  и
                                              3
разводят 1% пептонной водой до концентрации 10  м.кл.  в  1  мл.  Во  все
пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.

Постановку реакции сопровождают следующими контролями:

- 0,45 мл 1% пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки;

- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором +0,45 мл культуры - контроль комплемента;

- 0,45 мл 1% пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры;

- 0,45 мл 1% пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.

Через 7-8 часов проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизменным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.

Примечание. Тест вибриоцидных антител при холере, обусловленной вибрионами 0139 серогруппы, в связи с резистентностью их к комплементу не рекомендуется к использованию.

3. Организация лабораторных исследований на холеру

 

Лабораторные исследования на холеру проводят бактериологические и специализированные лаборатории центров Госсанэпиднадзора (ЦГСЭН), лечебно-профилактических, ведомственных и противочумных учреждений.

 

3.1. При осуществлении эпиднадзора

 

При осуществлении эпиднадзорабактериологические лаборатории городских и районных ЦГСЭН учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах с положительной реакцией на оксидазу. Такие культуры проверяют в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в слайд-агглютинации с холерными сыворотками 01, Отава, Инаба, RO и 0139.

3.1.1. При положительном результате немедленно сообщают в территориальные центры Госсанэпиднадзора и в противочумное учреждение. Окончательную идентификацию таких культур заканчивают прибывшие из указанных учреждений специалисты на месте или их немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

3.1.2. При отрицательном результате слайд-агглютинации:

- культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию.

3.1.3. Лаборатории особо опасных инфекций республиканских, краевых, областных, городских ЦГСЭН и ведомственных учреждений:

- выполняют полное диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру;

- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, вирулентность и токсигенность по регламентированным для этой группы лабораторией тестам, а также чувствительность к антибиотикам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред, холерных агглютинирующих сывороток и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделенных культурах холерных вибрионов 01 и 0139;

- в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется; в течение 5 дней после окончания идентификации передают культуры холерных вибрионов 01, 0139 независимо от объекта обследования, а также других серогрупп не 01, выделенных от больных;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

3.1.4. Лаборатории противочумных учреждений:

- проводят исследования, направленные на своевременное выявление случаев заболевания холерой, вибриононосительства, а также с целью мониторинга за контаминацией водоемов;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют вирулентность и токсигенность культур, с использованием комплекса регламентированных методов, принадлежность к фаговару, антибиотикочувствительность;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

- в установленном порядке передают с паспортами культуры холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории, в головной по проблеме "Холера" - Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Кроме того, паспорта на эти же культуры направляют в Российский противочумный Центр.

ГАРАНТ:

См. Перечень организаций, на базе которых функционируют специализированные коллекции микроорганизмов ПБА I-IV групп патогенности, утвержденный постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 28 августа 1995 г. N 14

3.1.5. Планирование лабораторной деятельности в этот период осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий, действующих директивных и инструктивных документов.

Регламентирование деятельности лабораторных исследований, включая нормирование затраты времени на конкретные виды исследований проводят в соответствии с "Нормами работы бактериологической лаборатории", утвержденных Минздравом СССР в 1966 г., "Методическими рекомендациями по организации лабораторных исследований на холеру" (1979 г.) и дополнений к ним, утвержденных Зам. Государственного санитарного врача России (1992 г.).

Среднее время, затрачиваемое на 1 анализ, выраженное в лабораторных единицах (10 минут), определяется суммой средних показателей времени для каждого вида исследований с учетом вероятной частоты встречаемости его в общем объеме анализов.

Предусмотрены следующие средние показатели затраты времени на 1 анализ (в лабораторных единицах) всеми сотрудниками лаборатории (врач-лаборант, санитарка), для разных групп анализов;

1. Полное исследование с идентификацией выделенной культуры по полной схеме:

от людей - 3,7;

из воды - 13,3.

2. Полное исследование с идентификацией выделенной культуры по сокращенной схеме:

от людей - 3,3;

из воды - 11,2.

3. Полное исследование с предварительной идентификацией культуры в слайд-агглютинации:

от людей - 2,5;

из воды - 9,5.

4. Идентификация культуры по полной схеме с определением чувствительности к антибиотикам методом диффузии в агар без проведения анализа - 21,2.

Указанные нормы предусматривают проведение исследований по полной схеме соответственно настоящей инструкции с доставкой материала в 1% пептонной воде.

В расчетах для других вариантов исследований, а также для подсчета затраченного времени на выполнение конкретных объемов исследований следует использовать абсолютные показатели по конкретным видам исследований (так же в лабораторных единицах):

     - без отбора колоний от людей                   - 2,5
            -"- из воды                              - 5,0
     - с отбором колоний без идентификации от людей: - 6,0
                из воды                              - 8,5
     - идентификация культур до рода                 - 10,0
                до вида                              - 18,0
     - определение чувствительности к шести
       антибиотикам методом дисков                   - 2,0
            -"- методом серийных разведений          - 6,0
     - контроль качества питательных сред (1 серии)  - 5,0
     - прием, регистрация и выдача результатов       - 0,75
     - приготовление питательной среды               - 0,25
     - изучение вирулентности культур                - 6,0

Персонал лабораторий, выполняющих исследования на холеру, должен быть подготовлен по вопросам лабораторной диагностики холеры, техники безопасности и обеспечен соответствующими инструктивно-методическими материалами.

Врачи и лаборанты противочумных учреждений и отделов особо опасных инфекций проходят подготовку на соответствующих курсах противочумных институтов, врачи и лаборанты бактериологических лабораторий и центров ГСЭН - на курсах и семинарах в лабораториях отделов особо опасных инфекций территориальных Центров ГСЭН или противочумных станций.

Усовершенствование врачей-бактериологов и лаборантов по микробиологии и лабораторной диагностике холеры проводят на специальных курсах усовершенствования.

Организация труда. Исследование на холеру материала от больных острыми кишечными заболеваниями проводят одновременно с исследованиями на другие инфекции. При этом каждый врач выполняет одновременно те и другие анализы или для исследований на холеру создается отдельная группа.

Профилактические исследования на холеру можно проводить в пределах рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред или с дежурствами по графику, анализы материала от подозрительных на холеру случаев заболевания или смерти при круглосуточной работе лаборатории.

3.2. В очаге холеры

 

Лабораторное обеспечение противоэпидемических мероприятий. Формирование лабораторной базы и порядок ее реализации в очаге холеры осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий по обеспечению противоэпидемической готовности (см. ч.1 настоящей инструкции). С учетом конкретной ситуации корректируют предусмотренный в плане порядок перепрофилирования лабораторных помещений, реализации расчетной мощности и кадрового обеспечения лабораторной базы.

3.2.1. Расчет мощности лаборатории. Мощность лаборатории это максимальное количество анализов, которое она может выполнить в сутки. Мощность лабораторной базы очага определяется суммой показателей мощности всех лаборатории очага.

Расчет производственной мощности лабораторной базы проводят совместно эпидемиологическое и лабораторное подразделения с учетом количественных показателей анализов для конкретных контингентов и объектов обследования с определением среднесуточного объема по следующей схеме:

/-----------------------------------------------------------------------\
| NN пп | Объекты     |Кол-во   | Кол-во   | Кол-во дней |  Среднее кол-|
|       | обследования|объектов | анализов | работы ла-  |  во анализов |
|       |             |         |          | боратории   |              |
|-------+-------------+---------+----------+-------------+--------------|
|   1   |      2      |   3     |     4    |      5      |        6     |
|-------+-------------+---------+----------+-------------+--------------|
|       |             |         |          |             |              |

 

В графе "Объекты исследования": 1. Больной холерой и вибриононосители (определяется ориентировочно 1:1); 2. Контактные с больными и вибриононосителями (1:4-5); 3. Больные ОКЗ; обследование на вибриононосительство декретированных и других групп населения; 5. Объекты внешней Среды (поверхностные водоемы, источники водоснабжения, хоз-бытовые стоки, пробы из окружения больного и вибриононосителя).

Планируемая мощность лабораторной базы (М) определяется как сумма показателей графы 6.

При планировании целесообразно исходить из следующих положений:

- общее количество анализов на одного больного холерой и вибриононосителя составляет 6;

- количество провизорно госпитализированных в день составляет удвоенное количество ежедневно регистрируемых в данном городе (районе) случаев острых кишечных заболеваний;

- среднее число анализов от провизорно госпитализированных составляет 3;

- количество лиц, подлежащих обследованию на вибриононосительство, определяется противоэпидемической службой очага;

- продолжительность работы лабораторий с полной нагрузкой в очаге определяется сроками его ликвидации.

Объем и продолжительность работы лабораторной базы после ликвидации очага холеры рассчитывают дополнительно в соответствии с конкретными задачами, определяемыми противоэпидемической службой.

Необходимо предусмотреть планирование обследований (в сутки) по контингентам и четкое регулирование нагрузки лабораторий в соотстветствии с их расчетной мощностью.

Противоэпидемическая служба при планировании обследования населения в очаге обязана учитывать фактическую мощность лабораторной базы.

Расчетная мощность лаборатории может быть превышена (иногда) не более чем на 20%. Дальнейшее ее превышение неизбежно ведет к снижению качества исследований или требует изменения методики и соответственно увеличения срока проведения анализа.

В составе лабораторной службы должен быть выделен ответственный за регулирование нагрузки лабораторий.

В зависимости от территории очага, объема исследований и имеющихся возможностей лабораторная база очага может состоять из одной, двух или более лабораторий.

Наиболее целесообразным и удобным является следующее распределение анализов между лабораториями по контингентам с учетом особенностей их исследования:

- анализы из холерного и провизорного госпиталей, изолятора и обсерватора;

- анализы от остальных групп населения на вибриононосительство;

- исследование объектов внешней среды. Указанные группы анализов целесообразно вести и учитывать раздельно, независимо от их распределения в одной или более лабораториях.

При большом объеме исследований основные питательные среды (агаровые, основной раствор пептона и полиуглеводные) готовят и контролируют централизованно в специально организованной лаборатории. Целесообразно в этой же лаборатории осуществлять разлив 1% пептонной воды по флаконам и пробиркам, доставляя их в лабораторию стерильными. Также целесообразно, а иногда и необходимо, организовать дополнительные формирования (стационарные или подвижные), обеспечивающие централизованную стерилизацию лабораторной посуды для всех очаговых лабораторий и обеззараживание посевов.

При работе в очаге нескольких диагностических лабораторий, идентификацию культур вибрионов в каждой из них проводят по сокращенной схеме (1.3.7.1.) или ограничиваются слайд-агглютинацией (1.3.6. и 1.3.7.2.).

Полную идентификацию холерных и других видов вибрионов, а также характеристику культур по чувствительности к антибиотиками и вирулентности, проводит специально организованная лаборатория или группа в составе одной из действующих лабораторий. Она же осуществляет контроль питательных сред. При необходимости в составе этой же лаборатории организуют группу серологических исследований.

Все диагностические лаборатории, работающие в очаге холеры, составляют лабораторную базу очага.

Лабораторная база и другие формирования, обеспечивающие работу лабораторий, представляют собой лабораторную службу очага холеры.

Пробоотборочные группы целесообразно организовывать в составе эпидемиологической службы. Обеспечение их необходимыми средствами для отбора проб осуществляет лабораторная служба.

Для оперативности руководства лабораториями начальник лабораторной службы имеет заместителя (или помощника) по материально-техническому обеспечению лабораторной службы. Во главе каждой лаборатории назначается заведующий. При этом безусловно желательна приближенность лабораторий к стационарам, которые они обслуживают.

Менее удобным следует считать 2-й принцип организации лабораторной службы в очаге холеры - распределение анализов по территориальному признаку. В этом случае за каждой из очаговых лабораторий закрепляется определенная группа районов. При этом каждая лаборатория, в зависимости от распределения по районам очаговых стационаров, может получать от 1-го до 3-х указанных выше групп анализов. Наиболее рациональным по производительности следует считать принцип централизации лабораторных исследований в очаге холеры.

3.2.2. Расчет потребности в кадрах

Существенной особенностью работы лабораторий в очаге холеры является необходимость круглосуточной и ежедневной работы лабораторий. Предлагается следующая формула расчета потребности в кадрах, необходимых для реализации расчетной производственной мощности лаборатории в очаге холеры:

 

         Р х С                   М х Н
     М = -----               С = -----
          Нср                      Р

 

М - производственная мощность лаборатории (к-во анализов в сутки),

Р - средняя продолжительность работы 1-го сотрудника в сутки (часы);

С - общее число сотрудников лаборатории;

Нср - норма времени на 1 анализ (человеко-час).

Под нормой времени здесь принята сумма средних показателей рабочего времени врача, лаборанта, санитарки, необходимого для качественного выполнения одного анализа в условиях рациональной организации труда.

Для удобства расчета показатель времени вычисляют как сумму средних показателей времени, затрачиваемого на производство анализа - на основные манипуляции, вспомогательные, подготовительно заключительные работы и личные нужды.

Следует иметь в виду зависимость нормы времени анализа от производственной мощности лабораторий - чем больше мощность лаборатории, тем больше (при правильной организации труда) возможности увеличения производительности за счет максимальной дифференциации выполняемых операций и экономии времени на вспомогательных и подготовительно-заключительных работах.

При расчете мощности лаборатории учитываю, что сотрудники лабораторий в очаге холеры не выполняют внелабораторную работу, как это имеет место в обычное время.

При таком расчете нормы времени одного анализа показатель Р (средняя продолжительность времени работы одного сотрудника в сутки) можно учитывать полностью, т.е. как 100%. Величина показателя Р определяется в зависимости от принятого графика 2-х или 3-х сменной работы лаборатории в сутки. Показатели Нср для анализов от людей (Нл) и проб воды (Нв) существенно различаются за счет удвоенного количества анализов для воды (1 проба - 2 анализа) и сравнительного преобладания числа анализов, требующих отбора колоний с последующей дифференциацией.

Соответственно для лабораторий, сочетающих эти виды анализов, расчет производится по формуле:

 

                             (Мл х Нл) + (Мв х Нв)
                         С = ---------------------
                                     Р

 

Показатель Нср для анализов пищевых продуктов, смывов и др. приравнивается к анализам от людей.

При расчете потребности кадров для таких лабораторий следует считать, что анализы проб воды в показателе производственной мощности (М) для очаговых лабораторий составляют не более 20%.

При наличии обосновывающих данных расчет конкретизируют:

Значение Нср при массовом исследовании на холеру:

Объекты
исследования
Производственная мощность (м)
<100 >100 >200 >300 >500 >1000
Люди 0,45 0,40 0,35 0,30 0,23 0,2
Вода 1,40 1,20 1,0 0,9 0,75 0,6

 

     При этом следует принять за оптимальное соотношение врач лаборант  -
санитарка при М = 200-500 как 1:2:1. При М = 500-3000 как     1:3:3 и при
М = 3000 как 1:4:4.

Указанные нормы времени на один анализ не предусматривают работу лабораторий средоварения. Потребность в кадрах для лаборатории средоварения определяется дополнительно в зависимости от исходного продукта приготовления основных сред (полное средоварение, приготовленное приготовления из сухих готовых сред и т.д.).

Расчет потребности лабораторных работников для осуществления контроля питательных сред определяется не только в зависимости от потребности в средах для расчетного объема лабораторных исследований, но и от производственной мощности емкостей для средоварения.

В соответствии с расчетной мощностью лабораторий, входящих в состав лабораторной службы, определяют потребность в лабораторных работниках для каждой из них. Потребность лабораторной базы очага в кадрах определяется суммой этих показателей для каждой из лабораторий. Производить такой расчет, исходя из мощности всей лабораторной базы нельзя, т.к. сумма лабораторных работников, необходимых для работы в очаге нескольких лабораторий будет больше, чем для одной, производственная мощность которой равна сумме мощностей этих лабораторий. Поэтому безусловно более целесообразным является организация меньшего числа лабораторий с большей мощностью.

Централизация лабораторных исследований в очаге холеры позволяет также наиболее эффективно использовать привлеченные мало квалифицированные по этой инфекции кадры лабораторных работников за счет максимальной дифференциации выполняемых операций.

3.2.3. Организация труда

Мощность лабораторий с соответствующим ей количеством лабораторных работников возможно обеспечить лишь при осуществлении рациональной и четкой организации труда каждого сотрудника лаборатории.

Максимальная производительность труда лаборатории может быть достигнута в результате предельно узкой специализации выполняемых операций.

В 1-й день работы лаборатория, полностью укомплектованная, может выполнить не более 50% своей расчетной мощности, во 2-й - 75% и только с 3-го дня можно считать ее способной полностью реализовать свою мощность.

Распределение обязанностей. В каждой лаборатории должны быть созданы следующие функциональные подразделения:

- группа приема материала;

- группа пересевов;

- группа просмотра посевов и отбора колоний;

- группа идентификации и ускоренной диагностики;

- группа обеззараживания материала;

- группа мойки посуды, заготовки и стерилизации;

- группа разливки сред и подготовки их к посевам;

- группа регистрации;

- группа материально-технического обслуживания.

Группа приема материала. Работает в составе лаборантов и помощников. При приеме материала проверяют правильность транспортирования материала, направляющий документ к нему, соответствие данных направления с фактическим количеством доставленных проб. При приемке нативного материала делают посев на чашки и 1-ю пептонную воду. Производят соответствующую первичную регистрацию.

Группа пересевов состоит из лаборантов, хорошо владеющих методикой посева. Старший в группе, принимая смену, совместно с передающим ее, уточняет график пересевов, составленный предыдущей сменой. Производят пересевы с 1 п.в. на чашки, записывают в график время высева и время просмотра чашек и т.д. Выполнивший работы ставит в графике свою подпись.

Заведующий лабораторией или старший по смене назначает ответственного, который следит за четким выполнением графика работы с посевами.

 

Примерная форма графика работы с посевами

 

Дата и время
выполнения
1 этапа
исследования
NN
анализов
Объект
исследо-
вания
Дата и время
выполнения
следующего
этапа
Вид
исследо-
вания
Время
выполнения
и подпись

 

Группа просмотра посевов и отбора колоний состоит из опытных врачей и лаборантов и осуществляет работу, предусмотренную для IV этапа исследований (см. раздел 1.2.1.).

Группа идентификации и ускоренной диагностики состоит из квалифицированных врачей и лаборантов. В ее задачу входит проведение ускоренных методов диагностики и идентификация выделенных культур по сокращенной или полной схеме в зависимости от функциональных задач лаборатории и структуры службы в очаге.

Ускоренную диагностику тем или иным методом проводят в соответствии с отметкой в направлении или по указанию старшего по смене врача. Учет исследований ведут в специальном журнале.

Результаты полной идентификации регистрируют в журнале учета и характеристики выделенных культур. На культуры холерного вибриона составляют паспорт. Учет движения культур ведут по установленной форме. Образцы указанных учетных форм представлены в приложениях 3.3 - 3.6..

Группа обеззараживания материала состоит из квалифицированных средних медицинских работников, включая опытных автоклавщиков, прошедших специальную подготовку и имеющих удостоверение. Группа должна систематически обеспечивать своевременное и эффективное обеззараживание отработанного в лаборатории материала и спецодежды. При обеззараживании автоклавированием или кипячением регистрацию ведут в соответствующем журнале (приложение 3.7). При погружении обеззараживаемого материала в дезинфицирующие растворы на бак (кастрюлю и т.д.) наклеивают лейкопластырь с указанием времени погружения.

Эффективность обеззараживания постоянно контролируют.

Группа мойки, заготовки и стерилизации посуды состоит из опытных санитарок и проинструктированных помощников из числа неквалифицированного персонала, используемого для работы в очаге.

Из группы выделяется ответственный за выдачу посуды пробоотборочным группам.

Группа разливки сред и подготовки их к посевам состоит из одного опытного лаборанта и помощников из числа привлеченных к работе в очаге работников. При большой мощности лаборатории эта работа требует соответствующих условий - возможности растапливания агара в больших объемах большой площади разливочных столов, аппарата для мерного разлива жидких питательных сред, места для хранения различных питательных сред и др. Питательные среды из расчета не менее чем на 1/2 смены должны быть подготовлены предыдущей сменой. Объем работы группы каждой смены определяет старший лаборант в соответствии с планом работы. Старший по группе в начале смены получает конкретное задание на разлив сред с учетом обеспечения работы своей смены и первой половины следующей.

Группа регистрации может состоять из одного врача или другого специалиста с высшим образованием и лиц со средним образованием, не обязательно из числа медицинских работников. В обязанность группы входит прием и регистрация поступающего материала и своевременная выдача ответов. Регистрация лабораторных исследований в очаге холеры является одним из наиболее ответственных участков работы лаборатории.

Наиболее удобной формой учета анализов при массовых исследованиях является направление, получаемое в 2-х экземплярах, один из которых возвращается направляющему учреждению с результатами исследований, второй - заполняется и подшивается в папку. Формы такого учета даны в разделе 3.3.2.

ГАРАНТ:

По-видимому, в предыдущем абзаце речь идет о приложениях 3.1. и 3.2.

Формы и порядок срочного сообщения в штаб о положительных результатах исследования устанавливается на месте.

Регистраторы ежедневно составляют сведения о проделанной работе за сутки.

Для удобства ведения учета отсчет времени суток начинают с начала работы утренней смены. Сведения о проделанной работе составляют ежедневно по прилагаемому в приложении 3.8. нарастающим итогом и передают в назначенное время начальнику лабораторной службы очага. Начальник лабораторной службы очага по сведениям, получаемым от каждой лаборатории, составляет и передает в штаб очага данные по лабораторным исследованиям в очаге за истекшие сутки. При ликвидации очага последняя сводка дает исчерпывающие данные по объему работы каждой лаборатории и лабораторной службы в целом.

Группа материально-технического и хозяйственного обеспечения лаборатории состоит из старшего лаборанта, несущего материальную ответственность за имущество, хозяйственного работника, специалиста по оборудованию, электрика и санитарок для уборки помещений, стирки и др. Учитывая всю важность бесперебойной работы лаборатории, необходимо систематически осуществлять профилактический осмотр действующей аппаратуры, состояние электросети, а также системы водопровода и канализации.

Количественный состав групп функционального подразделения определяется объемом выполняемых исследований. При небольшой мощности лаборатории функциональные обязанности персонала не могут быть распределены с такой же детализацией как в лабораториях с большой мощностью, следовательно, число групп будет меньше, а обязанности их соответственно объединяются.

Вместе с тем в лаборатории с большой мощностью, выполняющей исследования от различных контингентов, можно работать с дополнительным распределением функциональных обязанностей по объектам обследования. Так, группы приема материала, пересевов и просмотра чашек, выполняющие определенные анализы (из холерного госпиталя и изолятора, из провизорного госпиталя, на вибриононосительство, объекты внешней среды) могут работать раздельно. Примерное распределение лабораторных работников по функциональным группам дано в таблице 3.9.

Организация круглосуточной работы. В очаге холеры все лаборатории работают круглосуточно. Это диктуется необходимостью предельного сокращения времени на проведение каждого анализа и потребностью выполнения большого объема исследований с использованием минимального количества лабораторий. В соответствии с поставленными задачами в лабораториях организуют сменную работу. При этом наиболее удобной является 3-х сменная работа пяти бригад, работающих 36 часов в неделю. В зависимости от удобства переезда сотрудников, время работы смен распределяется различно.

При составлении графика работы бригад в зависимости от мощности лаборатории, такие функциональные подразделения, как группа просмотра посевов, идентификации культур и ускоренной диагностики, а в конкретных условиях и некоторые другие, следует включать только в дневную и вечернюю смены.

Для руководства работой в смене назначается старший врач, ответственный за работу всей смены. При смене бригад каждая группа четко передает следующей начатые исследования и учет их.

 

Таблица 3.9.

 

Примерное распределение работников по функциональным
группам в лаборатории мощностью 1000 анализов в сутки
(700 - от людей и 300 - воды) при 36-часовой неделе

 

NN
пп
Функциональная группа Врачи Лабо-
ранты
Сани-
тарки
1. Группа приема материала - 7 -
2. Группа пересевов - 6 -
3. Группа просмотра посевов 7 3 -
4. Группа идентификации и ускоренной
диагностики
7 9 -
5. Группа обеззараживания - 5 -
6. Группа мойки, стерилизации и
подготовки посуды
- 3 22
7. Группа разливки сред - 8 -
8. Группа регистрации 1 3 -
9. Группа материально-технического
обеспечения и хозяйственных работ
(не считая специалистов по оборудо-
ванию, электрика, сантехника и т.д.)
- 1 8
  Итого: 15 45 30

3.2.4. Материально-техническое обеспечение лаборатории

Расчет потребности в оборудовании, лабораторной посуде, спецодежде, питательных средах и диагностических препаратах проводят с учетом норм их расходования на 1 анализ (таблица 3.10.).

Примерный табель оснащения лаборатории мощностью 200, 500 и 1000 анализов на холеру с продолжительностью работы 30 дней дан в приложении 3.3. В соответствии с табелем определяют наличие и подсчитывают дополнительную потребность перечисленных в табеле наименований и составленную заявку срочно передают в штаб.

 

Таблица 3.10.

 

Нормы расходования диагностических препаратов и
питательных сред на 1 анализ при исследовании на холеру

 

NN
п/п
Наименование расходуемых препаратов
и сред
Ед.
изм
Нормы расходования
абсолютные
с полным
исслед.
средние
при массо-
вом иссле-
дов.
I. Диагностические бактерийные препараты
1. Холерная агглютинирующая сыворотка
"01" серогруппы
мл 0,2 0,015
2. Холерная агглютинирующая сыворотка
"Огава"
" 0,2 0,01
3. Холерная агглютинирующая сыворотка
"Инаба"
" 0,2 0,01
4. Холерная агглютинирующая сыворотка RO " 0,1 0,015
5. Холерные диагностические фаги:      
  холерный " 0,1 0,002
  эльтор " 0,1 0,002
6. Холерная люминестирующая сыворотка " 0,03 0,0005
7. Холерная сыворотка 0139 серогруппы " 0,05 0,025
II. Питательные среды
1. Агар-агар г 0,5 0,01
2. Агар щелочной: готовый мл 100 50
  сухой г 5 2,5
3. Среда элективно-дифференциальная для
выделения холерных эмбрионов (сухая
СЭДХ)
г 3,0 3,0
4. Агар мясо-пептонный рН 7,2 мл 25 15
5. Бульон мясо-пептонный мл 2,0 0,2
6. Основной раствор пептона      
  а) анализ от людей - 10% " 10,0 5,0
  сухого г 2,0 1,2
  б) анализ воды - 10% мл 110 110
  сухого г 20,0 20,0
6. Сахароза " 0,5 0,15
7. Манноза " 0,5 0,001
8. Арабиноза " 0,05 0,001
9. Лактоза " 0,05 0,15
10. Глюкоза " 0,1 0,01
11. Инозит " 0,5 -
12. Салицин " 0,5 -
13. Дульцит " 0,5 -
14. Теллурит калия:      
  а) анализ от людей " 0,001 0,001
  б) анализ воды " 0,0015 0,015

4. Питательные среды для выделения и идентификации холерных вибрионов

 

4.1. Транспортные среды:

 

- 1% пептонная вода, рН 8,5 +- 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);

- 2% раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 2 мин при 0,7 атм.

4.2. Среды обогащения

 

4.2.1. Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

     Пептон                                 - 100 г
     Калия нитрат                           - 50 г
     Натрия карбонат                        - 1 г
     карбонат натрия                        - 25 г
     Дистиллированная вода рН 8,4 +- 0,2.   - 1 л

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5 +- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1 атм.

Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

Основной пептон сухой представляет собой смесь сухих компонентов согласно оригинальной прописи среды. Питательную основу его составляют ферментативный пептон и дрожжевой экстракт. Навеска препарата и способ приготовления среды указаны на этикетке (Московский НИИ им.Мечникова).

4.2.2. 1% пептонная вода. Для получения 1% пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,4+0,2 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 минут при давлении в 0,7 атм.

1% пептонную воду можно готовить и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же как и основного пептона.

4.2.3. Элективные среды накопления.

Пептонная вода с теллуритом калия. В 1%-ную пептонную воду (рН 8,5 +0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1% раствор теллурита калия.

Срок хранения рабочих растворов 7 дней, а питательных сред с теллуритом - не более 48 часов при условии содержания их в холодильнике.

4.3. Плотные среды для выделения холерных вибрионов

 

4.3.1. Щелочные среды.

Щелочной мясо-пептонный агар:

     Мясная вода                            - 1 л
     Пептон                                 - 10 г
     Натрия хлорид                          - 5 г
     Агар-агар рН 8,0 +- 0,2.               - 20 г

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20% раствором едкого натра до рН 8,3 +- 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30-40 минут, а затем при 1 атм 20 минут. Если мясо-пептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.

Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2-3 часа оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре 43+-2°С, лучше время отстоя продлить до 18-20 часов. В это время грубые частицы выпадают в осадок и агар осветляется. Для предотвращения быстрого остывания среды посуду с агаром плотно обертывают одеялами. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сифоном или через край медленно сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, не подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации сотовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 0,7 атм 20 мин.

Щелочной агар сухой на основе ферментативного пептона с дрожжевым экстрактом (Московский НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова).

Агар - щелочной сухой - на питательной основе из казеинового или дрожжевого гидролизата (Иркутский противочумный институт).

Агар - щелочной дрожжевой сухой - на питательной основе из гидролизата кормовых дрожжей, полностью растворимый (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток).

4.3.2. Элективные среды

- СЭДХ - питательная среда для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальная (сухая):

     Пептон Д                               - 6,0 г
     Aгap                                   - 10 г +- 2,0
     Натрия хлорид                          - 8,0 г
     Натрия карбонат                        - 1,0 +- 0,2
     Препарат "ПТ"                          - 2,0 +- 0,6
     Бромтимоловый синий                    - 0,04
     Сахароза рН 8,8 +- 0,2.                - 20,0

Приготовление: весь препарат размешать в 1 л дистиллированной воды или взять навеску его - из расчета на необходимый объем среды и также размешать в дистиллированной воде. Смесь оставить набухать 15-20 минут, довести до кипения и кипятить 5 мин до полного растворения агара. Питательную среду без фильтрации и стерилизации разливают в стерильные чашки Петри, которые при необходимости можно хранить в холодильнике при +6 +- 2°С не более 3-х дней. Чашки перед использованием подсушивают и посев делают петлей, чтобы получить рост в виде изолированных колоний.

Агар TCBS - сухая среда для диагностики холеры (рН 8,7 +- 0,1) выпускается фирмой "Дифко" (Детройт, штат Мичиган, США) и фирмой "Оксоид" (Лондон).

На 1 л дистиллированной воды берут определенную навеску сухой среды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не стерилизуя, разливают в чашки Петри.

Среда Монсура в модификации Т.Н.Донской и Л.Ф.Зыкина (1969):

     1,5%-ный агар Хоттингера               - 1 л
     Желатина                               - 50 г
     Желчь бычья                            - 50 мг.

Устанавливают рН - 8,4 +- 0,2. Среду стериализуют текучим паром или при давлении 0,5 атм. в течение 15 минут. Перед использованием добавляют теллурит калия в концентрации 1:100000.

4.4 Среды для идентификации вибрионов

 

4.4.1. Среды с углеводами.

Лактозо-сахарозная среда:

     Пептон                                 - 5 г
     Натрия хлорид                          - 5 г
     Лактоза                                - 10 г
     Сахароза                               - 1 г
     Агар-агар                              - 10 г
     Индикатор Андреде                      - 40 мл
     Вода дистиллированная рН 7,3 +- 0,1.   - 1л

Среду варят, фильтруют и разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 минут. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк (по типу среды Ресселя). Среда светлая.

При отсутствии пептона среду готовят на 1-1,3%-ном агаре Хоттингера (с аминным азотом 50-60 мг%) или другом питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях и индикатор Андреде в количестве 2%.

Среда Клиглера:

     1,5-1,7%-ный мясопептонный агар
     или агар Мартена (рН 7,7+-0,1)         - 1 л
     Лактоза                                - 10 г
     Сахароза                               - 10 г
     Глюкоза                                - 1 г
     2%-ный раствор сернокислого
     закисного железа                       - 10 мл
     0,8%-ный раствор тиосульфата натрия    - 10 мл
     0,4%-ный раствор сульфата натрия       - 10 мл
     1%-ный раствор фенолового красного     - 24 мл
     рН 7,3 +- 0,1

В начале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +- 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 минут при давлении 0,5 атм и скашивают по типу среды Ресселя. рН готовой среды 7,3 +- 0,1, цвет красный.

Среда Ресселя: готовится как и лактозо-сахарозная среда, но вместо сахарозы берут глюкозу, в том же количестве.

Среда Гисса:

     Пептон                                 - 10 г
     Натрия хлорид                          - 5 г
     Углевод                                - 5-10 г
     Дистиллированная вода                  - 1 л
     Индикатор Андреде                      - 10 мл
     или 1,6%-ный раствор
     бромтимолового синего                  - 1 мл
     рН 7,3 +- 0,1.

К 1% пептонной воде (рН 7,3 +- 0,1) без селитры добавляют 0,5 - 1% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6% раствора бромтимолового синего на 100 мл среды. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин при 0,1-0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.

     Среда Хью-Лейфсона
     Пептон                                 - 2 г
     натрия хлорид                          - 5 г
     Двузамещенный фосфат калия             - 0,3
     Глюкоза                                - 10 г
     Бромтимоловый синий                    - 0,03
     Агар-агар                              - 3 г
     Дистиллированная вода                  - 1 л
     рН 7,1 +- 0,1

К воде добавляют пептон, хлористый натрий и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2-3 минуты. Смесь подщелачивают 20%-ным раствором едкого натрия до рН 7,4 +- 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-ного водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 минут. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый (рН 7,1 +- 0,1), но не желтый. При кислой реакции среда желтеет.

Бульон Кларка:

     Пептон                                 - 5 г
     Глюкоза                                - 5 г
     Двузамещенный фосфат калия             - 5 г
     Дистиллированная вода                  - 1 л

Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 минут.

Среда с крахмалом и индикатором. В 1%-ную пептонную воду для цветного ряда добавляют 1% растворимого крахмала и 1% индикатора Андреде. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 минут под давлением 0,5 атм. Среда светлая, при наличии кислоты краснеет.

4.4.2. Среда как изучение расщепления белка.

Желатина. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10-15 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 минут и затем раствориться при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45 +- 5)°С.

Устанавливают рН 7,1 +- 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-ный раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 минут до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5-8 мл в пробирки, стерилизуют дробно 3 дня по часу текучим паром или однократно при давлении 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.

4.4.3. Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот.

Среда пептонно-дрожжевая:

     Пептон                                 - 5 г
     Дрожжевой экстракт                     - 25 мл (сухой 3 г)
     Глюкоза                                - 1 г
     Натрия хлорид                          - 5 г
     Натрия карбонат                        - 0,1 г
     Бромтимоловый синий
     (0,1%-ный р-р в 20%-ном спирте)        - 45 мл (0,045 г сухого)
     Аминокислота                           - 10-20 г
     Дистиллированная вода                  - 1 л
     рН 6,4 +- 0,1,

Среда из сухих компонентов может быть приготовлена в сухом виде.

Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4 +- 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, так как микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией, в случае необходимости, реакцию среды исправляют 0,1% раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1-2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1-0,2 атм 20 минут. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.

4.4.4. Приготовление индикаторных бумажек для выявления образования индола и сероводорода:

а) Полоски фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным водным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.

б) Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца. Подсушивают на воздухе.

Полоски индикаторных бумажек помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска "а" краснеет, а при образовании сероводорода полоска "б" чернеет.

5. Способ отбора колонии вибрионов с помощью стереоскопического микроскопа в косопроходящем свете

 

Принцип метода заключается в том, что при просмотре колоний различных микробов под малым увеличением микроскопа или лупы при освещении их пучком света, косо падающим на поверхность агара, колонии приобретают способность светиться и кажутся окрашенными.

К стереоскопическому микроскопу МБС-2 или МБС-1 приспосабливают устройство для получения узкого пучка света и зеркало от микроскопа на подвижном шарнире для освещения чашки снизу под углом 45°С.

При величине угла падения луча света к поверхности агара в 40-50°С колонии вибрионов по своей окраске заметно отличаются от других микроорганизмов. Чашки с посевами просматривают после 12-18 часов инкубации.

Цвет колоний, выросших на щелочном агаре при косом освещении:

Микроорганизмы Цвет колоний
Холерные вибрионы Преобладает серо-голубой с оттенком
зеленовато-серым, синевато-зеленым, ре-
же - зеленый с верхним краем красно-бу-
рого или коричневого оттенка
Сальмонеллы Розовый оттенок
Шигеллы Розовый с фиолетовым оттенком
Кишечная палочка Ярко-красный
Протей Красный с фиолетовым оттенком

Приспособления для просмотра колоний в косопроходящем свете.

1. Столик стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 заменяют специальным приспособлением для освещения чашки снизу под углом 45. Источником света служит осветитель от микроскопа, на который надевают кожух с отверстием диаметром 5 мм против спирали лампочки для получения узкого пучка света. Узкий пучок света направляют в центр вогнутого зеркала, которое перемещается на подвижном шарнире поворотом винта в зависимости от необходимости угла падения света. Угол вычисляют по соотношению расстояния от зеркала до чашки, которое меняется произвольно, и расстояние от чашки до поверхности стола, остающегося неизменным.

Для удобства исследования осветитель и зеркало можно вмонтировать в ящик со стеклянной крышкой, на которую помещают чашку с посевами. Это дает возможность быстро находить нужный угол падения света, передвигая зеркало поворотом винта по вмонтированной шкале.

2. Приспособление, смонтированное из основных узлов стереоскопического микроскопа МБС-1 и прибора для счета колоний.

Из раструба верхней крышки прибора для подсчета колоний удалить оба стекла вместе с упорным кольцом и снять верхнюю крышку. Из скобы передней панели вывинтить вертикальную ось, после чего убрать диск со светофильтрами. Освободить два винта, прикрепляющие патрон лампочки освещения к кронштейну на задней панели. В крышку снизу вставить вертикальную штангу от узла лупы с таким расчетом, чтобы в рабочем положении прибора муфта с прижимным винтом оказалась на дне под кронштейном импульсного счетчика. В муфту зажать держатель с угловыми губками (из комплекта лабораторного штатива), предварительно укороченный до 110 мм. Держателем закрепить патрон с лампочкой в вертикальном положении. Крышку фиксировать винтами на своем обычном месте.

Штатив микроскопа МБС-1 вместе с бинокулярной насадкой отсоединить от столика и установить непосредственно на корпус прибора для счета колоний так, чтобы 3 сферических ножки основания штатива охватили раструб крыши прибора, а окно основания было обращено к наблюдателю. Подлежащие к просмотру чашки с посевами устанавливают над открытым окном. Нужную освещенность и угол падения света находят изменением положения лампы, которое достигается поворотом штанги, после чего последнюю фиксируют цанговым зажимом.

 

Утверждаю

Заместитель Председателя
Госкомсанэпиднадзора России

Г.Г.Онищенко

 

Первый Заместитель министра
здравоохранения и медицинской
промышленности России

А.Д.Царегородцев

 

-------------------------------------------------------------------------

*(1) Заполняется врачом-эпидемиологом совместно с врачом по коммунальной гигиене, врачом-бактериологом и др. необходимыми специалистами.

*(2) После выписки больного или вибриононосителя из стационара.

*(3) Норма расхода на 1 обработку.

*(4) Примечание: Перечисленный запас медикаментов и материалов обеспечивает достаточное количество жидкостей для внутривенного введения с последующим оральным введением раствора глюкосолана для лечения 20 больных холерой с тяжелым обезвоживанием и исключительное использование ОРС для остальных 80 больных.

 

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Получить доступ к системе ГАРАНТ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.


Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий (утв. Госкомсанэпиднадзором РФ и Минздравмедпромом РФ 9 июня 1995 г. N 01-19/50-11)


Текст инструкции официально опубликован не был


Инструкция разработана:


- Госкомсанэпиднадзор России: Г.Г. Онищенко, Е.А. Котова, В.Н. Садовникова.

- Минздравмедпром России: М.И. Наркевич, Ю.М. Федоров.

- Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт: Ю.М. Ломов, Б.Н. Мишанькин, Э.А. Москвитина, Г.М. Мединский, Л.С.Подосинникова, Л.Г.Воронежская, И.Я. Черепахина, В.П. Авроров, Б.Л. Мазрухо, Г.И. Кулов, Л.М. Смоликова, Е.Б. Данилкина.

- Российский противочумный центр: А.А. Кюрегян, Н.С. Огнева, Л.А. Калошина, А.Б. Тепляков.

- Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии: В.И. Покровский, В.В. Малеев.

- Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб": А.К. Адамов, А.С. Васенин, А.И. Кологоров, И.И. Щуркина, Т.В. Бугоркова.

- Иркутский противочумный институт: А.С. Марамович, А.Ф. Пинигин.

- Ставропольский противочумный институт: Г.М. Грижебовский, В.Н. Савельев.


Настоящая Инструкция утратила силу в связи с введением Методических указаний МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры", утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ 15 января 2002 г.