Приложение. Порядок идентификации генно-инженерно-модифицированных сельскохозяйственных растений с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе

Приложение
к приказу Минсельхоза РФ
от 22 июня 2006 г. N 181

Порядок
идентификации генно-инженерно-модифицированных сельскохозяйственных растений с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе

1. Область применения

1.1. Настоящий Порядок разработан для идентификации генно-инженерно-модифицированных сельскохозяйственных растений, в том числе семян, с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе.

1.2. Порядок может применяться в лабораториях (испытательных Центрах) Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору, Государственной семенной инспекции Российской Федерации, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке.

1.3. Порядок определяет схему одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении лабораторных исследований с целью выявления трансформационного события в сельскохозяйственных растениях.

2. Общие положения

Порядок содержит описание методик идентификации генно-инженерно-модифицированных сельскохозяйственных растений, в том числе семян, с помощью набора реагентов и применения ферментного анализа на биологическом микрочипе.

Методики основаны на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методиками одновременно устанавливаются наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptIl). Идентификация этих последовательностей позволяет проверить сельскохозяйственные растения на наличие трансформационного события. Чувствительность метода не менее 10(-12) г (1пг) ДНК.

Идентификация различных рекомбинантных последовательностей ДНК производится в каждом отобранном образце (пробе) сельскохозяйственного растения.

Результаты испытаний образцов, отобранных от каждой партии сельскохозяйственных растений в соответствии с нормами, изложенными в разделе 5 настоящего Порядка, оформляются Протоколом исследований (приложение 2).

Протокол испытаний оформляется на каждый проанализированный образец сельскохозяйственного растения.

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, используемые при определении трансформационного события

3.1. Аппаратура и инструменты

3.1.1. Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0.2, 0.5 см3 со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1.5°С/с ТУ 9642-001-4648062-98.

3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.

3.1.3. Компьютерная программа типа "Агга" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса " ДЕГМИГЕН-001".

3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1А).

3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 42°С, рабочий диапазон от 20°С до 60°С, точность поддержания температуры +-1°С ТУ42-61961.

3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +-0,0001 г.

3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120°С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2°С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5.

3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая температуру минус 20°С.

3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.

3.1.10. Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой вращения не менее 13000 мин(-1)

3.1.11. Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3 000 мин(-1)

3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72.

3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5-10,0 мм3 (шаг - 0,1 мм3, точность +-2,5% - 10,0%, воспроизводимость 3% - 7%); 0,5-50,0 мм3 (шаг - 0,5 мм3, точность +-2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0-200,0 мм3 (шаг - 1,0 мм3, точность +-1,5% - 2,0%, воспроизводимость 2% - 3%); 100-1000 мм3 (шаг - 5 мм3, точность +-1,0% -1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000-10000 мм3 (шаг - 10 мм3, воспроизводимость 1%-2%).

3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84 или других видов

Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками отечественного и зарубежного производства.

3.2. Лабораторная посуда и материалы

3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.

3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1 000 см3 ГОСТ 12738-77.

3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82

3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1 000 см3 ГОСТ 1770-74.

3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф, вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см3.

3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1 000; 10 000 мм3.

3.3. Реактивы и реагенты

3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).

3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.

3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х/ч ТУ 6-09-11-1721-83.

3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.

3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.

3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.

3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.

3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.

Примечание: Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000 или EN 29 000.

3.3.9. Набор реагентов для выявления трансформационного события на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций.

3.3.10. Набор реагентов для пробоподговки# (бисер - 30 г., лизирующий реагент-60 см3 (2 флакона), сорбент-2 см3 (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 см3, экстракционный раствор - 10 смз) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в 4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.

3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004 (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 см3, праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

- 35S_п 5' CGG СТА СТС САА GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA (39 н.о.);

- 35S_o* 51 CCA ТТТ ТСС ТТТ ТТТ ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG А (40 н.о.);

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

- gus_ 5'АСС GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.);

- gus_o* 51 TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);

праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

- nos_n 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.);

- nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Тп5 бактериального происхождения:

- npt_п 5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);

- npt_o* 5' ACC CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);

праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

- ocs_n 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.);

- ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 см3.

Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; npII_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o*; npII_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.

3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC - 50 см3; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 см3 с концентрацией 1 мг/см3, 1 пробирка

Примечание: Срок годности реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2°С до +8°С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20°С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.

4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов

4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)

В мерной колбе на 100 см3 растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 см3 дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси довести рН раствора до 8,0 дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года.

4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS. Растворить 10 г SDS в 90 см3 дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года.

4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера. Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 см3) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 см3 и 96%-ным этиловым спиртом до отметки 300 см3 и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4°С.

5. Отбор проб сельскохозяйственных растений для анализа

Отбор проб проводят в следующем порядке:

от партий весом до 5 тонн отбирают один образец, до 10 тонн - не менее 2 образцов, до 20 тонн - не менее трех образцов, до 50 тонн - не менее 5 образцов.

Число проб, отбираемых от партий весом более 50 тонн, определяют исходя из расчета: 5 образцов на каждые 50 тонн от общего веса партии.

Исследования проводятся по схеме 1 отобранный образец - 1 исследование на ГМО.

6. Проведение анализа. Выделение ДНК

6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5 см3 внести 300 мг бисера и 70-80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-соль ЭДТА и термостатировать при 65°С в течение 30-60 мин. Время инкубации составляет до 60 мин для зерна. Через каждые 10-15 минут гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).

6.2. К содержимому пробирки добавить 400 мм3 Лизируюшего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65°С 60-120 мин.

6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 мм3 бидистиллированной воды и перемешать на вортексе.

6.4. Центрифугировать пробу 1 мин при 5000 g (12 000 об/мин). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.

6.5. Добавить 20 мм3 сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10-20 об/мин).

6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5 000 g.

6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 мм3 Лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.

6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 см3 рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5-10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5 000 g.

6.9. Удалить супернатант, не задевая осадка.

6.10. К осадку добавить 1 см3 рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при 5 000 g и осторожно удалить супернатант.

6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.

6.12. Подсушить осадок при 65°С в течение 4-5 минут.

6.13. К осадку добавить 50 мм3 экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы.

6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65°С.

6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин. при 5000 g.

6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20°С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.

Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения, с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид).

7. Амплификация

7.1. Перед проведением реакции достать из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы","+" контроль".

7.2. Добавить во все пробирки по 5 мм3 праймеров.

7.3. Добавить во все пробирки по 10 мм3 растворителя.

7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мм3 бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 мм3 исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 мм3 раствора контрольной ДНК.

7.5. Добавить во все пробирки по 20 мм3 минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку).

7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.

Таблица 1

Программа проведения амПЦР

Шаг программы	Температура °С	Время инкубации, сек	Количество циклов
1.	94	180	1
2.	94	30	42
3.	62,5	30
4.	72	180	1

Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода), необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК - содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.

7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в случае его использования.

7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов.

8. Проведение ДНК гибридизации

8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3M NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,1%SDS; 0,1xSSC; 0,1xSSC, 0,1% SDS; 0,0 1 x SSC. Для приготовления 100 см3 раствора можно воспользоваться таблицей 2:

Таблица 2

Приготовление рабочих растворов SSC

Раствор:	20 x SSC	10%-ный SDS	H2O даст.
2xSSC, 0,1% SDS	10 см3	1 см3	89 см3
0,1 х SSC	0,5 см3	-	99,5 см3
0,1xSSC, 0,1% SDS	0,5 см3	1 см3	98,5 см3
0,01 x SSC	0,05 см3	-	99,95 см3

8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1-2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 мм3 20 х SSC и 0,2 мм3 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1-2 секунды. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.

8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42°С.

8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2 х SSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами:

- 2 x SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут;

- 0,1 х SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;

- 0,1 х SSC - 5 раз по 1 минуте;

- 0,01 х SSC в течение 10 секунд.

9. Проведение ферментного анализа

9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1 х SSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мм3 на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125 мм3 раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 мм3 раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 мм3 1 х SSC, а затем добавляют 0,75 мм3 исходного конъюгата.

9.2. Нанести 25-30 мм3 разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре.

9.3. Смыть конъюгат раствором 1 х SSC.

9.4. Залить микрочип раствором 2 х SSC и промыть 5 минут.

9.5. Промыть микрочип раствором 1 х SSC.

9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3 буфера 0,1 х SSC, добавить 30 мм3 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.

9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата.

9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42°С на 5-10 минут. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.

10. Сканирование биологических микрочипов

10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер микрочипов к работе.

10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку.

10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.

10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение (Приложение 1Б), присвоив файлу соответствующее имя.

10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".

11. Анализ изображений биочипов

11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа.

11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы.

11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем "Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.

11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник, с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.

11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять".

11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция "Настройки / Автоматическая подстройка".

11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты".

11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний.

Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".

12. Интерпретация результатов

12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии трансформационного события в анализируемом образце (пробе).

12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет трансформационного события.

12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1Н соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.