Методические указания МУК 4.1.1980-05 "Определение остаточных количеств протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Методические указания МУК 4.1.1980-05
"Определение остаточных количеств протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Дата введения: 1 июля 2005 г.
Введены впервые

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде в диапазоне 0,0005-0,01 мг/, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве в диапазоне 0,01-0,2 мг/кг.

2-[(RS)-2-гидрокси-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)пропил]-2Н-1 ,2,4-триазол-3(4Н)-тион(IUPAC)

Структурная формула:

"Структурная формула"

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 344,3.

Белое или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1-144,5°С. Давление паров при 20°С: Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: = 4,16 (рН 4), 3,82 (рН 7) и 2,0 (рН 9). Растворимость (г/) при 20°С: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (рН 4), 0,3 (рН 8) и 2,0 (рН 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой ( = 120 дней) и щелочной ( >1 года) средах. В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 часа. Основным продуктом фотодеградации является протиоконазол-дестио, его содержание составляет до 56%.

В почве в полевых условиях протиоконазол подвергается быстрой деградации, составляет 1,3-2,8 дней (в среднем 1,7 дней), - 4,4-9,3 дня (в среднем 5,8 дней). Отмечена заметная сорбция протиоконазола почвой. Основным почвенным метаболитом является протиоконазол-дестио. протиоконазола-дестио в почве в полевых условиях составляет 16,3-72,3 дня (в среднем 42 дня), - 54,1-240 дней (в среднем 140 дней). Протиоконазол-дестио детектирован на пределе обнаружения (6 мкг/кг) в 10-20 см слое. Максимальные его уровни наблюдались в период от 1 до 28 дней после применения, полное исчезновение (менее 6 мкг/кг) после 55-240 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность () для крыс - более 6 200 мг/кг; острая дермальная токсичность () для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность () для крыс - более 4 990 воздуха.

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665)

- (1-хлорциклопропил)-- (2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1 этанол (С.А.)

Структурная формула:

"Структурная формула"

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 312,2.

Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5°С. Давление паров при 20°С: 2,7 х Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: .

Растворимость (г/) при 20°С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051. Стабилен в кислой и щелочной средах ( > 5 000 ч).

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблице.

Таблица

Метрологические параметры

Определяемое вещество	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение S, %	доверительный интервал среднего результата, %
Вода
Протиоконазол	0,0005	0,0005-0,01	94,63	6,77	+-3,5
Протиоконазол-дестио	0,0005	0,0005-0,01	93,61	5,50	+-2,9
Почва
Протиоконазол-дестио	0,01	0,01-0,2	85,89	4,20		+-2,9

2. Метод измерений

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки пробы воды использованы патроны для твердофазной экстракции С18 Sep Pak. Контроль протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в образцах почвы осуществляется по содержанию протиоконазола-дестио после экстракции из анализируемого образца смесью ацетонитрил-вода, очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)	Номер Госреестра 15945-97
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +- 0,038 г	ГОСТ 7328
Колбы мерные 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770
Меры массы	ГОСТ 7328
Пипетки градуированные 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3	ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5 см3	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2 класса точности вместимостью 25, 50, 100, 500 и 1 000 см3	ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Протиоконазол, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,8% (Байер, Германия)
Протиоконазол-дестио, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,5% (Байер, Германия)
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-4326-76
Вода деионизованная	ГОСТ 6702
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375
Кислота ортофосфорная, хч, 85%	ГОСТ 6552
Кислота уксусная, лед	ГОСТ 61
Метилен хлористый (дихлорметан), хч	ГОСТ 12794
Метиловый спирт (метанол), хч	ГОСТ 6995
Натрий серно-кислый, безводный, хч	ГОСТ 4166
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233
L-Цистеин гидрохлорид, для синтеза (Мерк, ФРГ)
Этиловый эфир уксусной кислоты, ч	ГОСТ 22300
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с	ТУ 64-1-2851-78
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги
Ватман 3 ММ	ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные, вместимостью 250 см3	ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм	ГОСТ 25336
Груша резиновая
Дефлегматор елочный	ГОСТ 9773
Колбы плоскодонные, вместимостью 100, 250, 400-500 см3	ГОСТ 9737
Колбы грушевидные на шлифе, вместимостью 100-150 см3	ГОСТ 9737
Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм
Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный	ГОСТ 10696
Стаканы химические, вместимостью 100, 500 см3	ГОСТ 25336
Стекловата
Стеклянные палочки
Патроны для твердофазной экстракции С18 Sep Pak (Waters, США)
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария	ТУ 25-11-917-74
Установка для перегонки растворителей
Холодильник водяной обратный	ГОСТ 9737
Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая кромасил 100 С18, зернением 8 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа, вместимостью 50-100 мм3
Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью 20 см3	ГОСТ 22090

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +- 5)°С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующих патронов С18 Sep Раk.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия, перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Приготовление 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1 000 помещают 1,36 85%-й ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление 0,05%-го раствора уксусной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1 000 помещают 300-400 дистиллированной воды, вносят 0,5 ледяной уксусной кислоты, перемешиают#, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

7.4. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15-20 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 этилацетата со скоростью 1-2 капли в с, затем 20 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). После этого колонка готова к работе.

7.5. Проверка хроматографического поведения протиоконазола-дестио на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 помещают 0,5 градуировочного раствора N 1 протиоконазола-дестио с концентрацией 10 в ацетонитриле (п. 7.9.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 0,5 этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин, добавляют 2,5 гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Промывают колонку 25 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 смеси гексан-этилацетет (60:40, по объему). Фракционно (по 10 ) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин, вносят 1 подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

7.6. Подготовка концентрирующего патрона С18 Sep Pak

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1-2 капли в с, затем 5 0,05%-ного раствора уксусной кислоты. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

7.7. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1 000 помещают 600 ацетонитрила, 400 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.8. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1 не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.9. Приготовление градуировочных растворов

7.9.1. Исходные растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 500 ). В мерную колбу вместимостью 100 помещают 0,05 г протиоконазола (или протиоконазола-дестио), растворяют в 40-50 ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение 3-х месяцев.

7.9.2. Растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио N 1 для градуировки (концентрация 10 ). В мерную колбу вместимостью 100 помещают 2 исходного раствора протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 500 (п. 7.9.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Этот раствор используют для приготовления проб воды с внесением при оценке полноты извлечения протиоконазола и протиоконазола-дестио из исследуемых образцов. Для внесения в образцы почвы используют растворы с концентрацией 10 , приготовленные в смеси метанол-вода-цистеин гидрохлорид (100:900:0,01; объем/объем/вес).

Градуировочные растворы N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение месяца.

7.9.3. Рабочие растворы N 2-5 протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 0,05-1,0 ).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 градуировочного раствора N 1 протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 10 (п. 7.9.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.7, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 2-5 с концентрацией протиоконазола (или протиоконазола-дестио) 0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 , соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед употреблением.

7.10. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации протиоконазола (или протиоконазола-дестио) в растворе (), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", 26950-89 "Почвы. Отбор проб".

Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С не более 2 недель.

Образцы почвы подсушивают на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С не более 4 недель.

Для длительного хранения образцы почвы замораживают и хранят при температуре -18°С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы - просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

Образец отфильтрованной воды объемом 200 помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250-300 с пришлифованной пробкой, вносят 0,01 г цистеина гидрохлорида и 0,1 ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают.

Подготовленную пробу вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.6 со скоростью пропускания раствора 1-2 капли в с. Операцию осуществляют в затемненном помещении. После нанесения пробы патрон промывают 5 смеси ацетонитрил - 0,05%-ая уксусная кислота (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 2 смеси ацетонитрил - 0,05%-ая уксусная кислота (9:1, по объему), собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола и протиоконазола-дестио по п. 9.3.

9.2. Почва

9.2.1. Экстракция

Образец сухо-воздушной почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 , добавляют 100 смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 ч.

Раствор (с осадком почвы) фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 с пришлифованной пробкой через складчатый бумажный фильтр, помещенный на конусную воронку. Осадок на фильтре промывают 25 смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему). Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.2.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~10 ) при температуре не выше 35°С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. К водному остатку прибавляют 40 деионизованной воды и 5 г хлорида натрия, перемешивают до полного растворения соли и переносят в делительную воронку вместимостью 250 . В воронку вносят 30 хлористого метилена, интенсивно встряхивают воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 . Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 0,5 этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин, добавляют 2,5 гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Колбу обмывают трижды порциями по 3 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1-2 капли в с, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 40 смеси гексан-этилацетат (60:40, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 1 ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин, вносят 1 подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая кромасил 100 С18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02 М ортофосфорная кислота (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 1 .

Рабочая длина волны: 213 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 .

Ориентировочное время выхода протиоконазола-дестио: 6,4-6,6 мин; протиоконазола: 9,4-9,7 мин.

Линейный диапазон детектирования 1-20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 , разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3.

10. Обработка результатов анализа

10.1. Вода

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (X, ) рассчитывают по формуле:

, где

А, Б - концентрации протиоконазола и протиоконазола-дестио, соответственно, найденные по градуировочным графикам, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

W - объем анализируемого образца, .

К - коэффициент пересчета содержания протиоконазола-дестио на эквивалент протиоконазола, по соотношению молекулярных масс (равен 1,103).

10.2. Почва

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

, где

Б - концентрация протиоконазола-дестио, найденная по градуировочному графику, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

m - масса анализируемого образца, г.

K - то же, что и в п. 10.1.

С - коэффициент пересчета на полный объем экстракта (равен 2).

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

12. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Брагина И.В. (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко