Методические указания МУК 4.1.1976-05 "Определение остаточных количеств клопиралида в семенах, масле и соломке льна, в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Методические указания МУК 4.1.1976-05
"Определение остаточных количеств клопиралида в семенах, масле и соломке льна, в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Дата введения: 1 июля 2005 г.
Введены впервые

2. Метод определения клопиралида в семенах, масле и соломке льна, в семенах и масле рапса с применением капиллярной газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении остаточных количеств клопиралида из анализируемого объекта органическими растворителями, проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилировании клопиралида диазометаном.

Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ).

2.1.2. Избирательность метода

Метод специфичен в присутствии других применяемых пестицидов. Проведение очистки экстрактов, а также использование капиллярной колонки и селективного детектора позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблице.

Таблица

Метрологические параметры метода

Метрологические параметры	Анализируемые объекты:
	семена льна и рапса	масло льна и рапса	соломка льна
Предел обнаружения, мг/кг	0,01	0,02	0,04
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	0,01-0,08	0,02-0,16	0,04-0,32
Среднее значение определения, %	80,0	77,4	80,7
Стандартное отклонение, %	5,8	6,9	5,5
Относительное стандартное отклонение, %	3,4	3,8	3,2

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Аналитический стандарт клопиралида
Азот газообразный вч	ТУ 301-07-25-89
Ацетон, осч	ТУ 2633-004-11291058-94
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-4326-76
Вата медицинская	ТУ 9393-001-00302238-97
Вода дистиллированная и перегнанная над KMnO4 и щелочью
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375-78
Дихлорметан, хч	ТУ 6-09-2662-77
Изооктан эталонный	ГОСТ 12433-83
Калия гидроокись, чда	ГОСТ 24363-80
Натрий серно-кислый б/в (сульфат), чда	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, чда	ГОСТ 4233-77
N-Нитрозометилмочевина, хч	ТУ 6-09-11-1643-82
Серная кислота, осч	ГОСТ 14262-78
Смесь н-гексан-этиловый эфир, 50:50, по объему
Фильтры бумажные, "красная лента"	ТУ 2642-001 -4262415 7-98
Фильтры бумажные, "белая лента"	ТУ 2642-001-42624157-98
Фильтры бумажные, "синяя лента"	ТУ 2642-001-42624157-98
Эфир этиловый (серный)	ОСТ 84-2006-88

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Газовый хроматограф с ДЭЗ
Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50, толщина пленки - 0,5 мкм
Аппарат для встряхивания или аналогичный	ТУ 64-1-1081-73
Весы аналитические типа ВЛА-200	ГОСТ 34104-80
Весы лабораторные типа ВЛКТ-500	ГОСТ 24104-80
Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл	ГОСТ 25336-82
Воронки химические конусные	ГОСТ 25336-82
Индикаторная бумага универсальная	ТУ 6-09-1181-76
Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл	ГОСТ 1770-74
Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов	ГОСТ Р.51314-99
Мельница электрическая лабораторная или аналогичная	ТУ 46-22-236-79
Микрошприц МШ-10	ТУ 2-833-106
Насос водоструйный	ГОСТ 10696-75
Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный
Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74
Приспособление для обжима колпачков на флаконах	ТУ 42-2-2442-73
Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл	ГОСТ 1770-74
Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл	ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении
Установка для упаривания растворителей в токе азота
Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная
Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл	ТУ 64-2-10-87
Электроплитка	ГОСТ 14919-83

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в ацетоне 0,01 г клопиралида в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4-6°С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 1,6; 0,8; 0,4 и 0,2 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клопиралида последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре 4-6°С не более месяца.

В модельных опытах при изучении полноты извлечения используют аналогично приготовленные растворы клопиралида в гексане.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов клопиралида с концентрациями 0,2; 0,4; 0,8 и 1,6 мкг/мл. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование клопиралида по п. 2.4.3.

2.4.3. Метилирование клопиралида

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой 4-6°С. После этого в пробирки добавляют по 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

2.4.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа (п. 2.7.3) вводят по 1 мкл приготовленных по п. 2.4.3 растворов, содержащих клопиралид (в виде производного) в концентрациях 0,2; 0,4; 0,8 и 1,6 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм () от концентрации клопиралида в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.5. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования экстрактов 2 проб)

N-нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0-3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 мин.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5-2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

2.5. Отбор, первичная обработка и хранение проб

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными 21.08.1979 г., N 2051-79.

Пробы семян просушивают до стандартной влажности и хранят при комнатной температуре в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы соломки просушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы масла хранят в холодильнике при 4-6°С в закрытой стеклянной таре.

2.6. Подготовка проб к определению

Пробы семян перед анализом рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы соломки измельчают и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

2.7. Проведение определения

2.7.1. Семена льна и рапса

2.7.1.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Аналитическую пробу семян массой 20 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10) и встряхивают в течение 60 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10-20 мл при температуре 40°С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4-6°С в течение 4-5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до рН 9-10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15 минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5 минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина - 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40°С до объема 3-5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40°С.

2.7.1.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5. эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12-14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4-6°С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.2. Масло льна и рапса

2.7.2.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Пробу масла массой 10,0 0,1 г растворяют в 50 мл н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин. После 5 минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 100 мл.

Колбу промывают еще 25 мл ацетонитрила (насыщенного н-гекcаном) и также переносят в воронку (250 мл). Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин, отстаивают 5 мин и нижний ацетонитрильный слой объединяют с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при температуре 50°С. Сухой остаток растворяют в 20 мл ацетона. К раствору добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4-6°С в течение 4-5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до рН 9-10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15 минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5 минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина - 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40°С до объема 3-5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40°С.

2.7.2.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12-14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4-6°С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.3. Соломка льна

2.1.3.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Аналитическую пробу соломки массой 5,0 +-0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (80:20), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (80:20) и встряхивают в течение 60 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10-20 мл при температуре 40°С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4-6°С в течение 4-5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до рН 9-10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15 минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5 минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина - 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан-этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40°С до объема 3-5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40°С.

2.7.3.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5. эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой 4-6°С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (OV-17, НР-17, DB-17), толщина слоя - 0,5 мкм.

Температура колонки: программирование от 100°С (3 мин) до 280°С (25 мин) со скоростью 8,0°С/мин.

Температура испарителя: 240°С.

Температура детектора: 300°С.

Расход газов: газа-носителя (азот вч) - 1,5 см /мин, дополнительного газа (азот вч) к ДЭЗ - 40 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 1 мкл.

Время удерживания клопиралида (в виде производного): 14,20 0,05 мин.

Предел детектирования: 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,2-2,0 нг.

2.7.5. Обработка результатов анализа

Содержание клопиралида рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

, где

Х - содержание клопиралида в пробе, мг/кг;

- высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм ();

- высота (площадь) пика стандартного вещества, мм ();

А - концентрация стандартного раствора клопиралида, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования мл;

m - масса (г) аналитической пробы.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами, а также требования, изложенные в документации к приборам.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (парвильность и прецизионность методов и результатов измерений".

5. Разработчики

П.А. Тарарин, Т.А. Маханькова, Л.В. Григорьева (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко