Методические указания по унифицированному методу микробиологического определения в объектах окружающей среды биологических инсектицидных препаратов на основе кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис (утв. Минздравом СССР 31 июля 1973 г. N 1112-73, 18 октября 1977 г. N 1796-77)

Методические указания
по унифицированному методу микробиологического определения в объектах окружающей среды биологических инсектицидных препаратов на основе кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис*
(утв. Минздравом СССР 31 июля 1973 г. N 1112-73, 18 октября 1977 г. N 1796-77)

ГАРАНТ:

О дополнении настоящих методических указаний см. Методические указания по измерению концентраций ДДТ и его производных, гексахлорбензола, изомеров ГХЦГ и метоксихлора в воздухе методом газожидкостной хроматографии, утвержденные Министерством здравоохранения СССР 8 июня 1989 г. N 5032-89

Настоящие методические указания распространяются на микробиологический метод определения содержания бактериальных инсектицидных препаратов (лепидоцид, инсектин, гомелин, битоксибациллин, БИП, дипел и т.п.) в воздухе, на растениях, почве, воде и других объектах окружающей среды при санитарном контроле.

Краткая характеристика препаратов. Бактериальные инсектицидные препараты состоят из энтомоцидного компонента (споры, токсины и другие продукты жизнедеятельности кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис) - 10 - 60% и инертного наполнителя (каолин, хлористый натрий и т.п.) - 40 - 90%. Препараты представляют собой мелкодисперсные порошки аморфной структуры серого или коричневого цвета. Имеют слабый специфический запах. В воде образуют малостойкую суспензию. Споры бацилл турингиензис и термостабильный -экзотоксин выдерживают длительное кипячение, а кристаллоиды белоксодержащего эндотоксина разрушаются при температуре 60°С и выше.

Бациллы турингиензис не развиваются и не размножаются в теплокровном организме, безопасны в эпидемиологическом отношении.

Бактериальные инсектицидные препараты малотоксичны - для белых мышей, крыс и морских свинок при введении в желудок более 5 г/кг. Раздражающее и аллергенное действие препаратов не исключается.

Препараты применяются в качестве инсектицидов кишечного действия. Высокоэффективны в борьбе с пяденицами, совками, листовертками, огневками и другими насекомыми на полевых, садовых культурах и лесонасаждениях.

Утвержденные или рекомендованные предельно допустимые уровни загрязнения объектов окружающей среды бактериальными инсектицидными препаратами составляют: ПДК в воздухе рабочей зоны - микробных тел (м.т.) в 1 ; в атмосферном воздухе населенных пунктов - ; в воде водоемов санитарно-бытового водопользования - м.т/л; в почве - нет необходимости нормировать; МДУ и пищевых продуктах - м.т/кг.

Принцип метода. Метод основан на получении смыва с фильтрующего материала, растений и посеве его на плотную питательную среду, выращивании бацилл турингиензис при оптимальной температуре, идентификации и подсчете выросших колоний, расчете содержания препарата в исследуемом объекте.

Метрологическая характеристика метода. Диапазон определения концентраций - от м.т/мл. Предел обнаружения - м. воздуха; м.т/кг пищевого продукта и т.п. Среднее значение определения стандартных количеств препарата - 80% при 6 исследованных параллельных пробах. Стандартное отклонение отдельного определения +-10,5%. Относительное стандартное отклонение 0,13. Доверительный интервал среднего значении из 6 определении при надежности 0,95 равен +-13,8%.

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий.

Реактивы и материалы. Аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы типа АФА-БА, АФА-ХА и т.п. Иммерсионное масло. Малахитовый зеленый, 5%-ный водный раствор. Метиленовый синий, 0,3%-ный спиртовой раствор. Мясо-пептонный агар 1,5%-ный, рН 7,0 - 7,2. Физиологический раствор (0,85%-ный водный раствор хлорида натрия) стерильный. Формалин. Эозин, 0,5%-ный водно-карболовый раствор.

Приборы, аппаратура, посуда. Автоклав. Аппарат для встряхивания. Водяная баня. Колбы на 100 мл. Микроскоп. Петля микробиологическая. Пипетки на 1 и 10 мл. Пробирки. Резиновые соединительные трубки. Стекла предметные. Термостат. Фильтродержатели. Чашки Петри. Шпатель Дрыгальского. Эксикатор. Электроаспиратор.

Посуду и питательные среды стерилизуют в автоклаве при 120°С 30 мин. Аналитические фильтры стерилизуют в эксикаторе в парах формалина в течение 24 ч.

Отбор проб. Бактериальные инсектицидные препараты (бацилл турингиензис) улавливают из воздуха на аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы путем фильтрации через них воздуха. Через фильтр просасывают 10 - 100 мл воздуха со скоростью 5 - 15 л/мин и более. Пробы растений, почвы и других объектов окружающей среды отбирают в количестве 100 - 150 г. Пробы отбирают и хранят, соблюдая стерильность. Хранят при температуре 2 - 5°С.

Ход анализа. Аналитический фильтр или навеску растений, почвы и т.п. в количестве 1 - 2 г помещают в колбу, заливают 10 - 20 мл физиологического раствора и смывают бациллы турингиензис путем встряхивания в течение 20 - 30 мин. Затем колбу помещают в водяную баню с температурой воды 80°С на 10 мин. Из пастеризованного смыва готовят разведения в физиологическом растворе 1:10, 1:100, 1:1000 и т. д. На чашки Петри с мясо-пептонным агаром засевают по 0,1 мл исходного смыва и его разведений (в зависимости от предполагаемого бактериального обсеменения исследуемой пробы). На каждое разведение используют по 2 - 5 чашек. Чашки Петри помещают в термостат с температурой нагрева 28°C. Через 48 - 72 ч проводят идентификацию и подсчет колоний бацилл турингиензис. При идентификации учитывают внешний вид колоний (компактные, 1,5 - 2,5 мм в диаметре, сероватого цвета с ризоидными краями) и готовят из "характерных" колоний препараты для микроскопического исследования.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и микробную массу из части колонии, смешивают и распределяют на площади 1 - 2 , высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и красят раствором метиленового синего в течение 2 - 3 мин. Рассматривают препарат в микроскоп через иммерсионную систему.

Бациллы турингиензис - сине-фиолетовые крупные палочки ( мкм) с закругленными концами, единичные или в виде нитей из 5 - 10 клеток. Через 48 - 72 ч роста на мясо-пептонном агаре бациллы турингиензис образуют споры (овальной формы,  мкм, размещены около центра клетки) и кристаллоидные белоксодержащие включения эндотоксина (ромбовидной или овальной формы, мкм). Для дифференциации бацилл турингиензис от бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий применяют специальный метод окраски препаратов.

Мазок красят раствором малахитового зеленого при подогреве над пламенем горелки до появления паров, промывают водой и докрашивают в течение 30 с водно-карболовым раствором эозина. При этом способе окраски споры становятся зелеными, а кристаллы эндотоксина - красными. Бациллы цереус и другие почвенные спорообразователи не содержат указанных внутриклеточных включений, что и служит дифференциальным признаком.

После идентификации подсчитывают колонии бацилл турингиензис, выросшие на каждой чашке Петри. В расчет обсемененности исследованной пробы принимают то разведение смыва, при дублированном посеве которого на чашках Петри выросло по 25 - 250 колоний бацилл турингиензис.

Обработка результатов анализа. Концентрацию бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе воздуха (Х, ), почвы, растений и т.п. (X, м. т/кг) рассчитывают по формуле

где А - среднее значение количества колоний бацилл турингиензис на чашках Петри, засеянных принятым в расчет разведенным смывом;

В - принятое в расчет разведение смыва (1, 10, 100 и т.п.);

V - объем засеянного на чашку Петри разведенного смыва, мл;

- объем смыва, мл;

- объем пробы воздуха, приведенный к нормальным условиям, или навеска пробы растений, почвы, л или г;

1000 - коэффициент пересчета в или г в кг.

Концентрация бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе может быть представлена в весовых единицах (, мг/кг), для чего в знаменатель формулы следует ввести коэффициент С - стандартное содержание бацилл турингиензис в препарате, м. т/мг.

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работ с непатогенными культурами бактерий и других микроорганизмов.

_____________________________

* Разработаны В.И. Мурзой (ВНИИГИНTOKC) взамен "Определения энтобактерина в капусте, яблоках и смородине" (разработчик С.А. Ивашина) 31.07.73 N 1112.73; "Микробиологического метода определения энтобактерина в воздухе рабочей зоны" (разработчик В.И. Мурза) 31.07.73 N 1112-73 и "Методических указаний по определению гомелина в объектах окружающей среды микробиологическим методом" (разработчик В.И. Мурза) 18.10.77 N 1796-77.