Приложение 6. Лабораторные методы определения свежести рыбы

Приложение 6

Лабораторные методы определения свежести рыбы

При обнаружении признаков несвежести рыбы проводят лабораторные исследования: бактериоскопию, определяют сероводород с подогреванием пробы и концентрацию водородных ионов (рН), содержание амино-аммиачного азота и продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью), ставят реакцию на пероксидазу и редуктазную пробу, проводят люминесцентный анализ. В необходимых случаях для характеристики пищевых и кормовых достоинств рыбы дополнительно определяют химический состав, биологическую ценность (безвредность, питательность), видовую принадлежность микроорганизмов и содержание влаги в мясе исследуемых рыб. В малооборудованных лабораториях для оценки доброкачественности рыбы ограничиваются бактериоскопией мазков-отпечатков, реакцией на пероксидазу или редуктазу, определением сероводорода, рН и безвредности рыбы.

Бактериоскопия. На предметных стеклах делают два мазка-отпечатка: один - из поверхностных слоев мышц, расположенных под кожей, другой - из мышечной ткани глубоких слоев мышц, находящихся около позвоночника. Приготовленные препараты красят по Граму. Под микроскопом подсчитывают среднее количество микроорганизмов в одном поле зрения.

Рыба свежая - в нескольких полях зрения микробов нет или единичные кокки и палочки в мазках из поверхностных слоев мышц. Препарат плохо окрашен, на стекле незаметно остатков разложившейся ткани.

Рыба сомнительной свежести - в мазках из глубоких слоев мышц 10-20, а в мазках из поверхностных - 30-50 микробов в одном поле зрения (диплококки, диплобактерии). Препарат окрашен удовлетворительно, на стекле ясно заметны распавшиеся волокна мышечной ткани

Рыба несвежая - в мазках из глубоких слоев мышц 30-40, а в мазках из поверхностных - 80-100 и более микробов в одном поле зрения (преимущественно палочковидных). Препарат хорошо окрашен, на стекле много распавшейся мышечной ткани.

Определение сероводорода с подогреванием пробы. В пробирку рыхло помещают 5-7 г фарша мяса рыбы. Под пробку закрепляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10%-ным щелочным раствором уксуснокислого свинца. Диаметр капли не более 5 мм. Бумажка не должна прикасаться к мясу и стенкам пробирки. Контролем служит пробирка с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой. Пробирки подогревают на водяной бане при температуре 48-52°С в течение 15 минут и после этого немедленно читают реакцию: рыба свежая - реакция отсутствует (бумага белая, как в контроле); рыба сомнительной свежести - на бумаге появляется слабо-бурое пятно (следы сероводорода); рыба несвежая - цвет капли на бумаге от бурого до темно-коричневого.

Определение рН. К 5 г фарша мяса рыбы добавляют 50 мл дистиллированной воды и настаивают в течение 30 минут при периодическом помешивании, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для исследования. Определяют рН потенциометром (рН-метром) или индикаторной бумагой. У рыбы свежей фильтрат слегка опалесцирует, рН до 6,9; у рыбы сомнительной свежести фильтрат слегка мутноватый, рН 7,0-7,2; у рыбы несвежей фильтрат мутный, запах неприятный, рН 7,3 и выше.

Определение содержания амино-аммиачного азота. В колбу емкостью 100 мл к 10 мл профильтрованной через фильтровальную бумагу водной вытяжки из мяса (1:4) добавляют 40 мл дистиллированной воды и три капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы нейтрализуют децинормальным раствором едкого натра до слабо-розового окрашивания. Затем в колбу добавляют 10 мл формалина, нейтрализованного по фенолфталеину до слабо-розовой окраски. В результате освобождения карбоксильных групп смесь становится кислой и розовый цвет индикатора исчезает. После этого содержимое колбы снова титруют децинормальным раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Так как 1 мл децинормального раствора едкого натра эквивалентен 1,4 мг азота, то количество миллилитров децинормального раствора едкого натра, пошедшего на второе титрование, умножают на 1,4 и получают в мг количество аммиачного азота в 10 мл фильтрата мясной вытяжки.

Пресноводная свежая рыба содержит в мясе до 0,69 мг амино-аммиачного азота; сомнительной свежести - 0,7-0,8 мг, а несвежая рыба - свыше 0,81 мг.

Метод определения продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью). В 200 мл коническую колбу Эрленмейера помещают 20 г фарша из спинных мышц рыбы, добавляют 60 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Колбу накрывают часовым стеклом и нагревают в течение 10 минут в кипящей водяной бане. Затем горячий бульон фильтруют через плотный слой бумажно-ватного фильтра в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если в фильтрате остаются хлопья белка, то его снова фильтруют через фильтровальную бумагу.

После фильтрации 2 мл бульона наливают в пробирку и добавляют три капли 5%-ного раствора сернокислой меди, встряхивают 2-3 раза и выдерживают 5 минут. Контролем служит бульон в пробирке без добавления сернокислой меди.

Бульон из мяса свежей рыбы слегка мутнеет, из рыбы сомнительной свежести - заметно мутный, а из рыбы несвежей характеризуется образованием хлопьев или выпадением желеобразного сгустка сине-голубого цвета.

Реакция на пероксидазу (бензидиновая проба). В бактериологическую пробирку вносят 2 мл водной вытяжки (1:10) из жаберной ткани (по А.М. Полуэктову) и добавляют 5 капель 0,2%-ного спиртового раствора бензидина. Содержимое пробирки взбалтывают, после чего вносят две капли 1%-ного раствора перекиси водорода.

Вытяжка из жаберной ткани рыб дает синюю окраску, переходящую в течение 1-2 минут в коричневую.

Вытяжка из жаберной ткани рыб сомнительной свежести дает менее интенсивную окраску и значительно позже переходит в коричневую (через 3-4 минуты).

Вытяжка из жаберной ткани несвежей рыбы не дает синей окраски, а непосредственно переходит в коричневый цвет (отрицательная реакция на пероксидазу).

Редуктазная проба. В бактериологическую пробирку вносят 5 г фарша из мяса рыбы, заливают двойным количеством дистиллированной воды, встряхивают и оставляют на 30 минут. Затем приливают 1 мл 0,1%-ного водного раствора метиленовой сини, пробирку энергично встряхивают для равномерной окраски фарша, заливают слоем вазелинового масла толщиной 0,5-1 см. Реакционную смесь помещают в термостат при 37° и периодически ведут наблюдение за обесцвечиванием экстракта. Чем быстрее произойдет обесцвечивание вытяжки из рыбы, к которой добавлен метиленовый голубой, тем больше содержится в ней фермента редуктазы (дегидразы), а следовательно, и больше микроорганизмов, его продуцирующих.

Оценка результатов

Время обесцвечивания	Кол-во микробов в 1 г мяса	Санитарная оценка рыбы
до 40 минут	и выше	недоброкачественная
40 минут - 2,5 часа		сомнит. свежести
2,5-5 часов или не обесцвечивается	до	свежая

Примечание: При учете результатов реакции сохранение синего кольца под слоем вазелинового масла в расчет не принимать.

Люминесцентно-спектральный анализ. Исследуют под люминесцентным микроскопом непосредственно кусочки глубоких слоев спинных мышц. Под действием ультрафиолетовых лучей с длиной волны 360-370 нм мышечная ткань только что убитых рыб флюоресцирует сине-голубоватым цветом, а капельки крови дают темно-коричневую окраску.

При хранении рыбы без воды в течение 10 часов при комнатной температуре (+18 +20°С) окраска мышечной ткани и крови приобретает более интенсивный оттенок.

У рыб сомнительной свежести мышцы светятся тускло-синеватым цветом с фиолетовым оттенком или серо-синеватым цветом со слабым желтоватым оттенком. Кровь флюоресцирует светло-коричневым цветом.

Мясо несвежих рыб светится тусклым сине-голубым цветом с желто-зеленоватым оттенком. Кровь имеет оранжевое свечение.

Определение безвредности (токсичности) и питательной ценности рыбы - проводят экспрессным микрометодом токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов, изложенным в приложении 3 настоящих Правил.

Определение содержания влаги в мясе рыбы. Содержание влаги определяют способом высушивания проб мяса в сушильном шкафу при 105°С до постоянного веса сухого вещества. С этой целью отвешивают пробы мяса по 5 г, помещают в предварительно взвешенные сухие чашки Петри и помещают в сушильный шкаф. На протяжении 2-3 дней проводят 3-4 взвешивания чашек Петри с пробами мяса. Чашки с пробами перед взвешиванием остывают в эксикаторах с концентрированной серной кислотой. Анализ считается законченным, если результаты двух последних взвешиваний не превышают предыдущих ( г).

Вычисляют влагу путем вычитания веса чашки с абсолютно сухой пробой от веса чашки с пробой до высушивания. Содержание влаги выражают в процентах в 100 г сырой ткани.

Определяют влагу каждой пробы в трех повторностях и за конечный результат принимают среднее.

Контролем для сравнения служат средние данные по содержанию влаги в мясе пресноводных рыб (78-79%), а более точным контролем являются результаты одновременного определения влаги в мясе только что убитых рыб того же вида и возраста, что и вынужденно исследуемые.

Чем выше общее количество воды в мясе рыбы, тем ниже ее качество. Такая рыба начинает быстро разлагаться.

Неживая рыба при хранении в воде легко впитывает (имгибирует) жидкость. Снулые карпы через 20 часов пребывания в воде увеличивают вес на 2-3%, растительноядные - до 5%. Увеличение веса рыбы на 1-2% за счет оводнения мышц отмечается у живых ослабленных рыб: больных, отравленных, утомленных, травмированных, выращиваемых в плохих гидрохимических условиях.

Идентификация токсинов клостридий перфрингенс реакцией гемолиза. С целью быстрого выявления и типизации токсинов клостридий перфрингенс можно использовать реакцию гемолиза (П.В. Микитюк, 1972). Метод основан на способности гемотоксинов клостридий перфрингенс вызывать гемолиз эритроцитов барана.

Сущность метода состоит в том, что при наличии в исследуемом материале или культуре токсинов клостридий перфрингенс, происходит их нейтрализация при добавлении гомологичных антитоксических сывороток и гемолиз эритроцитов не наступает. Метод позволяет определить наличие гемотоксина клостридий перфрингенс и установить его специфичность нейтрализацией типоспецифическими антисыворотками.

Пробы отбирают согласно ГОСТу 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа". Стерильно взятую навеску 10 г подвергают в стерильных условиях гомогенизации (или растирают в стерильной ступке). Из приготовленного гомогената делают посевы на среду Китт-Тароцци и готовят суспензию на стерильном физрастворе для постановки реакции гемолиза по схеме.

Берется ряд агглютинационных пробирок (количество пробирок зависит от объема работы), в которые разливают по 0,5 мл 2,5%-ной взвеси отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана. В одну из пробирок добавляют 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл физиологического раствора (контроль), а в другие - 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл соответствующей антитоксической сыворотки типов А, В, С, Д, - выпускаемых в нашей стране. Смесь исследуемой суспензии с антисывороткой для нейтрализации гемолизина вначале выдерживают в течение 30 минут в термостате при 37°С. рН реакционной смеси 7,0.

После смешивания всех компонентов в реакции гемолиза пробирки встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37°С, а затем выдерживают 24 часа при комнатной температуре.

Результаты реакции регистрируют через 2 и 24 часа. Интенсивность ее оценивают крестами.

Выращенные 18-часовые культуры клостридий перфрингенс центрифугируют при 6000 об/мин и с полученным центрифугатом ставят реакцию гемолиза на выявление токсина по описанной выше методике. Для контроля в реакции нейтрализации можно использовать противоботулинические сыворотки.

О наличии токсина клостридий перфрингенс и его типовой принадлежности судят по отсутствию реакции гемолиза (нейтрализованный токсин реакции гемолиза не вызывает).

Антитоксическая сыворотка против клостридий перфрингенс типа А нейтрализует только токсин клостридий перфрингенс типа А; антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа Д нейтрализует только токсин типа Д; антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа В нейтрализует токсин клостридий перфрингенс типов А, В, С и Д; антитоксические сыворотки клостридий перфрингенс типов В и С взаимно нейтрализуют друг друга. Противоботулинические сыворотки не нейтрализуют токсины клостридий перфрингенс.

Метод очень прост по технике исполнения и может быть использован даже в недостаточно оборудованных лабораториях.

Схема постановки реакции гемолиза приведена в таблице.

Выявление токсинов клостридий перфрингенс реакцией гемолиза

Типы клостридий перфрингенс	Результат реакции гемолиза
	без сывороток	антитоксические сыворотки
		против клостридий перфрингенс				противоботулинические
		А	В	С	Д	А	В	С	Е
А	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++	++++
В	++++	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++
С	++++	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++
Д	++++	++++	-	++++	-	++++	++++	++++	++++

Обозначения: (++++) - полный гемолиз эритроцитов;

(-) - отсутствие гемолиза

Идентификация клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс люминесцентно-серологическим методом. Для экспрессной идентификации клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс рекомендуется люминесцентно-серологический метод (П.В. Микитюк, 1973).

В исследованиях используют непрямой метод люминесцирующих антител. Берут сухие ослиные против глобулинов кролика люминесцирующие сыворотки, изготовляемые Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. В качестве иммунных (промежуточных) используют противоботулинические и антиперфрингенс типоспецифические агглютинирующие сыворотки.

Мазки для обработки методом непрямой иммунофлуоресцентной окраски готовят непосредственно из мышц рыб (мазки-отпечатки) или из отмытых 2-3-суточных культур клостридий ботулинум и 16-18-часовых культур клостридий перфрингенс, выращенных на среде Китт-Тароцци.

После подсушивания на воздухе мазки фиксируют в метиловом спирте на протяжении 5-10 минут. Затем на препараты наносят гомологичные для каждого типа клостридий иммунные сыворотки в их рабочем разведении и помещают на 20 минут во влажную камеру при 37°С. После этого препараты промывают два раза по 10 минут 0,15% раствором поваренной соли (рН 7,2-7,4).

Обработанные на первом этапе мазки окрашивают 20 минут люминесцирующей антивидовой сывороткой в разведении 1:32 в условиях влажной камеры. В дальнейшем мазки тщательно промывают 0,15% раствором поваренной соли (рН 7,2-7,4), ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Приготовленные таким образом препараты просматривают под люминесцентным микроскопом МЛ-2 с использованием светофильтров ФС-1-4; СЗС-7-2; БС-8,2; запирающего светофильтра Т-2-Н; масляной иммерсии 90x1,25, окуляров , и , при силе тока на ПРЛ 4,5-5,5 ампера.

У всех типов клостридий ботулинум и перфрингенс, обработанных соответствующими компонентами непрямого метода иммунофлуоресцентной окраски, наблюдается специфическое (феномен "светящегося ободка") ярко-зеленое (++++) или зеленое средней яркости (+++) свечение вегетативных, споровых и спорообразующих форм клостридий. Наличие яркого светящегося ободка вокруг микробной клетки свидетельствует о специфичности реакции иммунофлуоресценции. У клостридий ботулинум типов А и В, обработанных перекрестно соответствующими сыворотками, отмечается свечение с одинаковой интенсивностью (++++) или (+++), в то время как у других типов клостридий ботулинум (С, Д, Е) и клостридий перфрингенс типов А, В, С, Д наблюдается специфическое свечение только при обработке гомологичными иммунными сыворотками.

Интенсивность и специфичность свечения клостридий не зависят от биохимической активности и токсигенности микроорганизмов. Свечения других видов микроорганизмов не наблюдается или различаются темные тени микробных клеток на серо-зеленом фоне (+ -).

Для того, чтобы получить положительный результат исследования, достаточно в поле зрения микроскопа 3-4 искомых микробных клеток. Однако лучшие результаты достигаются при центрифугировании суспензии с исследуемого материала с целью концентрации микроорганизмов (5000 об/мин).

С помощью люминесцентно-серологического метода продолжительность исследования на наличие и типизацию клостридий ботулинум и перфрингенс в мазках-отпечатках сокращается до 3-х часов, а с подращиванием на питательной среде Китт-Тароцци - до 48-72 и 16-18 часов соответственно, против 6-14 суток существующими классическими методами бактериологического исследования.