Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20634-2018 "Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина В12 методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2018 г. N 478-ст)

Infant formula and adult nutritionals. Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high performance liquid chromatography

МКС 67.050

Дата введения - 1 сентября 2019 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (АО "ВНИИС") совместно с Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Федеральным исследовательским центром питания, биотехнологии и безопасности пищи (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии") на основе собственного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. N 109-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Институт стандартизации Молдовы
Россия	RU	Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2018 г. N 478-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20634-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20634:2015 "Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина В₁₂ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("lnfant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)", IDT)

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения витамина В₁₂ в адаптированных смесях для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смесях для энтерального питания для взрослых (порошках, готовых к употреблению жидких продуктах и жидких концентратах) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 витамин В₁₂: Цианкобаламин или другие корриноиды, содержащие кобальт, обладающие биологической активностью витамина В₁₂, такие как аквокобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин и аденозилкобаламин, преобразуемые в цианкобаламин.

2.2 смесь для энтерального питания для взрослых (adult nutritional): Полноценный в питательном отношении специализированный пищевой продукт, изготовленный из молока, сои, риса, молочной сыворотки, гидролизата белка, крахмала и аминокислот в любом сочетании, содержащий или не содержащий интактный белок, употребляемый в жидком виде, который может являться единственным источником питания.

Примечание - Определение термина 2.2*.

------------------------------

* Определения терминов 2.2 и 2.3 взято из Codex Standard 72-1981.

2.3 адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста (infant formula): Заменитель грудного молока, специально изготовленный для того, чтобы полностью удовлетворять потребности в питании младенцев первых месяцев жизни до введения соответствующего дополнительного питания.

Примечание - Определение термина 2.3*.

------------------------------

* Определения терминов 2.2 и 2.3 взято из Codex Standard 72-1981.

3 Сущность метода

Цианкобаламин и другие корриноиды, содержащие кобальт, экстрагируют из пробы буферным раствором ацетата натрия (рН = 4,5 ед. рН), последние преобразуют в цианкобаламин с помощью цианида калия при 105 °С. Экстракт очищают и концентрируют на патронах для твердофазной экстракции с сорбентом - модифицированным С8 или С18 силикагелем, после чего анализируют методом эксклюзионной и обращенно-фазовой хроматографии. Количественное определение витамина В₁₂ проводят методом жидкостной хроматографии с детектированием в видимой области спектра при длине волны 550 нм.

4 Реактивы и материалы

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду или аналогичную по чистоте воду.

4.1 Кислота уксусная ледяная.

4.2 Ацетонитрил для ВЭЖХ.

4.3 Дриерит (осушающий агент, представляющий собой безводный сульфат кальция размером частиц 8 меш).

4.4 Этанол денатурированный.

4.5 Кислота муравьиная массовой долей основного вещества не менее 88 %.

4.6 Калий цианистый массовой долей основного вещества не менее 97 %.

4.7 Рибофлавин массовой долей основного вещества от 98 % до 102 %.

4.8 Натрий уксуснокислый безводный или трехводный.

4.9 Фермент така-диастаза*.

------------------------------

* Например, производства Accurate Chemical Со или аналогичная. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4.10 Триэтиламин для ВЭЖХ.

4.11 Витамин В₁₂ (цианкобаламин), первичный стандартный образец сравнения**. Следует хранить в эксикаторе в условиях защиты от дневного света.

------------------------------

** Например, USP Reference 1152009 массовой долей (приблизительно 10 мкг/мг). Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4.12 Приготовление растворов реактивов и стандартных растворов

4.12.1 Общие положения

Все растворы допускается готовить в большем или меньшем объеме при условии соблюдения правил надлежащей лабораторной практики. Растворы можно хранить в охлажденном виде или при комнатной температуре в плотно укупоренных емкостях из инертных материалов, если не оговорено другое.

4.12.2 Приготовление растворов реактивов

4.12.2.1 Подвижная фаза А для ВЭЖХ

Растворяют 4,0 см³ триэтиламина в 1 000 см³ воды. Доводят рН раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.2 Подвижная фаза В для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 250 см³ ацетонитрила с 750 см³ воды. Доводят рН раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7 ед. рН, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.3 Подвижная фаза С для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 750 см³ ацетонитрила с 250 см³ воды. Доводят рН раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.4 Подвижная фаза D для ВЭЖХ

Разбавляют 50 см³ ацетонитрила водой до объема 2 000 см³. Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.5 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 %

Разбавляют 150 см³ ацетонитрила водой до объема 1 500 см³. Срок годности - одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.6 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30 % (элюент для твердофазной экстракции)

Разбавляют 30 см³ ацетонитрила водой до объема 100 см³. Срок годности - 1 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.7 Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 50 % (раствор для промывки и хранения колонки)

Разбавляют 500 см³ ацетонитрила водой до объема 1 000 см³. Срок годности - 6 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.8 Смесь этанола с водой объемной долей этанола 25 %

Разбавляют 50 см³ этанола водой до объема 200 см³. Срок годности - один год при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.9 Раствор цианида калия массовой концентрации  = 4 г/дм³

Растворяют 0,02 г цианида калия в ацетатном буферном растворе (см. 4.12.2.11) концентрации 0,25 моль/дм³ и доводят объем раствора этим буферным раствором до 5 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.10 Раствор цианида калия массовой концентрации  = 10 г/дм³

Растворяют 0,25 г цианида калия в воде и доводят объем раствора до 25 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.11 Буферный раствор ацетата натрия концентрации с = 0,25 моль/дм³

Растворяют 41,0 г безводного ацетата натрия или 68,0 г трехводного ацетата натрия приблизительно в 1800 см³ воды. Значение рН раствора доводят до 4,6 ед. рН концентрированной уксусной кислотой (около 40 см³). Разбавляют водой до 2000 см³. Срок годности раствора - 3 мес.

4.12.2.12 Раствор для проверки степени хроматографического разделения

Берут навеску около 0,005 г рибофлавина на бумаге для взвешивания. Навеску переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем содержимого колбы до метки смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 %. Раствор перемешивают до достижения растворения. Смешивают равные объемы полученного раствора и градуировочного раствора витамина В₁₂ самой высокой концентрации. Срок годности раствора - одна неделя.

4.12.2.13 Раствор така-диастазы массовой концентрации  = 60 г/дм³

Растворяют 0,6 г така-диастазы в 10 см³ воды. Раствор готовят в день использования.

4.12.3 Приготовление стандартных растворов

4.12.3.1 Общие положения

Все стандартные растворы готовят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение, и хранят при температуре от 2 °С до 8 °С в плотно укупоренных мерных колбах.

4.12.3.2 Основной стандартный раствор витамина В₁₂ массовой концентрации  = 10 000 мкг/дм³

Берут точную навеску стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) такой массы, чтобы концентрация основного стандартного раствора составила 10 000 мкг/дм³. Растворяют в смеси этанола с водой объемной долей этанола 25 % (см. 4.12.2.8), объем раствора доводят до 100 см³ тем же растворителем. Срок годности раствора - 6 мес.

Необходимую массу навески стандартного образца витамина B₁₂ m_w, мг, вычисляют по формуле

,

(1)

где 10 000 - требуемая концентрация основного стандартного раствора, мкг/дм³;

0,1 - объем разбавления, дм³;

Р - чистота стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина на миллиграмм стандартного образца.

4.12.3.3 Стандартный раствор витамина В₁₂ промежуточной концентрации  = 1 000 мкг/дм³

Разбавляют 10 см³ основного стандартного раствора (см. 4.12.3.2) до 100 см³ водой. Срок годности раствора - одна неделя.

4.12.3.4 Градуировочные стандартные растворы витамина В₁₂ массовыми концентрациями от  = 2,5 мкг/дм³ до  = 25 мкг/дм³

В отдельных мерных колбах разбавляют 0,5 см³, 1 см³, 2 см³, 3 см³, 4 см³ и 5 см³ стандартного раствора промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3) до 200 см³ смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 % (см. 4.12.2.5). Срок годности растворов - 1 мес.

5 Лабораторное оборудование

5.1 Система для ВЭЖХ, состоящая из градиентного насоса, крана переключения колонок, изократического насоса, спектрофотометрического детектора с вольфрамовой лампой накаливания, пригодного для детектирования при 550 нм и автосамплера, пригодного для ввода проб объемом от 900 мм³ до 2 000 мм³.

5.2 Колонка для ВЭЖХ аналитическая эксклюзионная со следующими характеристиками:

- размером частиц сорбента 4 мкм, длиной 250 мм, внутренним диаметром 9,4 мм*(1).

- размером частиц сорбента 5 мкм, длиной 300 мм, внутренним диаметром 8 мм*(2).

5.3 Колонка для ВЭЖХ аналитическая обращенно-фазовая со следующими характеристиками:

- заполненная сорбентом типа С18, размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 100 мм, внутренним диаметром 4,6 мм*(3) с предколонкой размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 10 мм, внутренним диаметром 4,6 мм*(4);

- заполненная фенилгексильным сорбентом размером частиц 3 мкм и размером пор 120 ангстрем, длиной 100 мм и внутренним диаметром 4,6 мм*(5), с подходящей предколонкой, или аналогичная обращенно-фазовая колонка, совместимая с подвижной фазой, состоящей на 100 % из воды.

------------------------------

*(1) Например, Zorbax GF-250, каталожный номер 884973-901. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

*(2) Например, Shodex Protein KW-802.5, каталожный номер F6989000 или аналогичная. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

*(3) Например, Thermo Scientific Aquasil^тм, каталожный номер 77503-104630. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

*(4) Например, Thermo Scientific Aquasil^тм каталожный номер 77503-014001. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

*(5) Например, Epic Phenyl Hexyl, ES Industries 125191-EPHX. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.4 Термостат суховоздушный, пригодный для поддержания температур (95  5) °С и (105  5) °С.

5.5 рН-метр в комплекте с калибровочными буферными растворами.

5.6 Весы аналитические точностью не менее 0,00001 г.

5.7 Стаканы лабораторные стеклянные различной вместимости.

5.8 Дозирующая насадка на бутыль, обеспечивающая объем дозирования 30 см³ или аналогичная.

5.9 Цилиндры градуированные стеклянные различной вместимости.

5.10 Эксикатор.

5.11 Колбы конические вместимостью 125 см³ или аналогичная стеклянная посуда.

5.12 Бумага фильтровальная*(6) или аналогичная.

------------------------------

*(6) Например, Whatman 2V. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.13 Воронки пластиковые, пригодные для использования с фильтровальной бумагой.

5.14 Перчатки одноразовые.

5.15 Дозатор пипеточный переменного объема дозирования от 100 мм³ до 1 000 мм³.

5.16 Лабораторные световые экраны, желтые или бесцветные экраны с границей пропускания не ниже 385 нм.

5.17 Патроны для твердофазной экстракции (ТФЭ) с сорбентом - силикагелем, модифицированным группами С8, массой сорбента 900 мг*, или модифицированным группами С18, массой сорбента 900 мг** или аналогичные. Типовая методика проверки пригодности патронов для ТФЭ приведена в приложении С.

------------------------------

* Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20966. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

** Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20942. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5.18 Шприцы одноразовые различной вместимости.

5.19 Насадка на шприц фильтрующая, с нейлоновым фильтром диаметром пор 0,45 мкм.

5.20 Установка вакуумная для твердофазной экстракции (манифолд) на 24 гнезда с запорными кранами или аналогичная установка.

5.21 Пипетки с одной отметкой различной вместимости.

5.22 Колбы мерные различной вместимости.

6 Процедура проведения испытания

6.1 Общие положения

Подготовку всех проб проводят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение. Анализ приготовленных растворов проб можно провести не позднее чем через 14 дней после их приготовления при хранении растворов проб при температуре от 2 °С до 8 °С в плотно укупоренных мерных колбах. Все пробы продуктов должны быть однородными и представительными, насколько это возможно. Этого достигают путем тщательного перемешивания или взбалтывания продукта перед отбором пробы.

6.2 Приготовление растворов проб для анализа

6.2.1 Общие положения

При испытании продуктов, содержащих крахмал, добавляют 1 см³ раствора така-диастазы (см. 4.12.2.13). Дожидаются прохождения реакции така-диастазы с пробой в течение 30 мин прежде, чем перейти к этапу экстракции.

6.2.1.1 Жидкие пробы

При испытании жидких продуктов, готовых к употреблению, лабораторную пробу тщательно перемешивают для обеспечения гомогенности и берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптированной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³. Далее переходят к этапу экстракции.

6.2.1.2 Порошкообразные пробы

Если степень гомогенности порошкообразной пробы неизвестна, исходят из предположения, что проба не гомогенна, и все операции с ней проводят, как с пробами сухих порошкообразных смесей (см. 6.2.1.3).

6.2.1.3 Пробы сухих порошкообразных смесей

При испытании проб негомогенных сухих порошкообразных смесей берут точную навеску массой около 25,0 г. Добавляют 200,0 г воды, предварительно нагретой до 40 °С, и перемешивают до получения гомогенной суспензии. При необходимости используют гомогенизатор. Из полученной суспензии берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптированной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³.

6.2.1.4 Пробы влажных порошкообразных смесей

При испытании проб влажных порошкообразных смесей точную навеску пробы массой около 3,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³. Добавляют 25 см³ воды и перемешивают до полного растворения порошка.

6.2.1.5 Смеси, предназначенные для элементного питания

При испытании продуктов, содержащих свободные аминокислоты и не содержащих интактный белок, добавляют 0,5 г казеината кальция или обезжиренного сухого молока к навеске пробы гомогенной влажной порошкообразной смеси массой 3,0 г, разбавленной 25 см³ воды, или к навеске негомогенной жидкой пробы или восстановленной сухой порошкообразной смеси массой от 20 до 25 г. Тщательно перемешивают для растворения белка, после чего сразу же добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и 1 см³ раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³. Разбавляют до требуемого объема водой, фильтруют, фильтрат подвергают очистке и концентрированию до 60 см³ на предварительно кондиционированном патроне С8 или С18 массой сорбента 900 мг. Нагрев пробы в термостате при 105 °С не проводят.

6.2.2 Экстракция

К каждому раствору пробы для анализа добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и взбалтывают до полного перемешивания. В вытяжном шкафу к раствору каждой пробы добавляют 1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³ (см. 4.12.2.10) и взбалтывают до перемешивания. Растворы проб выдерживают в термостате при 105 °С в течение не менее 60 мин, но не более 120 мин. Следует принимать во внимание, что температура в термостате понизится при открывании дверцы. Отсчет времени начинают с момента повторного достижения температуры в термостате 105 °С.

Вынимают растворы проб из термостата и сразу же охлаждают на бане со льдом. Разбавляют растворы проб до заданного объема водой и тщательно перемешивают. Растворы проб фильтруют через фильтровальную бумагу (см. 5.12) в коническую колбу вместимостью 125 см³ или аналогичную стеклянную емкость. При необходимости допускается заменять фильтр, если он засоряется. Если приготовленные растворы проб непрозрачны и содержат нерастворимые частицы очень малого размера, их центрифугируют и переносят надосадочную жидкость в воронки с уложенной в них фильтровальной бумагой. Растворы проб, в которые был добавлен казеинат кальция, нагревать не допускается (см. 6.2.1.5).

6.2.3 Концентрирование растворов проб

Для очистки и концентрирования раствора пробы поверх запорного крана вакуумного манифолда помещают патрон для ТФЭ массой сорбента 900 мг (см. 5.17) и в верхнее отверстие патрона устанавливают цилиндр одноразового шприца вместимостью 30 см³. Каждый патрон кондиционируют не менее 20 см³ ацетонитрила (пропускание под действием силы тяжести), после чего промывают не менее 20 см³ воды. С помощью пипеток с одной отметкой в патроны вносят фильтраты растворов проб, руководствуясь указаниями в таблице 1. Если концентрация витамина В₁₂ неизвестна, руководствуются указаниями для готовых к употреблению продуктов, содержащих от 1 мкг/дм³ до 10 мкг/дм³ витамина В₁₂. При необходимости применяют вакуум так, чтобы обеспечивалась постоянная скорость протекания растворов проб через патроны. Скорость протекания растворов проб через патроны не должна превышать 120 капель в минуту. Элюат отбрасывают.

Таблица 1 - Указания по внесению фильтратов растворов проб в патроны для ТФЭ

Витамин В12 в продуктах, готовых к употреблению, мкг/дм3	Объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см3	Конечный объем разбавления, см3
< 1	80	5
1-10	70-80	10
11-20	50-60	10
21-50	20-40	10
Примечание - Не следует вносить более 60 см3 растворов проб смесей для энтерального питания для взрослых на патроны Alltech С8 или С18.

После протекания через патрон всего фильтрата раствора пробы каждый патрон промывают 5 см³ воды, элюат отбрасывают. Высушивают каждый патрон потоком воздуха путем приложения вакуума до полного прекращения вытекания элюата. Закрывают все запорные краны.

Руководствуясь указаниями в таблице 1, под каждый патрон помещают мерную колбу вместимостью 5 см³ или 10 см³. В каждый патрон вносят 4,4 см³ смеси ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30 % (см. 4.12.2.6). Открывают все запорные краны и элюируют витамин В₁₂ с применением вакуума в мерные колбы. Элюент должен протекать через патроны со скоростью не более 120 капель в минуту.

При разбавлении на конечной стадии растворы проб, собранные в мерные колбы вместимостью 10 см³, разбавляют до метки водой.

В случае растворов проб, собранных в мерные колбы вместимостью 5 см³, в вытяжном шкафу в каждую колбу добавляют по 0,1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия концентрации 4 г/дм³ (см. 4.12.2.9). Подготовленные таким образом растворы проб помещают в термостат, нагретый до температуры 95 °С, не менее чем на 1,5 ч, но не более чем на 4 ч. Далее вынимают растворы проб из термостата и охлаждают до комнатной температуры. Объем содержимого в колбах доводят водой до метки.

Фильтруют аликвоты каждого стандартного раствора и приготовленного раствора пробы через фильтрующую насадку на шприц (см. 5.19) в виалу автосамплера.

6.3 Хроматографический анализ

6.3.1 Устройство и конфигурация хроматографической системы

Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ приведены на рисунке 1.

1 - изократический насос; 2 - автосамплер; 3 - аналитическая эксклюзионная колонка; 4 - аналитическая колонка С18; 5 - градиентный насос; 6 - спектрофотометрический детектор; 7 - емкость для сбора элюата

Рисунок 1 - Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ

6.3.2 Параметры работы хроматографической системы:

- продолжительность одного анализа: от 30 до 35 мин;

- объем инжекции: от 0,9 до 2,0 см³;

- конфигурация системы: см. таблицу 2.

Таблица 2 - Конфигурация системы для ВЭЖХ

Время, мин	Конфигурация крана-переключателя потока (см. рисунок 1)
0-10,5	1
10,5-14,5	2
14,5-30,0 (или 35,0)	1

- параметры работы изократического насоса:

- подвижная фаза D (см. 4.12.2.4);

- подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин В₁₂ элюировался с эксклюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин. Типичные значения скорости подачи подвижной фазы составляют от 1,1 до 1,2 см³/мин.

Для определения подходящей скорости подачи подвижной фазы эксклюзионную колонку присоединяют непосредственно к спектрофотометрическому детектору и инжектируют стандартный раствор высокой концентрации. Подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин В₁₂ элюировался с эксклюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин;

- параметры работы градиентного насоса:

- подвижная фаза А (см. 4.12.2.1), В (см. 4.12.2.2) и С (см. 4.12.2.3);

- градиентная программа, обеспечивающая элюирование витамина В₁₂ в промежуток между 24 мин и 30 мин, приведена в таблице 3.

Таблица 3 - Градиентная программа для обращенно-фазовой колонки (см. 5.3)

Время, мин	Объемная доля подвижной фазы А, %	Объемная доля подвижной фазы В, %	Объемная доля подвижной фазы С, %
0	90	10	0
14,5	90	10	0
14,6	40-60а	60-40а	0
27,0-30,0	40-60а	60-40а	0
27,1-30,1	0	10	90
29,9-33,0	0	10	90
а Применительно к каждой колонке следует устанавливать подходящие условия градиентного элюирования так, чтобы обеспечивалось достаточное разделение витамина В12 и рибофлавина в промежуток приблизительно между 24 мин и 30 мин. Для определения подходящих условий градиентного элюирования применительно к новой колонке устанавливают соотношение подвижных фаз в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин на середине диапазона, указанного в таблице. Инжектируют раствор для проверки степени хроматографического разделения (см. 4.12.2.12) и рассчитывают степень хроматографического разделения (R) пиков витамина В12 и рибофлавина. Подбирают состав подвижной фазы в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин для достижения R > 1,5. После элюирования витамина В12 с колонки С18 или фенильной колонки, колонку промывают подвижной фазой, состоящей на 90 % из подвижной фазы С, в течение не менее 2,8 мин.

- скорость подачи подвижной фазы 1,0 см³/мин;

- параметры работы детектора: длина волны детектирования 550 нм и ширина полосы светопропускания 10 нм.

После уравновешивания системы проводят анализ градуировочных стандартных растворов и серии растворов проб. После анализа последнего раствора пробы анализируют как минимум один градуировочный стандартный раствор для проверки стабильности системы.

Образцы хроматограмм приведены в приложении А.

7 Обработка результатов

7.1 Общие положения

Содержание витамина В₁₂ в пробах рассчитывают путем соотнесения площади пика на хроматограмме раствора пробы известной массы навески с площадями пиков на хроматограммах стандартных растворов известной концентрации.

Просматривают все хроматограммы градуировочных растворов и растворов проб и контролируют, чтобы пик витамина В₁₂ был разделен со всеми остальными пиками на хроматограммах.

Площади пиков измеряются системой обработки данных. Перед расчетом содержания витамина В₁₂ в пробах сопоставляют площади пиков витамина В₁₂ на хроматограммах стандартных растворов с площадями пиков витамина В₁₂ на хроматограммах растворов проб и контролируют, чтобы площади пиков на хроматограммах растворов проб находились в границах диапазона площадей пиков на хроматограммах стандартных растворов.

7.2 Расчет концентрации стандартных растворов

Массовую концентрацию витамина В₁₂, мкг/дм³, в градуировочных стандартных растворах (см. 4.12.3.4) вычисляют по формуле

,

(2)

где S_W - масса навески стандартного образца витамина В₁₂, мг;

Р - чистота стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина (витамина В₁₂) на миллиграмм стандартного образца;

А - использованная аликвота стандартного раствора витамина В₁₂ промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3), см³ (здесь: 0,5 см³, 1,0 см³, 2,0 см³, 3,0 см³, 4,0 см³ или 5,0 см³);

200 - объем приготовленного градуировочного стандартного раствора, см³.

7.3 Построение градуировочного графика

Для каждой концентрации градуировочных растворов определяют среднее арифметическое значение из площадей пиков аналита, полученных при анализе соответствующего градуировочного раствора до и после анализа серии растворов проб. Градуировочный график строят с помощью линейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов в системе координат "концентрация градуировочного раствора - площадь пика аналита".

7.4 Расчет содержания витамина В₁₂ в пробах

По градуировочному графику, построенному по 7.3, определяют массовую концентрацию витамина В₁₂ в каждом анализированном растворе пробы.

Массовую долю витамина В₁₂ в каждой пробе w_p, мг/100 г, вычисляют по формуле

,

(3)

где - массовая концентрация витамина В₁₂ в растворе пробы для анализа, определенная по градуировочному графику, мкг/дм³;

V₁ - объем первого разбавления, см³ (здесь V₁ = 100 см³);

m_s - масса навески пробы, г;

V₂ - объем второго (окончательного) разбавления, см³;

V_f - объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см³;

m_pr - общая масса пробы, полученной после восстановления порошкообразной пробы, г (если применимо для данного случая);

m_rp - масса порошкообразной пробы, взятая для восстановления, г (если применимо для данного случая).

Примечание - m_pr и m_rp равны 1 для жидких проб и проб, испытываемых без восстановления.

Библиография

[1]	2011.10, Determination of Vitamin B12 in Infant, Adult, and Pediatric Formulas by HPLC-UV and Column Switching: Collaborative Study
[2]	ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method*

------------------------------

* Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.

[3]	AOAC International. AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23-51
[4]	AOAC SMPR 2011.005, Standard Method Performance Requirements for Vitamin B12 in infant formula and Adult/Pediatric Nutritional formula
[5]	Thompson M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385-386