Приложение 3. Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для морских биологических тест-объектов

2.1.1. Высшие водные растения

Зостера морская (Zostera marina L.) - растение многолетнее, имеет ползучее корневище, укореняющееся на узлах и переходящее в вертикальный побег. В каждом узле с двух сторон по 8-10 тонких, нежных корней. Стебель ветвистый, длиной 60-150 см, ветви укороченные. Листья плоские, линейные, длиной в среднем 50, нередко 100 см и более, шириной 3-9 мм. Верхушка листа округлая. Соцветие многоцветковое, длиной до 8 см, на цветоносных ветвях.

Распространена в умеренных и теплых водах Северного полушария у берегов Европы, в Тихом океане от Желтого до Берингова моря и до Калифорнийского залива, также встречается в Карском и Чукотском морях.

2.1.2. Макрофиты

В Дальневосточных морях удобны для экспериментов в лабораторных условиях некоторые виды макрофитов, относящиеся к красным высшим водорослям.

4.4.1. Острое токсическое действие вещества исследуют в течение 24 ч. По результатам эксперимента оценивают выживаемость коловраток за 24 ч и определяют вещества.

Предварительный эксперимент проводят с 4-5 концентрациями вещества, различающимися в 10 раз; например:, 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10  и т.д. Этот опыт позволяет установить границы остролетальных концентраций вещества.

Основной эксперимент проводят по результатам предварительного. Выбирают диапазон концентраций вещества, которые вызывают гибель меньше 50% и больше 50% коловраток в предварительном эксперименте. Шаг между концентрациями различается в 2-5 раз.

В экспериментальные микроаквариумы объемом по 0,5 мл помещают растворы исследуемых концентраций вещества. В каждый микроаквариум рассаживают по одному экземпляру коловраток возрастом 1 сутки, начиная с контроля и далее от наименьшей концентрации по возрастанию. В контроле и в эксперименте (в каждой концентрации) используют по 20 коловраток.

Условия проведения опытов такие же, как и при культивировании данного объекта. В ходе острых опытов коловраток не кормят.

4.4.2. Хроническое токсическое действие вещества исследуют около 2 недель (11-14 дней).

Исследование проводят на 3-х поколениях коловраток. По результатам исследования оценивают (по сравнению с контролем):

а) выживаемость коловраток в разных концентрациях вещества в исходном, в 1-ом, 2-ом и 3-ем поколениях;

б) наступление половозрелости в каждом из трех поколений;

в) плодовитость коловраток в каждом поколении и общую плодовитость.

Половозрелость коловраток отмечают с момента появления первого яйца. Плодовитость коловраток - количество молоди, появившейся в каждом поколении. Общая плодовитость коловраток в каждом поколении определяется как сумма всей молоди за 4 вымета.

Для хронических опытов берут не менее 4-5 концентраций вещества, в установленном диапазоне по за 24 часа.

В контроле и опыте (в каждой концентрации) используют не менее 20 коловраток, помещая в каждую лунку микроаквариума по одному экземпляру возрастом ч.

Коловраток во время проведения эксперимента кормят водорослями раз в 2-3 суток. Концентрация клеток водорослей та же, что и при культивировании коловраток. Предварительно культуру водорослей концентрируют центрифугированием. Концентрированный корм добавляют в каждую лунку на кончике пастеровской пипетки.

При проведении опытов на поколениях коловраток (Таблица 4.4.1.) придерживаются схемы, аналогично проведению опытов с дафниями.

Таблица 4.4.1.

Схема опытов на серии поколений коловраток

Примечание. X - поколения; верхний индекс - пометы каждого поколения; нижний индекс оцениваемое поколение

Подготовленную для эксперимента культуру коловраток (исходную молодь) рассаживают в микроаквариумы по 1 экземпляру. После того, как исходные особи дали первый помет (1-е поколение - ), эту молодь отсаживают ( - "исходная" молодь первого поколения) в том же количестве в другие лунки-микроаквариумы, соответствующие тем же концентрациям вещества и т.д.

За исходными особями ведут наблюдение до получения 4-х пометов в 3-ем опытном и контрольном поколениях. Наблюдения, которые ведутся за исходными особями, повторяют с 1-м, 2-м и 3-м поколениями.

5.1.1. Характеристика тест-объекта

Жаброногий рачок - артемия салина (Artemia salina L.) удобен в качестве тест-объекта, что определяется его эвригалинностью, доступностью в любое время года исходного материала (яиц), возможностью длительного хранения яиц (в течение нескольких лет), легкостью содержания и культивирования в воде разной солености. Адаптация при этом не требуется.

При благоприятных условиях выклев науплиев артемий из яиц происходит за 1-2 суток (при 25°С - в течение 24 часов; при 20°С в течение 48 ч). В течение первых дней жизни науплии не потребляют оформленной пищи, находятся на эндогенном питании. На 4-е сутки науплии переходят на активное питание оформленной пищей. В зависимости от температурных условий артемии достигают половозрелого состояния в течение 3-4 недель после вылупления из яиц.

В связи с различной устойчивостью артемий к токсикантам на разных стадиях развития, в токсикологических экспериментах ставят опыты с развивающимися яйцами, науплиальными стадиями артемий и взрослыми особями, используя каждую стадию как отдельный тест-объект.

Из всех стадий развития артемий, наиболее чувствительным тест-объектом, являются науплии в возрасте 1 суток (переход ортонауплиуса в метанауплис). Данная стадия используется как тест-объект в экспериментах при разработке ПДК вещества.

5.1.2. Условия лабораторного содержания

Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:

микрокомпрессоры;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

оксиметр;

рН-метр;

прибор для определения солености воды;

мембранные фильтры (размер пор 0,45 мкм и 3-5 мкм);

дистиллированная вода;

стеклянные бутыли на 20 л - 2 штуки;

стаканы лабораторные на 50, 100, 300, 500, 1000 ;

чашки Петри;

градуированные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 мл;

пипетки Пастера стеклянные, вместимостью 2  с укороченным и оплавленным концом для пересадки рачков;

реактивы марки "хч", а также морская соль;

двухромовокислый калий марки "хч" или стандарт-титр калия двухромокислого;

сухие яйца Artemia salina L. (хранятся в холодильной камере)

Исследование с артемиями (Artemia salina L.) проводят при искусственном или естественном освещении, температуре °С, от выклева из яйца (односуточные науплии) до половозрелого состояния (21 сутки) на природной морской воде или на искусственной морской воде определенной солености.

При проведении экспериментов с артемиями на искусственной морской воде, последняя служит контролем в экспериментах.

В связи с эндогенным питанием науплиусы артемий не нуждаются в подкормке в течение четырех суток после выклева. В дальнейшем в качестве корма для них используют культуры одноклеточных перидиниевых водорослей из родов Phaeodactylum и Exuviella, или желто-зеленых жгутиковых водорослей Nephrochloris salina, выращиваемых на среде Гольдберга.

Плотность клеток водорослей в среде с рачками при их кормлении - 100 (слегка зеленоватый или бежевый цвет среды). Подкармливают рачков через 2 суток.

При достаточном внесении корма рачки распределяются равномерно по всей толще воды и активно движутся. При недостатке корма артемии задерживаются у стенок и дна аквариума, взмучивая осадок, при излишке корма собираются у поверхности воды, при этом движение становится замедленным.

В опыт необходимо брать яйца артемий с высоким процентом выклева (60-100%).

Чтобы получить исходный материал для исследования, 1-3 г сухих яиц помещают в химический стакан объемом 500 мл и заливают водопроводной водой, заранее отстоянной и аэрируемой в течение суток. Через 30 мин, не взбалтывая содержимого стакана, сливают слой воды над осевшими яйцами, удаляя таким образом пустые оболочки яиц и погибшие яйца. Процедуру очистки повторяют несколько раз.

Отмытые яйца вновь заливают пресной водой, подводят аэрацию и выдерживают в таком состоянии в течение суток. Через сутки пресную воду сливают и яйца несколько раз промывают фильтрованной и проаэрированной морской водой нужной солености с рН 7,8 - 8,2.

Промытые яйца для выклева помещают в плоский кристаллизатор, наполненный морской водой нужной солености. Содержимое кристаллизатора взбалтывают, при этом яйца располагаются по дну монослоем. Через 18-24 часа в кристаллизаторе вылупляются первые личинки. Для дружного выклева необходима аэрация и освещенность не менее 1500-2500 .

Для получения синхронизированного материала первых выклюнувшихся науплиусов Artemia salina L. тщательно отбирают пипеткой Пастера и переносят в стакан (объемом 150 ) с морской водой. Через час в кристаллизаторе накапливаются новые науплиусы. Отбирают и переносят науплиусов в тот же стакан с морской водой по мере их выклева - 2-3 раза в течение трех часов, концентрируя организмы возле одной из стенок направленным источником света (новорожденные науплиусы имеют положительный фототаксис). Далее односуточные науплиусы Artemia salina L. используют в эксперименте.

Один раз в месяц (или при использовании новой партии яиц) проводят проверку выклюнувшихся науплиусов на пригодность к токсикологическому анализу, то есть проверяют их физиологическую чувствительность. Для этого определяют значение (72 ч) эталонного химического вещества двухромовокислого калия для науплиусов.

Если значение для организмов находится в диапазоне 6,5 - 8,0  эталонного вещества, науплиусы пригодны для проведения эксперимента. В случае не попадания в указанный диапазон концентраций, проверяют соблюдение процедуры выполнения определений, условия подготовки организмов к токсикологическому анализу и, при необходимости, используют новую партию яиц.

5.1.3. Проведение исследований

Исследования на артемиях проводят в 2 этапа (предварительный и основной).

В предварительном кратковременном исследовании (оценка острого токсического действия вещества в течение 96 часов) по 20 экземпляров науплиусов рассаживают по чашкам Петри в контрольную и опытную среды (40 мл). Число повторностей равно трем. Показания снимают ежедневно (в 1, 2, 3 и 4 сутки), удаляя погибших рачков.

Исследуют, как правило, 5 концентраций вещества. При этом следует стремиться к тому, чтобы по крайней мере две из концентраций вызывали бы эффект менее и более 50%.

При длительном исследовании (оценка хронического токсического действия вещества в течение 21 суток) эксперименты проводят в стаканах емкостью 300 - 500 , число повторностей равно трем. Плотность посадки из расчета 1 экземпляр на 25  среды (количество рачков в контрольных и опытных емкостях каждой концентрации - по 10 экземпляров).

После 4-х суток эксперимента, науплиусов кормят водорослями каждые двое суток. Показания снимают по возможности ежедневно (удаляя погибших рачков). Через 21 сутки исследование заканчивается.

5.1.4. Учет и анализ результатов

Для определения наличия токсического действия растворов вещества на артемий, рассчитывают снижение (в процентах) выживаемости тест-организмов в опыте по сравнению с контролем. Используют статистическую обработку результатов эксперимента (Приложение 4 данных Методических указаний).

5.2.1. Характеристика тест-объекта

Мизиды являются существенным компонентом пищи многих видов рыб и обладают высокими продукционными способностями. Многочисленны в прибрежной зоне морей, удобны в качестве тест-объекта. Легко культивируются в лабораторных условиях и широко используются в токсикологических исследованиях.

В настоящее время культура морских мизид в России отсутствует, поэтому исследования предлагается проводить с природными организмами мизид. Аналогично проводятся исследования с другими природными зоопланктонными ракообразными.

В прибрежной зоне дальневосточных морей многочисленна мизида удивительная (Neomysis mirabilis), которую удобно использовать в качестве тест-объекта. Она распространена в северной части Тихого океана от Сангарского пролива до Командорских островов и Аляски. Обитает на глубинах от 1 до 50 м. Легко адаптируется к лабораторным условиям и широко используется в токсикологических исследованиях, так как обладает низкой резистентностью к воздействию многих химических веществ.

5.2.2. Условия лабораторного содержания

Мизиды легко отлавливаются в прибрежной зоне и содержатся в адаптационных аквариумах в лабораторных условиях в течение 48 ч до начала эксперимента. Травмированные организмы за это время погибают, а остальные акклиматизируются к лабораторным условиям (освещению, температуре, солености воды). По возможности эксперименты проводят с мизидами на ранних стадиях развития.

Для получения молоди, самки мизид с марсупиальными сумками, содержащими эмбрионов на последних стадиях развития, помещаются в специальные емкости. Выметанная молодь (возрастом 3-5 суток) отбирается для экспериментов.

Адаптированных к лабораторным условиям мизид длиной 9-12 мм, возрастом 2 месяца и старше также отбирают для экспериментов.

Обязательно проведение оценки физиологической активности взятых для эксперимента организмов по эталонному веществу, с записью в отчете полученной величины .

5.2.3. Проведение исследований

В остром опыте в каждый стакан помещают по 5 экземпляров мизид на 0,5  раствора. Выметанную молодь для острых опытов рассаживают по 6 экземпляров в 0,2 раствора. Для анализа токсичности раствора необходимо проверить, как минимум, 5 концентраций в 3-5 повторностях. При этом следует стремиться к тому, чтобы по крайней мере по одной концентрации вызывали эффект менее 50% и более 50%. Параллельно ставится контрольный опыт также в 3-5 повторностях с организмами из той же партии. В течение 96 ч острого эксперимента мизид не кормят.

По результатам 96 часового эксперимента рассчитывают токсикологические параметры острого опыта (, , ).

Длительность хронического эксперимента до 30 суток. В опыт отбираются 3-5 суточные экземпляры мизид, выметанных в лаборатории - по 10 экземпляров на 0,5 л раствора. Кормить мизид в первые две недели необходимо 2 раза в сутки измельченным природным планктоном, а в последующем - живыми науплиями артемий.

Смена раствора в эксперименте осуществляется 1 раз в 3 дня, учитывая плотность посадки, а также - с учетом стабильности исследуемого вещества.

В первую неделю подсчет выживших рачков проводят ежесуточно, а в последующем - каждые 1-2 дня. В конце эксперимента мизид измеряют.

5.2.4. Учет и анализ результатов

Тест-функцией состояния организмов служит их выживаемость, регистрируется также процент уродливых особей. Отмечается изменение внешнего вида, поведенческие реакции, вес и размер особей.

Критерием для определения гибели служит отсутствие реакции на стеклянную палочку. Вследствие того, что мертвые рачки могут разлагаться или быть съеденными в промежутках между подсчетами, следует учитывать только живых организмов (при каннибализме мизид рассаживают по одному). Погибшие мизиды удаляются при каждом наблюдении.

Если смертность в контрольной группе превышает 10%, все данные признаются недействительными и эксперимент повторяется заново.

По окончании опытов с помощью пробит-анализа проводят расчеты параметров токсичности - , , , , и .

При смертности тест-объектов в контроле, превышающей 5%, вводится поправка Аббота (п. 1.3 Приложения 4). Достоверность различий с контролем оценивается при 5% уровне значимости.

6.1.1. Характеристика тест-объекта

Мидия - широко распространенный вид двустворчатых моллюсков, образует две экологические морфы: скаловую и иловую. Скаловая мидия обитает в прибрежной зоне на каменистых субстратах в горизонте от сублиторали до глубин 20-25 м, образуя в верхнем 10-метровом слое сплошные поселения. Иловая морфа образует банки в открытом море на глубинах 35-75 м.

По показателю выживаемости мидия обладает высокой токсикорезистентностью ко многим типам загрязнения. Наряду с этим, пороговая чувствительность по некоторым показателям физиологической активности этого моллюска находится на уровне ПДК вещества для водных объектов рыбохозяйственного значения. Широкая распространенность и низкая смертность при изменении абиотических факторов позволяют легко добывать экспериментальный материал и содержать мидий в лабораторных условиях. В то же время повышенная чувствительность физиологических функций к действию токсикантов позволяет с большой точностью определять пригодность водной среды для жизнедеятельности моллюсков.

Для регистрации показателей токсичности используют следующие тест-функции: интенсивность потребления кислорода, биссусный тест, трофическая активность, степень агрегированности и скорость собирания в друзы.

Для проведения исследований наиболее пригодны молодые неполовозрелые мидии размером не более 30 мм, находящиеся в фазе активного роста. На этой стадии онтогенеза мидии обладают наибольшей двигательной, дыхательной и трофической активностью и меньше подвержены индивидуальным различиям, связанным с развитием гаметогенетического цикла.

Мидии легко культивируются в лабораторных условиях, что позволяет всегда иметь в лаборатории необходимое количество экспериментального материала, однако в лабораторных условиях не всегда удается создать наиболее оптимальные условия для обитания моллюсков. В связи с этим данный биотест ориентирован на применение в условиях морских лабораторий и полевых экспедиций, использующих живой материал непосредственно из моря.

На Черном море мидия размножается практически круглый год с ярко выраженными пиками в феврале-марте, апреле-мае и августе-сентябре. В планктоне личинки находятся от 8 до 14 суток в зависимости от температуры воды, затем оседают на различные субстраты. Молодь мидий размером 20-30 мм можно найти в водоеме практически круглый год.

6.1.2. Условия лабораторного содержания

При исследовании на мидиях используют следующее оборудование: респирометры;

термооксиметры модели UT-800, либо анализаторы параметров водной среды марки HORIBA, модель U-7;

счетная камера Нажотта;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

прибор для определения оптической плотности воды.

6.1.3. Отбор мидий для опыта

Друзы моллюсков, доставленные из моря, разбирают на отдельные особи, отделяют от обрастаний и детрита и тщательно промывают чистой морской водой. Отделять мидии друг от друга следует осторожно, во избежание повреждения биссусных желез и травмирования моллюсков. Срезают мидий с друзы маленькими ножницами, обрезая биссусные нити у основания раковины. Для отбора мидий в эксперимент и первичной оценки физиологического состояния анализируемой популяции, очищенных мидий помещают в аквариум с проточной водой на 15-25 минут и наблюдают за их двигательной активностью. Здоровые мидии размером 15-25 мм начинают шевелиться и пытаются перемещаться по дну аквариума с помощью ноги уже через 2-3 минуты после помещения в воду. По количеству двигающихся особей можно предварительно судить о состоянии популяции. В норме примерно 95% всех отобранных мидий проявляют двигательную активность в первые 5 минут.

6.1.4. Проведение исследований

При постановке опыта у каждой группы испытуемых моллюсков одновременно регистрируется несколько параметров физиологической активности. Для этого в качестве рабочей камеры рекомендуется использовать герметичные респирометры объемом
2-3  с большой площадью дна, на который размещаются датчики постоянной регистрации содержания кислорода, магнитная мешалка, пробоотборник проб воды для определения концентрации корма при выяснении трофической активности тест-объектов. В полевых условиях магнитная мешалка может быть заменена на электромотор (питаемый от аккумулятора или батареи и снабженный крыльчаткой), помещенный в воду. Если по схеме эксперимента дыхательная активность не измеряется, то перемешивание воды может осуществляться с помощью барбатации.

Число организмов в эксперименте 50-100 экземпляров. Количество параллельных серий 2-3.

Для определения влияния того или иного токсиканта на физиологическую активность мидий в респирометры наливают морскую воду, содержащую определенное количество испытуемого вещества. Выбор рабочих концентраций осуществляется по стандартной схеме токсикологического биотестирования, включая предварительный и окончательный этап эксперимента. Если необходимо провести оценку физиологического состояния мидий, взятых из определенного района побережья, то респирометры заливают природной морской водой, взятой из того же места, что и испытуемые мидии. Как в первом, так и во втором случае, воду перед заливкой в респирометры аэрируют не менее 30 мин для полного насыщения кислородом. После заливки респирометров водой и их герметизации, включают магнитную мешалку. Измерения производят через 15 минут. Регистрируются следующие параметры:

а) концентрация кислорода в воде;

б) температура воды;

в) количество мидий, собравшихся в друзы (друзой считается группа соприкасающихся мидий, состоящая из трех или более экземпляров);

г) прикрепленность ко дну аквариума (определяют длинным проволочным щупом, пропускаемым через отверстие в крышке респирометра, которое после определения закрывают пробкой).

Длительность эксперимента определяется скоростью потребления кислорода. Опыт прекращается, когда концентрация кислорода в воде снижается по сравнению с исходной на 30%. Если дыхание происходит очень слабо, то длительность эксперимента следует ограничить до 4-5 часов, так как дальнейшая экспозиция может быть сильно замаскирована разложением детрита, выделяемого мидиями.

Для проведения экспериментов, в схему которых включено измерение трофической активности мидий, предварительно готовят кормовую смесь. Обычно это суспензия микроводорослей различных видов, либо гомогенат талломов макрофитов. Опыты по определению трофической активности мидий ведутся без измерения потребления кислорода. Аэратор, работающий на малом режиме, остается в аквариуме на все время эксперимента, так как снижение концентрации кислорода в воде блокирует трофику мидий.

Определенное количество микроводорослей либо определенную навеску гомогената, помещают в рабочий аквариум с равномерно размещенными мидиями и тщательно перемешивают с помощью аэратора.

Аликвоты для измерения концентрации пищи в среде отбирают через каждые 5 мин. Все остальные параметры снимают через каждые 15 мин. Аликвоты либо фиксируют для дальнейшего просчета клеток под микроскопом (в случае кормления водорослями), либо помещают в счетную камеру прибора для измерения оптической плотности (в случае кормления гомогенатом). Исходная концентрация корма зависит от разрешающей способности применяемой аппаратуры.

6.1.5. Учет и анализ результатов

На основании экспериментальных данных по стандартным статистическим и биометрическим методикам обрабатывают полученные показатели физиологического состояния мидий. Определяют:

а) интенсивность дыхания - потребление кислорода в единицу времени на единицу биомассы и на одну особь; 2) степень агрегированности - отношение числа особей в друзах к общему числу особей в опыте выражают в процентах;

б) скорость прикрепления к субстрату - время, за которое 50% особей прикрепились ко дну рабочего аквариума;

в) трофическую активность - количество корма, потребленного одной особью за единицу времени.

Сравнивая показатели, полученные у мидий, взятых в качестве контроля, с показателями, полученными у мидий, подвергшихся действию химического вещества, можно оценить степень нарушения физиологического состояния мидий и сделать заключение о токсичности растворов вещества.

6.4.1. Характеристика тест-объекта

В 70-90-е годы исследователями разных стран разработана методология биотестирования с использованием гамет, зародышей и личинок морских ежей - "Sea Urchin Test System". Наиболее широкое применение получил метод, основанный на анализе эмбрионального и раннего личиночного развития морских ежей - "Sea Urchin Embryo Test" (Kobayashi N., 1984. Marine ecotoxicological testing with Echinoderms // Personne G., Jaspers E., Clans C. (eds.) Ecotoxicological Testing for the Marine Environment. Belgium, Breden: State Univ. Ghent & fast Mar. Sci. Res. V. 1, p. 341-405). Его основные преимущества: возможность получения большого количества гамет и синхронно развивающихся зародышей; простота инкубации зародышей и личинок на ранних этапах развития в контролируемых условиях; легкость прижизненных наблюдений и анализа фиксированного материала, поскольку нормальный эмбриогенез морского ежа и отклонения от нормы (аномалии развития) детально описаны; возможность использования разных видов морских ежей, так как чувствительность их половых клеток и зародышей к химическим веществам практически одинакова.

Для получения половых клеток можно использовать морских ежей любого из видов, обитающих в морях России. Это в основном - шаровидные морские ежи стронгилоцентротусы (Strongylocentrotus droebachiensis, S. nudus, S. intermedius), дисковидные морские ежи (Echinaracknius parma, Scaphechinus mirabilis) и ловениды (Echinocardium cordatum).

Морских ежей отлавливают в сезон их размножения, так как только зрелые гонады содержат достаточное количество качественных половых клеток. Для стимуляции нереста применяют инъекцию в превисцеральную полость тела (через перистомальную мембрану) 0.5  0.5 М раствора КСl (на дистиллированной воде). Ежей укладывают аборальной стороной вниз на плоскую поверхность. После начала выделения половых клеток (яйцеклетки имеют желто-оранжевый цвет, сперма - белый) самцов сразу отделяют от самок Самку следует быстро обмыть сначала пресной водой (чтобы уничтожить случайно попавшие сперматозоиды), затем морской и поместить на высокий узкий стакан объемом 100-200 мл, заполненный фильтрованной морской водой таким образом, чтобы аборальный полюс ежей был погружен в воду. Сразу после этого из гонопоров начинают вытекать струйками зрелые яйца, довольно быстро оседающие на дно стаканов. Основная масса яиц вытекает в воду за 15-30 минут. Воду из стаканов сливают, заменяют свежей и дают яйцам снова осесть; эту процедуру повторяют 2-3 раза. Рекомендуется также профильтровать суспензию яйцеклеток через мельничный газ (размер ячеи 100x100 мкм) для освобождения клеток от студенистой оболочки и очистки суспензии от механических примесей. Полученные отмытые яйца желательно сразу же использовать для опыта. В случае необходимости их можно хранить в холодильнике без перемешивания в течение нескольких часов. Партия яйцеклеток не должна содержать недозрелых (ооциты, определяемые по наличию крупного пузырькового ядра) или перезрелых (разрушающихся) клеток.

Сперму следует извлекать из семенников вскрытых самцов и хранить в "сухом" виде в холодильнике или на льду в течение 6-12 часов. Перед использованием ее следует разбавить морской водой и таким образом активировать.

6.4.2. Проведение исследований

Предварительно необходимо проверить способность гамет к оплодотворению. Каплю суспензии яйцеклеток помещают на предметное стекло и вносят разбавленную морской водой сперму. Половые клетки считаются качественными, если в течение 3 мин после осеменения оболочка оплодотворения (отслаивающаяся в результате кортикальной реакции желточная оболочка яйцеклетки) появляется не менее чем у 95% яйцеклеток.

Посуда должна быть стеклянная или нетоксичная пластиковая, однократного использования. Стеклянную посуду следует мыть питьевой содой, без применения мыла и детергентов. Объем инкубационной среды зависит от задач эксперимента, может составлять от 0,3 мл до единиц, десятков и сотен миллилитров.

Яйцеклетки должны быть распределены по дну инкубационной емкости монослоем. Оптимальная концентрация яйцеклеток в среде при проведении экспериментов в течение 48-96 часов (время, достаточное до достижения стадии плутеуса у большинства видов морских ежей) не должна превышать 300 . Концентрацию яйцеклеток в среде подсчитывают в 3-5 аликвотах по 0,01 , взятых из взвешенной суспензии яиц, определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию в 1 .

В пределах одного эксперимента следует использовать один образец спермы с наиболее подвижными и жизнестойкими сперматозоидами. Необходимо соблюдать определенный порядок внесения гамет в инкубационную среду. Рекомендуется первоначально вносить в инкубационную среду яйцеклетки, а затем - сперматозоиды. В этом случае нет необходимости определять концентрацию сперматозоидов, достаточно лишь соблюдать рекомендации по конечному разведению спермы для того, чтобы избежать полиспермии. Величины конечного разведения спермы в инкубационной среде - от 1:60000 до 1:100000.

Для того чтобы правильно идентифицировать стадии развития зародышей и личинок, определять время их прохождения и отличать нормальных зародышей и личинок от аномалий развития, предварительно следует составить таблицу нормального развития используемого в работе вида морского ежа.

Для различных видов стронгилоцентротусов (Strongylocentrotus droebachiensis, S. Nudus и S. Intermedium) можно использовать уже имеющиеся в литературных источниках таблицы. Все опыты должны проводиться при одинаковой температуре, находящейся в пределах оптимального для каждого вида диапазона, и в оптимальных диапазонах солености (обычно 28-32) и рН (обычно 7,8-8,2).

На определенных этапах развития (обычно это оплодотворение, первое деление дробления, средняя бластула, поздняя гаструла и плутеус) часть зародышей и личинок (не менее 100 экземпляров на каждой стадии) отбирают из инкубационной среды и фиксируют слабым раствором (конечная концентрация 0,02-0,05%) формальдегида или глутаральдегида на морской воде. При использовании иммунологических планшетов фиксацию следует производить прямо в ячейках. Следует иметь в виду, что наличие фиксатора в близлежащих ячейках оказывает отрицательное влияние на личинок, поэтому фиксацию нужно проводить на каком-нибудь одном (конечном) этапе развития (например, гаструлы или плутеуса). На стадиях оплодотворения, первого деления и средней бластулы зародыши, находящиеся в оболочке оплодотворения, неподвижно лежат на дне, что позволяет вести прижизненное наблюдение и осуществлять необходимые подсчеты с использованием инвертированного микроскопа.

Описание этапов развития морского ежа и типичные аномалии эмбрионального развития приведены в таблицах 6.4.1. а, 6.4.1. б.

6.4.3. Учет и анализ результатов

Для получения достоверных результатов опыты с каждым тестируемым образцом вещества в определенной концентрации следует проводить не менее чем в двух повторностях и не менее чем в двух параллелях в пределах каждой повторности. Подсчитывают долю (в процентах) нормальных и аномальных зародышей и личинок из расчета на 100 экземпляров на каждом этапе развития. Определяют среднее значение, его ошибку (или стандартное отклонение). Определяют достоверность различий между контрольными и экспериментальными данными по критерию Стьюдента. Для определения полулетальной концентрации токсиканта () можно использовать пробит-анализ.

Таблица 6.4.1. а

Описание этапов индивидуального развития Strongylocentrotus intermedius

Таблица 6.4.1. б

Типичные аномалии эмбрионального развития морских ежей

7.2.1. Характеристика тест-объекта

Гуппи (Poecilia reticulata Peters) - широко распространенная аквариумная живородящая рыбка. В природе встречается в соленых и пресных водах. Выдерживает значительные колебания солености.

Данный тест-объект широко применяется в международных и национальных стандартах при токсикологических исследованиях морей и внутренних морских вод.

Гуппи - мелкие рыбы с ярко выраженным половым деморфизмом. Самцы (3-4 см) обычно мельче самок и окрашены в более яркие цвета. В их окраске преобладают серовато-коричниевые тона с очень яркими красными, голубыми, зелеными и черными вкраплениями и точками. Самки достигают 6 см в длину, обычно желтовато-зеленые.

Гуппи выдерживают многократное близкородственное скрещивание, что облегчает получение чистых линий.

Для исследований используют гуппи, адаптированных к различной солености. Изменение солености от 0 до 20 гуппи переносят без адаптации. Постепенная адаптация к океанической солености до 35 занимает около двух недель.

7.2.2. Условия лабораторного содержания

Для содержания (культивирования) гуппи используют термостатированные аквариумы, обеспечивающие плотность посадки тест-объектов из расчета для молоди 1 экземпляр на 1-2 , и для половозрелых рыб - 1 экземпляр на 5  воды. Аквариум размещают в помещении, не содержащем токсических паров или газов, заполняют отстоянной и проаэрированной в течение 7 суток морской водой необходимой солености. Искусственная морская вода для содержания гуппи должна отвечать следующим требованиям: рН 7,8 - 8,2, температура 25-27°С. Воду в аквариуме аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Каждые три дня часть воды (1/4-1/5 часть) заменяют свежей. Поддерживают первоначальный объем воды в аквариумах, доливая дистиллированную воду вместо испарившейся и контролируя соленость с помощью солемера. Ил со дна аквариума убирают регулярно при помощи сифона.

Кроме рыб в аквариум помещают зеленую водоросль энтероморфу, которая при хорошем освещении хорошо развивается и служит для гуппи укрытием и кормом.

Кормят гуппи 1-2 раза в сутки, производителей чаще, сухим (дафнии, циклопы) или живым кормом (мотыль, трубочник, дафнии, циклопы). Корм вносят в таком количестве, чтобы рыбы съедали его без остатка за 3-5 минут, так как излишки приводят к ухудшению качества воды в аквариуме. Особенно осторожно следует кормить рыб живыми дафниями и циклопами, которые в морской воде быстро погибают и могут служить источником сильного загрязнения.

Для получения молоди отбирают производителей в возрасте от 1-2 лет (продолжительность жизни гуппи в аквариумных условиях 3-3,5 года).

Самку готовят к вымету, помещая в отдельную термостатированную нерестовую емкость объемом не менее 4 , заполненную водопроводной водой температурой 25°С и большим количеством мелколистных растений. Готовность самки к вымету мальков определяют по наличию хорошо заметного темного пятна перед анальным плавником. При этом форма брюшка приближается к прямоугольной, и оно становится намного шире спины. Вымет происходит в искусственную или природную морскую воду (самок перед выметом переводят в аквариумы с морской водой).

После окончания вымета самок изолируют, так как они поедают потомство.

Мальки рождаются сформированными. Лучшим кормом для них является "пыль", состоящая из инфузорий, коловраток, молоди ветвистоусых рачков и науплиусов веслоногих рачков. При отсутствии "пыли" молодь гуппи кормят перетертыми сухими дафниями или любым другим измельченным сухим кормом. На 100 мальков вносят не более 1 г корма. По мере роста в рацион рыб вводят измельченный трубочник, мотыль, коретку и другой живой корм. Однодневных и двухнедельных мальков кормят до 5 раз в сутки, более взрослых 2-3 раза. Вносимые порции корма должны быть небольшими и поедаться рыбами в течение 3-5 минут.

Мальков сортируют по размерам и постепенно переводят из нерестовых аквариумов в вырастные (вначале объемом 50 , а затем - 200 ). Мальки становятся половозрелыми в 4 - 6 месяцев.

Гуппи размножаются и растут при солености воды от 0 до 20 без адаптации при их пересаживании. Для тестирования химических веществ в среде с соленостью выше 20 получают исходный материал (мальков) в пресной воде (или в воде с соленостью до 20) с последующей адаптацией к более высокой солености.

7.2.3. Проведение исследований с гуппи возрастом 1 сутки

В опыте используют гуппи возрастом 1 сутки. Исследования проводят при освещении рассеянным светом, с естественной сменой дня и ночи, концентрацией кислорода в воде не менее 4  и температурой воды °С. Гибель рыбы в контроле не должна превышать 10%. Диапазон ответной реакции гуппи возрастом 1-2 суток ( за 96 часов) на эталонное вещество находится в интервале 45 - 60 мг/л.

В аквариум наливают по 10  контрольной или тестируемой воды. Повторность трехкратная. В каждый аквариум помещают по 10 рыб. Воду в контрольных и опытных аквариумах аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Ежесуточно в каждом аквариуме подсчитывают количество выживших рыб и удаляют погибших. Погибшими считают рыб, не подающих признаков движения или дыхания в течение 5 минут после прикосновения к ним стеклянной палочкой.

Для определения наличия острого токсического действия раствора вещества опыт проводят в течение 96 ч. Для определения наличия хронического токсического действия раствора вещества - опыт проводят в течение 30 суток.

При кратковременном исследовании рыб не кормят.

При длительном исследовании смену воды в контрольных и опытных аквариумах проводят через 2 суток (или в соответствии со стабильностью тестируемого вещества в воде), один-два раза в сутки рыб кормят.

7.2.4. Определение влияния веществ на реальную плодовитость гуппи

При необходимости, для изучения влияния тестируемого вещества на реальную плодовитость гуппи, предварительно проводится подготовка тест-объекта.

Полученных от производителей мальков в течение 1 месяца выращивают в просторном аквариуме (на 1 малька - 1  воды). С появлением первых признаков половых различий, самцов отделяют от самок и продолжают выращивать в отдельных аквариумах. При температуре 25-27°С через 6 месяцев все рыбы становятся половозрелыми. С этого момента их можно использовать в опыте.

За три дня до начала постановки опытов самцов и самок помещают в общий аквариум для спаривания. Соотношение самцов и самок 2:1. Однажды оплодотворенная самка может приносить приплод несколько раз.

Опыт длится до 30 суток. За это время при температуре 25-27°С все самки рожают мальков.

Опыт проводят в трех повторностях. В каждый аквариум помещают по шесть самок. В процессе эксперимента рыб кормят живым кормом. В аквариумах устанавливаются садки с крупными ячейками, чтобы исключить поедание самками новорожденной молоди.

Показателем токсичности тестируемого раствора вещества служат выживаемость самок, реальная плодовитость (количество жизнеспособной молоди), количество мертворожденной молоди по сравнению с контролем.

Жизнеспособную молодь желательно проверить по показателю для .

7.3.1. Икра и личинки беломорских рыб

В качестве тест-объекта используется икра и выклюнувшиеся личинки (апрель) беломорской сельди или (январь) наваги.

Продолжительность эксперимента 33 суток для сельди и 74 суток для наваги (от оплодотворения до перехода личинок на экзогенное питание).

Основными критериями оценки токсичности препарата служат: процент оплодотворения икры, выживаемость икры и личинок, скорость эмбриогенеза от этапа дробления до этапа вылупления, динамика выклева, аномалии в развитии.

Оплодотворение икры проводят "мокрым" способом в чистой морской среде и в заранее приготовленных исследуемых растворах. Субстратом для икринок беломорской сельди служат предметные стекла, помещаемые в чашки Петри. После набухания икры с предметных стекол под бинокуляром с помощью глазного скальпеля удаляют комки и слипшиеся икринки, оставляя на стекле до 30-50 икринок. Икра наваги неклейкая и легко раскладывается по чашкам Петри. Процент оплодотворения икры рыб составляет 98-99%. Во всех вариантах опыта и в контроле используется икра от одной самки (соотношение самок и самцов при оплодотворении 1:2).

Эксперименты ставят в чашках Петри со сменой растворов один раз в неделю (или в соответствии со стабильностью исследуемых препаратов). Величина выборки в каждом варианте составляет суммарно по трем повторностям от 120 до 160 икринок.

В качестве фоновой среды в опыте и в контроле используют природную морскую воду, привезенную с места оплодотворения икры. Для наваги соленость воды должна быть не ниже 20.

Температурный режим обеспечивается с помощью термостатирующих лотков. В эмбриональный период температура поддерживается на уровне 3-4°С для сельди, 1,5°С для наваги. С начала выклева личинок сельди, в соответствии с биологией тест-объекта, температура постепенно поднимается до 11°С.

Проводится статистическая обработка полученного материала. Достоверность различий средних данных в опыте от контроля оценивается по критерию Стьюдента для уровня значимости 95% (). Рассчитываются параметры токсичности.

7.3.2. Исследования на икре и личинках дальневосточных рыб

В водном объекте отлавливают планктонную икру массовых морских видов рыб (анчоус, камбала, минтай) и переносят в лабораторные условия. Инкубацию икры проводят в лабораторных условиях, при этом предличинки сразу попадают в искусственно созданные условия обитания, что исключает необходимость периода адаптации. В эксперименте сравнивают выживаемость предличинок в тестируемых растворах вещества и контроле. Длительность экспериментов с предличинками разных рыб от 96 ч до 10 суток (время рассасывания желточного мешка).

7.3.1 Условия лабораторного содержания дальневосточных предличинок рыб. Проведение исследований

Икра анчоуса и камбал на I-XI стадиях отлавливается днем из поверхностного слоя с помощью нестандартного орудия лова, изготовленного по типу сети Маручи-Ами с диаметром входного отверстия 1,3 м. Доинкубирование икры осуществляют при температуре 14-21°С.

Работы с икрой и предличинками необходимо проводить в хорошо освещенных аквариальных помещениях, где не используются летучие химические вещества. Стабильные температурные условия обеспечивают с помощью термостатируемых аквариумов. Вылупившихся предличинок рассаживают пипеткой в экспериментальные емкости по 5 экземпляров на 100  отстоянной и отфильтрованной через тройной слой газа N 61 морской воды с соленостью 33.

В эксперименте оценивается выживаемость личинок, которая является интегральной характеристикой резистентности организмов. Смертность в различных сериях острых экспериментов подсчитывают через 12 ч в течение всего опыта.

Опыты на предличинках анчоуса и камбал проводят в стеклянных стаканах с объемом растворов 100 . В каждый сосуд помещают по 5 особей. Для снижения гибели в контроле и улучшения воспроизводимости результатов, предличинок рассаживают через 12 ч после их выклева (возраст 14-22 ч). Незначительные изменения температуры воды в опыте и контроле соответствуют природному ходу температур. Освещенность повторяет естественные суточные циклы. Продолжительность экспозиции в экспериментах на предличинках анчоуса и камбал составляет 96 часов. За это время при температуре 18°С происходит рассасывание желточного мешка.

При необходимости проводят предварительные эксперименты, на их основании устанавливают диапазон токсичных концентраций для основного опыта, состоящий из четырех-пяти концентраций вещества. При этом следует стремиться к тому, чтобы, по крайней мере, по одной концентрации вызывали эффект менее 50% и более 50%.

Опыты проводятся в трех повторностях. Параллельно ставится тройной контроль, с соблюдением тех же условий, что и в опыте: организмы берутся из той же партии, вода та же, но без внесения исследуемого вещества. В течение 96 ч эксперимента среду содержания не заменяют, предличинок не кормят.

При проведении токсикологических опытов регистрируют следующие показатели по сравнению с контролем:

а) основные: выживаемость, процент уродливых особей;

б) дополнительные: внешний вид, поведенческие реакции (снижение двигательной активности, оседание на дно).

По окончании опытов проводят подсчет погибших особей с учетом "поправки Аббота" (п. 1.3 Приложения 4 настоящих Методических указаний) и расчет параметров токсичности - , , , , .

Показателем токсичности является достоверное снижение выживаемости и наличия уродливых особей. Опыт считается достоверным, если гибель в контроле не превышает 10%.

7.4.1. Условия лабораторного содержания рыб из природного водного объекта

В аквариальных условиях привезенную рыбу помещают в приготовленную заранее отстоянную профильтрованную природную морскую воду (рН 7,8 - 8,5), при постоянном контроле растворенного в воде кислорода (от 8,5 до 9,5 мг/л), поддерживаемого за счет аэрации.

Емкости, в которых содержится рыба, должны быть оборудованы биофильтрами, а вода в них должна периодически обновляться за счет частичной замены не реже одного раза в 10 суток и полной замены не реже одного раза в месяц.

Срок адаптации рыб к условиям аквариальной не менее 10 суток.

Плотность посадки не должна превышать 1 г ихтиомассы мальков и 2 г взрослых рыб на 1  воды.

Для кормления рыб используют специальные пастообразные, гранулированные или живые корма, которые задают по мере его съедания, но не реже двух раз в сутки для мальков (утром и вечером) и один раз для рыб более старшего возраста.

Для проведения исследований необходимы следующее оборудование, приборы и материалы:

стеллажи;

емкости на 10, 20, 40, 60, 100, 200, 500, 1000 и 2000 л;

холодильные установки для хранения корма и реактивов;

весы аналитические с разновесами;

весы аптекарские (чашечные и ручные);

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

электромешалка;

вентиляторы или кондиционер;

ведра эмалированные;

бидоны, ведра эмалированные, тазы и кюветы разных размеров;

фотоаппарат:

сачки разноячейные;

материал из мелкоячейной сети, газа или дели для емкостей с рыбой;

микрокомпрессоры;

аквариумные водонагреватели с датчиками;

скальпели, пинцеты, ножницы, шприцы на 1-20 мл, препаровальные иглы;

секундомер;

линейки;

набор приборов, инструментов и реактивов для исследования крови; гистологических и биохимических исследований;

стеклянная посуда емкостью от 0,1 до 3 л, мерные пипетки, глазные пипетки, бюретки, мерные стаканы, колбы, чашки Петри, стеклянные трубки и палочки;

резиновые шланги разного диаметра и длины, резиновые груши;

полиэтиленовая пленка, клеенка, марля, халаты, резиновые фартуки, сапоги и перчатки;

карандаши по стеклу, лейкопластырь, фиксирующие и дезинфицирующие жидкости.

7.4.2. Проведение исследований

Для исследований отбирают одноразмерные экземпляры рыб в хорошем физиологическом состоянии.

Перед началом экспериментов рыб помещают в аквариумы или другие экспериментальные емкости на 7-10 суток с целью адаптации к новым условиям. В острых опытах длительностью 96 ч проводят определения , и . Хронические опыты начинают с концентрации, равной 1/2 , и создают токсикологический ряд из 5-10 убывающих концентраций вещества с множителем 1/2. Длительность хронических опытов составляет 1-3 месяца в зависимости от стабильности исследуемого вещества в воде.

Эксперименты проводят в стеклянных аквариумах или пластмассовых ваннах емкостью 20-40  в двукратной повторности с использованием 5-10 особей в каждой концентрации вещества. Два аквариума служат контролем.

Норма посадки мальков, сеголетков и годовиков лососевых и сиговых рыб в экспериментальные емкости для проведения опытов должна быть не более 1 г ихтиомассы на 1 л воды в сутки. Для рыб возрастом более года эта величина составляет не более 3 г на 1  воды в сутки.

Взвешивание рыб производят перед началом опыта, затем через каждые 10-15 суток до его окончания. Для этого на весы ставят сосуд емкостью 2-2,5 , в который наливают 0,5-1  воды, и уравновешивают его с помощью гирь или другого сосуда с водой. Затем отловленных сачком рыб быстро помещают в сосуд с водой для взвешивания, предварительно осушив низ сачка от избытка влаги марлей. Мальков взвешивают с помощью химических стаканов на аптекарских или других более точных весах.

В экспериментальных емкостях ежедневно измеряют температуру воды и один раз в 10 суток проводят определение содержания растворенного в воде кислорода и рН.

В зависимости от стабильности исследуемого вещества смену воды в опытных емкостях проводят один раз в 1-3 суток, спустя 1,5-2 ч после кормления рыб. При этом недопустимо травмирование рыб. Аэрация воды возможна лишь в тех случаях, когда состав и концентрация исследуемого вещества не изменяются. Толщина слоя воды в аквариуме для сеголетков и годовиков должна быть не менее 20 см, для более крупных рыб ее следует увеличивать.

Схема и динамика проведения опытов, учет регистрируемых показателей отражаются в лабораторном журнале.

Опыты по определению параметров острой и хронической токсичности веществ, установления коэффициентов кумуляции проводят на мальках или сеголетках. Ставят также острые и хронические опыты на сеголетках или двухлетках для определения их токсичности по физиолого-гистологическим, гематологическим показателям, используя среднелетальные, максимально переносимые и более низкие концентрации для установления пороговых.

7.4.3. Учет и анализ результатов приводят в п. 6.2.4 Приложения 2