Методические указания по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ от 27 сентября 1999 г. N 13-4-2/1742)

2. Отбор и транспортировка проб воды и грунта

2.1.Отбор проб воды из больших водоемов производится в нескольких местах с учетом гидробиологических особенностей каждого участка (заросли, отмели, песчаные и заболоченные участки и т.д.). Водоемы однотипные по гидробиологическим условиям исследуют в одном-двух местах на расстоянии 34 м от берега. Пробы берут на глубине 10 - 15 см от поверхности и не менее 10 - 15 см от дна, в зимовальных прудах и в других водоемах в зимний период из проруби - на глубине 10 - 15 см от нижней поверхности льда. Для контроля над течением микробиологических процессов и состоянием рыбы в прудах отбирают также несколько проб по вертикали. Выемку проб осуществляют на притоке, в средней части и у водовыпуска. В неблагополучных по инфекционным заболеваниям водоемах пробы воды отбирают 1 - 2 раза в месяц через равные промежутки времени. При комплексных исследованиях сначала отбирают пробы для микробиологических, затем химических и гидробиологических исследований.

2.2. Способы отбора проб воды могут быть различными, но обязательным условием является соблюдение асептики и взятие материала в стерильную посуду. Пробы воды в количестве 500 мл отбирают в стерильную посуду с притертой каучуковой или корковой пробкой. Наполняют флаконы или склянки с таким расчетом, чтобы при транспортировке не замочить пробку. Посуду и батометры стерилизуют завернутыми в бумагу и разворачивают их непосредственно перед взятием проб воды.

2.3. Пробы воды исследуют не позднее, чем через 2 ч после отбора. При невозможности выполнения этих условий допускается проведение анализа не позднее, чем через 24 ч после отбора проб, сохраняя при этом пробы при температуре от 1 до 5°С. При этом обязательным условием является фиксация их формалином из расчета 2 - 3 капли (0,1 мл) 40%-ного раствора на 100 мл воды. Склянки с зафиксированными пробами плотно закрывают притертыми пробками, на которые надевают резиновые колпачки. Посуду с пробами упаковывают в сумки-холодильники или в ящики с теплоизолирующей прокладкой. При транспортировке проб избегают различных толчков, которые могут привести к намоканию пробок.

2.4. Отобранные пробы сопровождаются документом, содержащим следующие сведения:

- точное месторасположение водоема;

- дату отбора (с указанием года, месяца, числа и часа);

- количество отобранных проб и место их отбора;

- цель исследования: сделан ли отбор в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (сигналы об эпизоотологическом неблагополучии и т.д.); Сопроводительный документ подписывает лицо, отбиравшее пробы, с указанием места работы и должности.

2.5. В стационарно неблагополучных по инфекционным заболеваниям рыбохозяйственных водоемах следует иметь микробиологическую характеристику грунта ложа водоема. Грунт обследуют до и после проведения оздоровительных мероприятий (дезинфекции, летования и др.).

Пробы грунта отбирают стеклянными трубочками или специальными колонками в емкости и транспортируют в лаборатории, соблюдая правила асептики. Учитывается масса ила, взятого для исследования (внесенного в емкость для разведения физраствором), для получения общепринятым методом дальнейших разведений определенной кратности (десятикратного, стократного и т.д. до 1 млрд.).

Дальнейшие исследования проводят теми же методами, что и анализ воды. Расчет количества микроорганизмов ведется на 1,0 г поверхностного слоя грунта.

3. Методы исследований

Санитарно-бактериологическую оценку водоема проводят по следующим показателям: МАФАнМ - мезофильно-аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы (общее микробное число - ОМЧ или сапрофитные микроорганизмы); коли-титр (определение титра бактерий группы кишечных палочек) - показатель фекального загрязнения; наличие аэромонад и псевдомонад (показатели возможного неблагополучия водоемов по аэромонозу и псевдомонозу).

3.1. Определение микробного числа (МАФАнМ КОЕ/куб.см (г) воды (грунта). Микробное число определяют чашечным методом, методом предельных разведении или

- ориентировочно,

- пробой с резазуринатом натрия.

3.1.1. Проба с резазуринатом натрия.

Метод используют как ориентировочный, не исключающий определение микробного числа чашечным методом или методом предельных разведении. В зависимости от количества микроорганизмов в исследуемой пробе через определенное время происходит изменение синего цвета раствора резазурината натрия в фиолетовый, красный или обесцвечивание.

К 9,0 мл исследуемой воды добавляют 1,0 мл стерильного мясо-пептонного бульона (МПБ) и 1,0 мл 0,01%-ного водного раствора резазурината натрия (резазурина). Содержимое пробирок перемешивают, и пробы помещают в термостат при температуре 37°С. Одновременно ставится контроль: 9 мл дистиллированной воды + 1,0 мл МПБ + 1,0 мл 0,01%-ного водного раствора резазурината натрия. Через каждый час визуально учитывают результаты. Изменение цвета в фиолетовый через 2 - 3 часа и в красный (розовый) через 3 - 4 часа свидетельствует о неудовлетворительном, а в фиолетовый через 4 - 5 и красный (розовый) через 6 - 7 часов - о сомнительном, в более поздние сроки - об удовлетворительном качестве воды. Цвет среды в контрольных пробирках должен быть синим. Раствор резазурината натрия готовят перед использованием.

3.1.2. Чашечный метод.

Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой воды или ее разведении в чашки Петри в глубину агара и последующем подсчете выросших колоний. При этом исходят из того, что каждая колония является результатом размножения одной клетки.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведении, посев в чашки Петри, подсчет выросших колоний. Разведения готовят в стерильном физрастворе, пользуясь постоянным коэффициентом разведения, равным 10.

Для приготовления разведении физраствор разливают по 9,0 (4,5) мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1,0 (0,5) мл исследуемой воды, взятой стерильной пипеткой, переносят в пробирку с физраствором - это первое разведение 1:10. Полученную в первом разведении суспензию тщательно перемешивают стерильной пипеткой. Этой же пипеткой берут 1,0 (0,5) мл полученного разведения и переносят во вторую пробирку с физраствором - это второе разведение 1:100. Таким же образом готовят и последующие разведения.

Заранее приготовленный МПБ подогревают на водяной бане до 45°С. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и степень разведения. Из каждой пробы воды и ее разведении производят посев по 1,0 мл параллельно на две чашки с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний.

С флаконов, содержащих исследуемую воду, снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку. Эту операцию производят перед приготовлением разведении.

Стерильной пипеткой отбирают 1 мл воды (и ее разведении) вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. При этом для каждой пробы воды и для каждого разведения используется отдельная стерильная пипетка. Посевы из разведении можно делать одной пипеткой, но начинать следует обязательно из большего разведения.

После внесения воды (и ее разведении) в эти чашки, с соблюдением условий стерильности, заливают остуженный питательный агар в количестве 10,0 - 12,0 мл. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку. Необходимо полностью заливать дно чашки, избегая попадания среды на края и образования пузырьков воздуха. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки с посевом помещают в термостат вверх дном. Посевы выращивают при температуре 27°С в течение 5 суток.

Подсчет колоний, выросших на поверхности и в глубине агара, производят при помощи лупы. Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчет колоний при помощи счетной пластинки с лупой при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью в 1 кв.см в разных местах чашки, выводят среднее арифметическое число колоний на 1 кв.см, величину которого умножают на площадь чашки по формуле

                               S = л кв.R,

     где

     R - радиус чашки (см).

Результат подсчета колоний на каждой чашке выражают в количестве бактерий в 1,0 мл с учетом произведенных разведении. За окончательное количество бактерий в 1,0 мл исследуемой воды или разведении принимают среднее арифметическое из результатов подсчета на двух параллельных чашках.

Учет количества колоний можно вести, ориентируясь на одну чашку в случаях, если на другой: а) при посеве из разведения выросло менее 20 колоний; б) ползучий рост бактерий, распространившийся на всю поверхность чашки или значительные зоны, маскирует рост других колоний; в) количество колоний превышает 300.

3.1.3. Метод предельных разведении.

Метод включает приготовление разведении, посев в жидкую питательную среду МПБ, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исследуемой воды по таблице Мак-Креди (см. приложение 1).

Чашечный метод определения количества микробных клеток обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных разведении, однако при посеве на МПА в чашки иногда происходит зарастание агара микрофлорой, обладающей ползучим ростом. В этом случае метод предельных разведении является более приемлемым. Приготовление разведении производится точно так же, как и для чашечного метода. Посев в мясо-пептонный бульон производится при соблюдении условий стерильности в количестве 1,0 мл каждого разведения параллельно в 3-5 пробирок, содержащих по 5,0 мл МПБ. Результаты учитывают через 5 суток. После инкубации при температуре 27°С регистрируют наличие или отсутствие роста микроорганизмов визуально (помутнение среды, образование пленки, осадка). Наиболее вероятное количество микробных клеток в единице объема определяют с помощью таблицы, разработанной на основании методов вариационной статистики Мак-Креди (см. приложение 1).

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП).

Обнаружение в воде кишечных палочек следует рассматривать как показатель поступления в пруды животноводческих или городских сточных вод, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения. Наличие и количественный учет кишечных палочек определяют бродильным методом. Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды в среды накопления и подращивания при температуре 37 +-0,5°С с последующим пересевом на плотную питательную среду Эндо и дифференциацией выросших бактерий. Пробы воды и их разведения высевают по 1,0 или 0,5 мл (в зависимости от количества среды в соотношении 1:10) в глюкозо-пептонную среду (ГПС) или среду ВНИИВС.

Посевы инкубируют при температуре 43 :Н),5°С в течение 24 ч. Отсутствие помутнения, образование кислоты и газа в ГПС или помутнение и изменение цвета среды ВНИИВС из сиреневого в салатный дают основание предположить наличие бактерий группы кишечной палочки. В этих случаях производят пересев на среду Эндо. Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии. Для этого производят пересев бактериологической петлей штрихами по поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37 +-0,5°С в течение 24 - 48 ч.

При росте на среде Эндо темно-красных колоний с металлическим блеском их принадлежность к БГКП подтверждают микроскопированием мазков, окрашенных по Граму, и постановкой оксидазного теста. Наличие мелких неспорообразующих грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют дать заключение о содержании кишечной палочки в анализируемой пробе воды.

Для постановки оксидазного теста берут петлей 2 - 3 изолированные колонии, выросшие на среде Эндо, и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную соответствующим реактивом (см. приложение 3, п.6). При отрицательной реакции на оксидазный тест фильтровальная бумага не изменяет цвета в течение 1 - 2 мин. после нанесения бактериальной массы. При активной реакции на оксидазу фильтровальная бумага синеет в течение 1-2 мин. Определение титра БГКП (коли-титра) проводят установлением наименьшего количества воды, в котором находится одна кишечная палочка.

3.3. Индикация и количественный учет условно-патогенной для рыб микрофлоры.

3.3.1. Индикация и количественный учет аэромонад.

Наличие A. hydrophila определяют следующим образом. Пробы воды и их разведения высевают по 0,2 мл на среду Эндо с молоком. Посевы инкубируют в термостате при температуре 28 +-0,5°С в течение 24 - 48 ч. Рост матовых слегка выпуклых колоний с зоной просветления позволяет предположить наличие аэромонад. Для подтверждения производят микроскопирование мазков, окрашенных по Граму, и проверяют на оксидазную активность. Наличие мелких неспорообразующих грамотрицательных палочек в мазках и положительный оксидазный тест позволяют дать заключение о содержании в исследуемой воде аэромонад.

Двухэтапный метод. Пробы воды и их разведения высевают по 0,5 мл в жидкую среду накопления, в состав которой входят: сульфат магния, IG Н Р 04 , желатин, крахмал (среда А-1). Через 24 ч инкубирования посевов в термостате при температуре 30°С производят пересев на плотную дифференциально-элективную среду, в состав которой кроме перечисленных компонентов (среда А-1) входят: водный раствор кристаллического фиолетового и трифенилтетрахлорид (среда А-2). Посевы на плотной элективной среде инкубируют в термостате при температуре 28 - 30°С в течение 42 - 48 ч. Характеристика колоний аэромонад на плотной дифференциально-элективной среде (среда А-2): крупные с вишневым центром и узким бесцветным ободком.

3.3.2. Индикация и количественный учет псевдомонад.

Наличие Р. fluorescens определяют трехэтапным методом:

1. Накопление в жидкой среде обогащения;

2. Выделение на плотной селективно-дифференциальной среде;

3. Идентификация с использованием ограниченного набора наиболее необходимых тестов.

Первый этап: из разведении проб воды производят посев в среду обогащения - жидкую среду с трифенилтетразолхлоридом (ТТХ) (состав среды см. в Приложении 3). 8%-ный водный раствор ТТХ в дистиллированной воде прибавляют к среде в соотношении 1:10. Посевы инкубируют при температуре 42°С в течение 24 - 42 ч.

Второй этап: из среды обогащения производят пересев на плотную селективнодифференциальную среду "блеск", разлитую в чашки Петри. Для получения изолированных колоний целесообразнее производить высев бактериологической петлей. Засеянные чашки помещают в термостат при температуре 28 - 37°С на 24 - 42 ч. Колонии Р. fluorescens либо сплошь покрыты золотистым налетом, либо имеют многочисленные вкрапления, обрамленные светло-красным ободком или бесцветным венчиком. Характерным признаком является появление золотистого или металлического блеска. Наиболее типичные колонии на среде "блеск" подвергают идентификации путем высевов: на среду Кинга-А; специальную среду для определения оксидации мальтозы с бромтимоловым синим; среду для определения теста ХьюЛейфсона (оксидация и ферментация) с феноловым красным, среду для определения нитратнитритредуктазы и на реакцию цитохромоксидазы по Гэби и Хедли.

4. Оценка результатов

4.1. Водоемы, используемые в рыбоводстве, условно разделяют на три категории (таблица I):

Таблица 1

Категории водоемов по степени бактериальной обсемененности

Категории	Допустимый предел бактериальной обсемененности
Категории	Микробное число в 1 мл	Колииндекс	Аэромонад	Псевдо-мо- над	Оценка
Первая	10(3)	5	0	0	Чистые
Вторая	10(3) - 10(5)	10	10	10	Загрязнен- ные
Вторая		П-	П-	П-
Третья	106	10	10	10	Грязные
Третья		П+	П+	П+

Примечание: П- недопустимо наличие патогенных для рыб микроорганизмов.

П+ Возможно наличие патогенных микроорганизмов.

Определение патогенности выделенных штаммов - см. Методические указания по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности, утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 09.12.97 г,N 13-4-2/1116.

4.2. Ветеринарно-санитарным требованиям отвечают водоемы первой категории (чистые). Водоснабжение рыбоводных водоемов осуществляется из водоемов первой категории.

4.3. Возможна эксплуатация в целях рыборазведения водоемов второй категории (загрязненные). В этой категории водоемов в течение сезона эксплуатации происходит колебание МАФАнМ от 102 -103 до105 -106 .

4.4. В случае повышения МАФАнМ до 105 - 106 должны быть приняты меры по его снижению за счет увеличения проточности, уменьшения кормления рыб и др. При таких показателях микробного числа нередко наступают "заморные явления", возникают инфекционные заболевания.

4.5. В водоемах с содержанием бактерий группы кишечной палочки более 10 микробных клеток в 1,0 мл (с коли-титром ниже 0,1, коли-индексом около 10.000) должны быть приняты меры к устранению причин фекального загрязнения воды.

4.6. Недопустимо использование для рыбоводства водоемов третьей категории (грязные), не приведенных в соответствие с санитарными требованиями. Это, как правило, стационарно неблагополучные по инфекционным заболеваниям рыб пруды, не полностью спускаемые или заполняемые водой с высокими показателями МАФАнМ и низким коли-титром.

Водоснабжение их осуществляется зачастую паводковыми водами. Такие водоемы должны иметь минимальную плотность посадки рыб; выводиться на летование. В них должны быть проведены дезинфекция и другие оздоровительные мероприятия. При возможности проводят реконструкцию системы водоснабжения, обеспечивающую удовлетворительное санитарное состояние водоема.

Эффективность дезинфектантов зависит от почвенно-климатических условий. Поэтому для каждого хозяйства рекомендуется подобрать то средство (и его количество), которое более эффективно и доступно в конкретных условиях, предварительно определив рН, буферность грунта, а также общее микробное число до и после контрольной (пробной) дезинфекции.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.