Методические указания МУК 4.1.1961-05 "Определение остаточных количеств дифеноконазола в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Методические указания МУК 4.1.1961-05
"Определение остаточных количеств дифеноконазола в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Дата введения: 1 июля 2005 г.
Введены впервые

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта колоночной хроматографией на оксиде алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания сахарной и кормовой свеклы и яблок.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)	Номер Госреестра	15945-97
Весы аналитические ВЛА-200		ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +- 0,038 г		ГОСТ 7328
Колбы мерные, вместимостью 100 и 1000 см3		ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности, вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3		ГОСТ 29227
Пробирки градуированные, вместимостью 5 или 10 см3		ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности, вместимостью 25, 50, 250, 500 и 1 000 см3		ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дифеноконазол с содержанием действующего вещества 99,4% (ВНИИХСРЗ, Россия)
Алюминий оксид для хроматографии, по Брокману II, нейтральный (фирмы "Реанал", Венгрия)
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ-6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМnO4	ГОСТ 6709
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375
Метилен хлористый (дихлорметан), хч	ГОСТ 12794
Натрий серно-кислый, безводный, хч	ГОСТ 4166
Этиловый эфир уксусной кислоты, ч	ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные	ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные, вместимостью 1000 см3	ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм	ГОСТ 25336
Груша резиновая	ГОСТ 9737
Колбы плоскодонные, вместимостью 200-250 см3	ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 10, 100 и 250 см3
Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм
Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм
Насос водоструйный	ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария	ТУ 25-11-917-74
Стаканы химические, вместимостью 100 см3	ГОСТ 25336
Стекловата
Стеклянные палочки
Установка для перегонки растворителей
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа, вместимостью 50-100 мм3

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +- 5)°С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки для очистки экстракта, проверка хромато-графического поведения вещества на колонке с оксидом алюминия.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 помещают 200 деионизованной воды, 800 ацетонитрила, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 1 /мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов

7.4.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/)

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 0,01 г дифеноконазола, растворяют в 50-70 ацетонитрила, доводят ацетонирилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

Растворы N 1-6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 дифеноконазола для градуировки (концентрация 10 мкг/)

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 10 исходного раствора дифеноконазола с концентрацией 100 мкг/ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения дифеноконазола из исследуемых образцов.

7.4.3. Рабочие растворы N 2-6 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,1-1,0 мкг/)

В 5 мерных колб вместимостью 100 помещают по 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 и 10 градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 2-6 - с концентрацией дифеноконазола 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 и 1,0 мкг/, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 10 дней.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки NN 2-6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г оксида алюминия в 15-20 этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. После этого колонка готова к работе.

7.7. Проверка хроматографического поведения дифеноконазола на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 помещают 0,5 раствора N 1 для градуировки (п. 7.4.2), упаривают досуха, добавляют 2 см этилацетата, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 50 этилацетата со скоростью 1-2 капли в с. Фракционно (по 10 ) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 5 подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2), анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.3.

Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют.

Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: проверку хроматографического поведения дифеноконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителя.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 17.1.3.03-77 "Правила выбора и оценки качества источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".

Отобранные пробы воды анализируют в день отбора или хранят при 4°С в течение 10-ти дней.

Непосредственно перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 400 помещают в делительную воронку вместимостью 1 000 , добавляют 50 хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 , фильтруя его через 2 см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром "красная лента". Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями хлористого метилена по 50 . Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта

Остаток, полученный по п. 9.1, с помощью 1,5-2 этилацетата порциями переносят в колонку, подготовленную по п. 7.6, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Дифеноконазол элюируют с колонки 25 этилацетата, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 . Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С почти досуха, вносят в колбу 3-4 н-гексана, вновь упаривают. Операцию упаривания с н-гексаном повторяют трижды.

Сухой остаток в колбе растворяют в 2 подвижной фазы (приготовленной по п. 7.10) и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.3.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "п. 7.10" имеется в виду "п. 7.2"

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Perkin-Elmer (CШA).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100 С 18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (80:20, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 /мин.

Рабочая длина волны: 230 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 .

Ориентировочное время выхода дифеноконазола: 4,4-4,6 мин.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор дифеноконазола с концентрацией 1,0 мкг/, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2.

10. Обработка результатов анализа

Содержание дифеноконазола в пробе рассчитывают по формуле:

, где

Х - содержание дифеноконазола в пробе, мг/дм3;

А - концентрация дифеноконазола, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

V - объем анализируемого образца, .

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

12. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Брагина И.В. (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко