Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за судовыми установками очистки и обеззараживания сточных вод (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 5 марта 1987 г. N 4260-87)

1. Общие положения

1.1. Настоящие Методические указания предназначены для специалистов санитарно-эпидемиологических станций, осуществляющих государственный санитарный надзор за судами морского, смешанного (река-море) и внутреннего плавания СССР и другими плавучими объектами и сооружениями, и регламентируют порядок и методы контроля гигиенической эффективности судовых установок очистки и обеззараживания сточных вод (ООСВ) в рамках предупредительного и текущего санитарного надзора.

1.2. Контролю подлежат отечественные установки ООСВ на стадиях опытного производства и производства установочной серии, находящиеся в эксплуатации на судах, а также установки зарубежного производства, одобренные Министерством здравоохранения СССР и Регистром СССР.

1.3. При оценке гигиенической эффективности работы установок ООСВ следует руководствоваться следующими нормами очистки и обеззараживания судовых сточных вод, сбрасываемых в водные объекты после установок:

Наименование показателя	Стенд предприятия-изготовителя	Морские суда	Суда внутреннего и смешанного плавания
Биохимическое потребление кислорода (БПК_5)	не более 50 мг/л	не более 50 мг/л	не более 50 мг/л
Взвешенные вещества (ВВ)	не более 50 мг/л	не более 100 мг/л сверх содержания ВВ в промывочной воде	не более 50 мг/л
Лактозоположительные кишечные палочки (коли-индекс)	не более 1000	не более 2500	не более 1000
Остаточный хлор*	в пределах 1,5 - 5,0 мг/л	в пределах 1,5 - 5,0 мг/л	в пределах 1,5 - 5,0 мг/л

______________________________

* определяется непосредственно после установки в случаях применения для обеззараживания хлорсодержащих реагентов или использования безреагентных методов образования и подачи в установку активного хлора.

1.4. При наличии санитарно-эпидемиологических показаний при контроле за установками ООСВ должны определяться дополнительные показатели в соответствии с "Методическими указаниями по гигиеническому контролю загрязнения морской среды" N 2260-80, "Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов" N 2285-81, "Инструктивно-методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры" N 04-23/3 от 12.09.83.

1.5. Ответственность за выпуск установок ООСВ, отвечающих требованиям технических условий, согласованных с органами здравоохранения в установленном порядке, а также организацию стендовых испытаний несет предприятие-изготовитель; за монтаж, наладку, приемочные испытания на борту судна - судостроительные и судоремонтные предприятия; за техническое обслуживание и обеспечение паспортных режимов работы установок в процессе эксплуатации на судне - администрация судна.

1.6. С изданием настоящих Методических указаний отменяется "Временное положение о порядке осуществления государственного санитарного надзора за судовыми установками для очистки и обеззараживания сточных вод" N 2931-83 от 01.09.83.

2. Организация предупредительного и текущего санитарного надзора за установками ООСВ

2.1. В порядке предупредительного санитарного надзора контроль за отечественными установками ООСВ осуществляют:

2.1.1. Министерства здравоохранения союзных республик, на территории которых расположены проектные организации - разработчики установок, или по их поручению бассейновые санэпидстанции на водном транспорте - при испытаниях опытных образцов, одного из образцов установочной серии, первого головного образца серийного производства установки на стенде завода-изготовителя и на борту судна.

2.1.2. Бассейновые, портовые, линейные санэпидстанции на водном транспорте - в процессе швартовных и ходовых испытаний судов при сдаче их в эксплуатацию после постройки или ремонта.

2.2. Испытания новых видов установок ООСВ, их модификаций проводятся по специальным программам, разрабатываемым проектными организациями и согласовываемым с министерствами здравоохранения союзных республик.

2.3. Контроль за установками ООСВ зарубежного производства при испытаниях на стенде предприятия-изготовителя или на борту судна осуществляется Министерством здравоохранения СССР или по его поручению Балтийской бассейновой санэпидстанцией совместно с Регистром СССР.

2.4. На основании результатов испытаний отечественных и зарубежных установок ООСВ Министерством здравоохранения СССР выдается разрешение на их применение на судах СССР.

2.5. Технические условия на серийное производство установок, одобренных Минздравом СССР, согласовываются министерствами здравоохранения союзных республик, на территории которых расположены организации-разработчики нормативно-технической документации.

2.6. К проведению испытаний новых видов отечественных установок ООСВ привлекается Филиал научно-исследовательского института гигиены водного транспорта Минздрава СССР.

2.7. В порядке текущего санитарного надзора контроль за установками ООСВ осуществляется бассейновыми, портовыми и линейными санэпидстанциями на водном транспорте:

2.7.1. При ежегодном и очередном (4-x летнем) освидетельствовании судна и водоохранного оборудования инспекциями Регистра СССР.

2.7.2. При обследовании судов в плановом порядке и по санитарно-эпидемическим показаниям, порядок которых определен "Методическими указаниями по организации и проведению текущего санитарного надзора за эксплуатирующимися судами и другими плавучими сооружениями" N 2639-82.

2.8. В процессе санитарно-гигиенического обследования судна в порядке текущего санитарного надзора специалистами санэпидстанций проводится обследование судовых сточных систем, установок ООСВ, контролируются условия водопотребления и водоотведения, проверяются записи в журналах технического обслуживания установок и режим их работы, устанавливается соответствие технических показателей работы установок их паспортным значениям.

2.9. Отбор проб сточных вод для лабораторных исследований производится только при условии обеспечения паспортного устойчивого режима работы установки.

2.10. При испытании на стенде предприятия-изготовителя и на борту судна опытных образцов установок, одного из образцов установочной серии и головного образца серийного производства отбирается по 40 проб исходных сточных вод и сточных вод после очистки и обеззараживания в течение 10 дней (ежедневно по 4 пробы до и 4 пробы после установки) после достижения устойчивого режима работы испытываемого оборудования.

Примечание:

1. На стенде предприятия-изготовителя должна использоваться в качестве исходной сточная вода из городских (заводских) сетей канализации со следующими показателями: БПК_5 - не менее 400 мг/л, взвешенные вещества - не менее 500 мг/л, коли-индекс - не менее 10(7).

2. Пробы сточных вод до и после установки отбираются последовательно с интервалом по времени, в течение которого сточные воды находятся в установке, т.е. времени полного цикла их очистки и обеззараживания.

2.11. В процессе испытания серийно изготавливаемых установок ООСВ на борту судна (первоначальное освидетельствование установок, имеющих Свидетельство о типовом испытании Регистра СССР) отбирается 8 проб очищенной и обеззараженной сточной воды после установки в течение 2 дней (по 4 пробы ежедневно).

2.12. При сдаче судна после ремонта или зимнего отстоя отбирается 3 пробы после установки с интервалом между отборами 1 час.

2.13. При ежегодном освидетельствовании Регистром СССР установок на морских судах, судах смешанного плавания и при обследовании судна по санитарно-эпидемическим показаниям отбирается 1 проба сточных вод после установки.

2.14. При очередном (4-хлетнем) освидетельствовании установки Регистром СССР отбирается 3 пробы после установки с интервалом между отборами 1 час.

2.15. При плановом углубленном санитарно-гигиеническом обследовании судна количество исследуемых проб сточной воды до и после установок ООСВ определяется программой обследования судна.

2.16. Отбор проб сточных вод для лабораторных исследований из установок ООСВ биологического действия производится только при достижении устойчивого режима работы установок, но не позднее 1 месяца после сдачи судна в эксплуатацию. На время до получения результатов лабораторного исследования сточных вод сброс их после установок в водоемы запрещается. Сточные воды должны собираться в накопительные цистерны, сдаваться на береговые или плавучие приемные сооружения.

2.17. Результаты обследования судовых сточных систем и установок ООСВ, если оно проводится самостоятельно, оформляются актом санитарного обследования (форма N 315 у).

2.18. Отбор проб сточной воды для лабораторных исследований производится из пробоотборных устройств на установках в соответствии с действующей нормативно-технической документацией на правила отбора проб для санитарно-химических и микробиологических исследований и оформляется актом (форма N 332 у). Результаты лабораторных исследований оформляются протоколами (форма N 325 у).

В случае получения результатов исследования сточных вод после отхода судна в рейс, они передаются радиограммами на борт судна для внесения в судовые санитарные журналы (книгу единого осмотра).

2.19. На основании оценки результатов испытаний опытных образцов, образцов установочной серии специалистами санэпидстанций составляется Заключение о гигиенической эффективности работы установок ООСВ, которые вместе с материалами испытаний передаются Министерству здравоохранения СССР (приложение 1, 2).

2.20. По результатам обследований установок при сдаче судна в эксплуатацию после постройки (первоначальное освидетельствование) при плановом углубленном обследовании судна оформляется заключение (приложение 3), которое передается администрации судна.

2.21. В случае, когда определяемые в лабораториях санэпидстанций показатели качества очищенных и обеззараженных сточных вод не соответствуют гигиеническим нормам, администрации судна предъявляется требование о запрещении пользования установкой и сбросе сточных вод в районах морей, где Конвенцией МАРПОЛ-73/78 устанавливаются особые ограничения, в пределах I пояса зоны санитарной охраны прибрежных районов морей, в акватории портов и в районах рейдовых стоянок судов, а также во внутренних водоемах страны.

2.22. Санэпидстанциями ведется учет и анализ результатов лабораторных исследований, санитарных обследований судовых сточных систем и установок ООСВ, на основании которого разрабатываются обоснованные предложения соответствующим службам пароходств, управлений рыбной промышленности, организациям-владельцам судов, проектным организациям, предприятиям-изготовителям установок, которые направлены на повышение гигиенической эффективности их работы.

3. Методы санитарно-химических исследований судовых сточных вод

3.1. Отбор, консервирование и хранение проб.

Для анализа отбирают 1 литр сточной воды в стеклянную бутыль, закрывающуюся корковой или стеклянной пробкой.

Условия консервации проб в зависимости от исследуемого компонента представлены в таблице:

Исследуемый компонент	Метод консервации	Начало анализа после отбора пробы
БПК_5	без консервации охлаждение до +4°С	через 3 часа через 24 часа
Взвешенные вещества	без консервации 2 - 4 мл хлороформа	через 4 часа через 24 - 48 часов (перед анализом взболтать)
Остаточный активный хлор без консервации		на месте отбора пробы

3.2. Определение содержания взвешенных веществ*

При содержании взвешенных веществ в воде более 10 мг/л их определяют фильтрованием через беззольный бумажный фильтр "синяя лента".

Ход определения. Через подготовленный фильтр пропускают не менее 500 мл тщательно перемешанной сточной воды. Промывают колбу, в которой была проба, и осадок на фильтре небольшой порцией дистиллированной воды. Фильтр подсушивают на воздухе, затем помещают в бюкс и в открытом фильтре сушат при 105°С в течение 2 часов, закрывают бюкс, охлаждают, взвешивают, повторяя операции до достижения постоянной массы (как при подготовке фильтров).

Содержание взвешенных веществ рассчитывают по формуле:

                         (M - M ) x 1000

                           1   2

                     X = --------------,      где

                              y

X  - содержание ВВ в мг/л;

M  - масса бюкса с фильтром с высушенным осадком в мг;

 1

M  - масса бюкса с чистым высушенным фильтром в мг;

 2

y  - объем воды, взятой для анализа в мл.

3.3. Определение биохимического потребления кислорода БПК_5
(стандартный метод с разбавлением)**

Определение производится в натуральной или разбавленной пробе по разности содержания кислорода до и после инкубации при температуре 20°С, без доступа воздуха и света.

Перед анализом кислые воды нейтрализуют 0,1 н раствором едкого натра (NaOH), щелочные - 0,1 н раствором серной кислота (H2SO4).

Хлорированные сточные воды перед определением БПК_5 обрабатывают сульфитом натрия, количество которого определяют титрованием. К 100 мл пробы прибавляют 10 мл H2SO4 (1:50), 10 мл раствора иодида калия (10% раствор) и титруют 0,025 н раствором сульфита натрия Na2SO3 с применением раствора крахмала в качестве индикатора (раствор сульфита натрия приготавливают растворением 0,16 г безводного Na2SO3 в 100 мл дистиллированной воды непосредственно перед применением).

Для разбавления вод со значительным содержанием органических веществ применяют дистиллированную воду, полученную перегонкой в стеклянном перегонном аппарате, ее же применяют для приготовления растворов.

Разбавляющая вода должна быть насыщена кислородом и храниться в темноте, защищенной от каких бы то ни было загрязнений. В качестве питательных солей в нее вносят в день применения по 1 мл растворов (в рачете на 1 литр):

фосфатный буферный раствор, рН = 7,2. К2HРO4, х.ч., КH2РO4, х.ч., Na2НРO4 x 7 H2O, х.ч., NH4Cl, х.ч.;

8,5 г KH2PO4, 21,75 г K2HPO4, 33,4 г Na2HPO4 x 7 Н2O и 1,7 г NH4Cl растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л (реактивы применяются химически чистые);

раствор сульфата магния MgSО4 х 7Н2О, х.ч.

22,5 г MgSO4 x 7 Н2O растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л в мерной колбе;

раствор хлористого кальция CaCl2, х.ч.

27,5 г CaCl2 безводного растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 литра в мерной колбе;

раствор хлористого железа FeCl3 x 6 H2O, х.ч.

0,25 г FeCl3 x 6 H2O растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л в мерной колбе.

Затем к разбавляющей воде прибавляют 1 мл свежей хозяйственно-бытовой воды (сохранявшейся не более 24 час.) или 10 - 20 мл речной воды на каждый литр разбавляющей воды.

Исследуемую воду переливают в колбу и доводят до 20°С (путем нагревания на водяной бане или охлаждения), после чего взбалтывают в течение 1 минуты для насыщения ее воздухом.

Дав выйти пузырькам воздуха, с помощью сифона наполняют 3 склянки с притертыми пробками водой наполовину, ополаскивают и потом наполняют до краев. В одной из них определяют растворенный кислород. Две других склянки с испытуемой водой ставят в термостат горлом вниз на 5 суток, по прошествии которых определяют оставшийся растворенный кислород.

Разность между начальным и конечным определениями, пересчитанная на 1 л, дает величину кислорода, пошедшего на окисление органических веществ в испытуемой воде в течение 5 суток.

Так как в случае загрязненных вод растворенного кислорода может не хватить для покрытия всей потребности воды в кислороде, то указанные воды необходимо перед началом определения разбавить разбавляющей водой. Разбавление должно быть таким, чтобы убыль кислорода за 5 суток была не менее 2 мг/л и чтобы остаток его по истечение этого времени не был ниже 2 мг/л.

Если БПК_5 совершенно неизвестно, необходимо делать несколько разбавлений, например 1:1, 1:4, 1:6 и т.д.

Разбавленную воду аэрируют путем взбалтывания, разливают по склянкам и ведут в ней определение растворенного кислорода.

Для контроля необходимо производить определение БПК_5 самой разбавляющей воды с добавленными реактивами, оно не должно превышать 0,3 мгО2/л. Поправка вносится в расчет.

Ход определения. В кислородную склянку, заполненную доверху, прибавляют 2 мл раствора сульфата или хлорида марганца и 2 мл щелочного раствора йодида калия. После выпадения осадка гидроокисей марганца кислородную склянку открывают и пипеткой с широким концом, опущенным под уровень пробы, прибавляют 2 мл разбавленной (1:4) серной кислоты. Кислородные склянки вновь закрывают и, перевертывая, перемешивают их содержимое. Затем содержимое кислородной склянки переливают в колбу для титрования и ополаскивают склянку дистиллированной водой, сливая ее в ту же колбу.

Если для фиксации кислорода применялся раствор едкого калия без иодида, в колбу прибавляют еще 2 мл раствора иодида калия.

Через 5 минут содержимое колбы титруют раствором тиосульфата натрия.

Содержание растворенного кислорода в мг/л расчитывают# по формуле:

                     a x K x н x 8 x 1000

                 X = --------------------, где

                           y - y

                            1   2

а  - количество тиосульфата, пошедшее на титрование в мл;

К  - поправка для приведения  концентрации  раствора тиосульфата к точно

     используемой концентрации;

н  - нормальность раствора тиосульфата;

8  - эквивалент кислорода;

у  - объем кислородной склянки;

 1

y  - общий объем реактивов, прибавленных в кислородную склянку.

 2

Расчет БПК_5 без разбавления.

                              X = а - в

X - БПК_5 в мг/л кислорода;

а - содержание растворенного кислорода в воде до инкубации в мг/л;

в - содержание растворенного кислорода в воде после инкубации в мг/л.

Расчет БПК_5 с разбавлением

                          Х = /(А - В) - (а - в)/N

X - БПК_5 в мг/л кислорода;

А - содержание растворенного кислорода в воде до инкубации в мг/л;

В - содержание растворенного кислорода в воде после инкубации в мг/л;

а - содержание растворенного кислорода в разбавляющей воде до  инкубации

    в мг/л;

в - содержание  растворенного  кислорода  в  разбавляющей   воде   после

    инкубации в мг/л;

N - величина разбавления (во сколько раз разбавлена проба).

3.4. Определение содержания остаточного хлора
(иодометрический метод)***

Ход определения

В коническую колбу насыпают 0,5 г иодистого калия, растворяют его в 1 - 2 мл дистиллированной воды, затем добавляют буферный раствор в количестве, приблизительно равном полуторной величине щелочности анализируемой воды, после чего добавляют 250 - 500 мл анализируемой воды.

Выделившийся иод оттитровывают 0,005 н раствором тиосульфата натрия из микробюретки до появления светло-желтой окраски, после чего прибавляют 1 мл 0,5%-ного раствора крахмала и раствор титруют до исчезновения синей окраски.

При определении щелочности воду предварительно дехлорируют с помощью тиосульфата натрия в отдельной пробе.

При концентрации хлора менее 0,3 мг отбирают для титрования большие объемы воды.

Содержание суммарного остаточного хлора (X), мг/л вычисляют по формуле

                         y x K x 0,177 x 1000

                     X = ---------------------,       где

                                  V

y     - количество 0,005 н раствора тиосульфата натрия,  израсходованное

        на титрование, мл;

К     - поправочный  коэффициент   нормальности   раствора   тиосульфата

        натрия;

0,177 - содержание  активного  хлора,  соответствующее  1  мл   0,005  н

        раствора тиосульфата натрия;

V     - объем пробы воды, взятой для анализа, мл.

4. Методы санитарно-микробиологического анализа очищенных и обеззараженных судовых сточных вод

4.1. Отбор, хранение и транспортировка проб воды.

Для бактериологического анализа пробы отбирают в местах выемки воды для химического анализа. В момент отбора проб измеряют температуру воды.

Пробу воды отбирают с соблюдением правил эпидемической безопасности в стерильные емкости в количестве не менее 0,5 литра. Пробы хлорированной воды отбирают в склянку, в которую до стерилизации вносят тиосульфат натрия из расчета 10 - 13 мг на 500 см3 проб сточной воды.

Из одной точки в первую очередь отбирают пробы для микробиологических исследований, а затем для других целей. Посуду открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и горлышко не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не следует.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность (корковой, резиновой или ватной, обернутой фольгой и т.п.) и стерильным колпачком.

При невозможности проведения анализа на месте, отобранные пробы транспортируют в лабораторию в сумках-холодильниках или термоконтейнерах.

Во время перевозки пробы воды следует предохранять от замерзания, действия прямых солнечных лучей, избегать резких толчков, опрокидывания и замачивания пробок. Исследование воды должно быть произведено не позднее 6 часов с момента ее отбора при условиях хранения пробы при температуре +4 - +10°С.

4.2. Аппаратура, лабораторная посуда, материалы, реактивы по ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа".

4.3. Метод мембранных фильтров

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при температуре 37°С +- 0,5°С на среде Эндо в течение 24 часов, дифференцировании выросших колоний и подсчете количества лактозоположительных кишечных палочек в 1 дм3 воды. Данный метод является предпочтительным при анализе судовых сточных вод.

Объем воды выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения с расчетом, чтобы не менее, чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к лактозоположительным кишечным палочкам. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований, исходят из предполагаемой степени загрязнения сточных вод, времени, в течение которого сточные воды остаются в установке.

При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать не менее 4-х десятикратных ее объемов (1,0; 0,1; 0,01; 0,001 см3).

Для фильтрования используют мембранные фильтры МФА-МА (фильтрующие мембраны "Владипор" N 5, 6 и 8 и предварительные N 10).

Подготовка# мембранных фильтров к анализу осуществляют в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.

Фильтрование воды выполняют с помощью специальных приборов с соблюдением правил стерильности. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через 1 фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании 1 см3 воды в воронку наливают сначала 5 - 10 см3 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду с последующим созданием вакуума.

После окончания фильтрования мембранный фильтр снимают при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра. Фильтр переносят на среду Эндо, не переворачивая, и добиваются полного прилегания его к среде без пузырьков воздуха. На одну чашку можно помещать несколько фильтров, но с условием, чтобы они не соприкасались. Для посева используют среду Эндо с добавлением фуксина (на 100 см3 среды прибавляют 0,1 - 0,2 см3 10% спиртового раствора основного фуксина).

Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через предварительный мембранный фильтр N 10 для удаления крупной взвеси, который помещают в фильтровальный аппарат, накладывая фильтр для бактериологического анализа. После окончания фильтрования фильтры переносят на среду Эндо раздельно и при выведении результатов анализа учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре 37° +- 0,5°С. К учету результатов приступают при отсутствии роста колоний - через 24 часа, при наличии колоний - через 18 часов.

Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные колонии и число колоний, характерных для лактозоположительных кишечных палочек, не более 30. Допустимо вести учет по одному фильтру или на фильтрах с более густым ростом, но с обязательной оговоркой в приложении к протоколу анализа.

Выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом для определения оксидазной активности. Оксидазный тест можно ставить с помощью СИБ-оксидазы, для чего мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом не переворачивая на бумажный диск СИБ-оксидазу диаметром 3,5 - 4 см (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 2 - 5 мин. после достаточного четкого проявления реакции (сине-фиолетовая окраска ободка или всей колонии оксидазоположительных бактерий) фильтр переносят обратно на среду и учитывают результат*(4).

Все колонии, которые приобрели сине-фиолетовую окраску или синий ободок, из учета исключают. Среди колоний, не изменивших первоначального цвета (оксидазоотрицательных) подсчитывают количество красных и с металлическим блеском и без него, а также розовых слизистых крупных выпуклых, розовых с темно-красным центром (с отпечатками на обратной стороне фильтра, до выполнения оксидазного теста). Анализ может быть завершен на этом этапе.

В сомнительных случаях, когда необходимо подтвердить принадлежность колоний к лактозоположительным кишечным палочкам, а также при отсутствии реактива для оксидазной активности подсчитывают отдельно каждый тип колоний, которые по морфологии и окраске можно предположительно отнести к ферментирующим лактозу кишечным палочкам (темно-красные с металлическим блеском и без него, красные, розовые с красным центром, розовые выпуклые слизистые и других оттенков с отпечатками на обратной стороне мембранного фильтра). По 3 - 4 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по Граму, пересевают в полужидкую среду с лактозой (уколом до дна) или в пептонную воду с СИБ-лактозой.

Посевы инкубируют в течение 4 - 5 часов при температуре 37 +- 0,5°С. При наличии кислоты и газа исследуемую колонию относят к ЛКП, при отсутствии изменения среды - не учитывают. При наличии только кислоты посев оставляют в термостате и окончательный учет производят через 24 часа.

Результат анализа выражают в виде коли-индекса - количество лактозоположителыных кишечных палочек в дм3 воды. Суммируют количество колоний ЛКП на таких фильтрах, где выросло не более 30 изолированных колоний, и делят на объем профильтрованной воды, выраженный в дм3.

Например: если при посеве 1; 0,1; 0,01 и 0,001 см3 воды на 4 фильтра на одном из них выросло 3 колонии, а на втором 5 колоний, то коли-индекс равен 35:0,00111 дм3 = 3154.

Примечание: при необходимости сохранения жизнеспособности бактерий, выросших на фильтрах, следует учитывать бактерицидность реактива для определения оксидазного теста. Поэтому высев колоний в полужидкую среду с лактозой и другие среды производят немедленно после проявления реакции и не позднее 5 - 7 мин от начала контакта с реактивом.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

4.3.2. Титрационный метод

Объем воды для посева в лактозо-пептонную среду накопления выбирают с таким расчетом, чтобы в наименьших объемах получить один или несколько отрицательных результатов. При исследовании сточных вод можно ограничиться посевом одного ряда разбавлений и производить посев, начиная с 1 см3 (1,0; 0,1; 0,01; 0,001).

Выбранные посев# объемы воды засевают: 1 см3 пробы воды и 1 см3 из разбавлений - в 10 см3 лактозо-пептонной среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 +- 2 часа при температуре 37 +- 0,5°С.

Учет результатов. Полное отсутствие изменения среды или помутнение без образования газа позволяет дать отрицательный ответ. Из посевов в среду накопления, где отмечено помутнение и газообразование, производят высев на поверхность подтверждающей плотной среды Эндо с добавлением фуксина, разделенной на 3 - 4 сектора с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посев инкубируют при 37 +- 0,5°С 24 - 18 часов. При наличии в среде накопления помутнения и газообразования, а при высеве на подтвержденную среду характерных для ЛКП колоний (темно-красных с металлическим блеском и без него, слизистых крупных, изменяющих цвет среды) дают положительный ответ.

В тех случаях, когда имеет место сомнительная реакция в средах накопления (небольшое газообразование) или на среде Эндо выросли не характерные для ЛКП колонии, подтверждают принадлежность выросших колоний к лактозоположителным кишечным палочкам. По две колонии каждого типа микроскопируют с окраской по Граму, засевают в полужидкую среду с лактозой уколом до дна пробирки и инкубируют при температуре 37°С. Через 5 часов инкубации посевов производят учет. При образовании кислоты и газа хотя бы в одной пробирке, результат анализа считают положительным. При отсутствии изменений среды дают отрицательный ответ. При наличии только кислоты окончательный ответ учитывают через 24 часа.

Для подтверждения способности бактерий ферментировать лактозу можно использовать и лактозо-пептнонную# среду накопления с поплавками. Учет результатов в этом случае следует производить через 24 часа.

Ускоренный подтверждающий метод.

В сомнительных случаях на колонии, выросшие на секторе Эндо, накапывают реактив для определения оксидазной активности. При наличии в среде накопления помутнения и газообразования, а на секторе среды Эндо колоний одного из следующих видов: темно-красных с металлический блеском и без него, слизистых розовых крупных, с темно-красным центром, не обладающих оксидазоной# активностью - дают положительный ответ.

Если все колонии на секторе под воздействием реактива окрасились в сине-фиолетовый цвет или остались без изменения (только розовые плоские лактозоотрицательные колонии), дают отрицательный ответ.

Постановка оксидазного теста может производиться с помощью СИБ оксидазы. По 2 - 3 изолированных колонии каждого типа, выросших на секторах чашки со средой Эндо, снимают частично петлей и наносят на полоску СИБ-оксидазы (полоску помещают в чашку Петри). Оставшуюся часть колоний используют для изучения ферментации лактозы. При положительной реакции на месте нанесения культуры бумажка синеет в течение одной минуты. При отрицательной - цвет бумажной полоски не изменяется. В ряде случаев оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, особенно при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет. В таких случаях нужно пересеять колонии со среды Эндо на сектор чашки с питательным агаром или на скошенный питательный агар и после подращивания при температуре 37° +- 1,0°С в течение 3 - 5 часов пробу повторить.

После определения положительных и отрицательных результатов вычисляют число лактозоположительных кишечных палочек в 1 дм3 воды по таблице.

Таблица расчета бактерий в 1 дм3 при исследовании сточных вод

Объем исследуемой воды (см3)				Число бактерий в 1 дм3
1,0 см3	0,1 см3	0,01 см3	0,001 см3
-	-	-	-	менее 900
-	-	+	-	900
-	+	-	-	1000
+	-	-	-	2300
+	-	+	-	9400
+	+	-	-	23000
+	+	-	+	96000
+	+	+	-	238000
+	+	+	+	более 238000

Примечание: при исследовании других объемов воды индекс соответственно уменьшают или увеличивают в десятикратном размере.

______________________________

* "Методы определения вредных веществ в воде водоемов", М., "Медицина", 1981, с. 27.

** Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши", М., Гидрометеоиздат, 1977, с. 339.

Унифицированные методы исследования качества вод, СЭВ, 1977, с. 96.

Методика технологического контроля работы очистных сооружений городской канализации. М., Стройиздат, 1977, с. 60.

*** ГОСТ 18190-72 "Вода питьевая. Методы определения содержания остаточного активного хлора".

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко