Приложение 2. Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для пресноводных биологических тест-объектов

Приложение 2
к Методическим указаниям по
разработке нормативов
качества воды водных объектов
рыбохозяйственного значения, в
том числе нормативов
предельно допустимых
концентраций вредных веществ
в водах водных объектов
рыбохозяйственного значения

Требования
к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для пресноводных биологических тест-объектов

1. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для одноклеточных водорослей

1.1. Введение

Планктонные одноклеточные водоросли (фитопланктон), как и высшие водные растения, представляют в водных экосистемах группу организмов-продуцентов.

Из двух видов рекомендуемых одноклеточных водорослей (п. 2, Приложения 2) для исследований может быть выбран один, в зависимости от возможностей и традиций лаборатории. Другие виды водорослей могут быть использованы только в дополнение к обязательным видам.

Для экспериментов используют культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста. Большое значение имеет физиологическое состояние культуры, проверяемое по эталонному (стандартному) веществу.

Оценка влияния вещества на одноклеточные водоросли оценивается по показателям изменения численности клеток водорослей (снижение или увеличение) в опытной среде по сравнению с контролем;

Достоверное снижение численности клеток водорослей в растворе вещества является показателем токсического действия раствора вещества.

Критерием эвтрофирующего эффекта вещества является достоверное увеличение численности клеток водорослей в различных концентрациях вещества. Лимитирующий показатель вредности в данном случае - санитарный.

Наряду с изучением динамики численности водорослей, к регистрируемым показателям в опыте следует относить изменение рН; визуальные наблюдения за состоянием культуры водорослей: изменения в окраске, форме клеток и состоянии суспензии (взвешенное, опускание на дно, всплывание к поверхности, гомогенность или агрегация) по сравнению с контролем.

В качестве экспресс-метода оценки токсичности (эвтрофирования) химического вещества можно использовать приборный метод быстрой или замедленной флуоресценции водорослей (Минрыбхоз СССР введены в действие методические разработки ВНИРО от 18 декабря 1987 г. N 291-ц "Методические рекомендации по экспрессному биотестированию природных и сточных вод с использованием замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей". М.: ВНИРО, 1987) Показания изменения флуоресценции водорослей в растворах вещества по отношению к контролю следует относить к основным показателям, характеризующим процессы жизнедеятельности одноклеточных водорослей. Показания быстрой и замедленной флуоресценции относятся только к живым клеткам, отражают интенсивность процесса фотосинтеза водорослей, по калибровочной кривой позволяют определить количество живых клеток в эксперименте.

Кратковременная оценка токсичности раствора вещества - до 24-96 ч - позволяет определить наличие острого токсического действия вещества на одноклеточные водоросли, а длительное исследование - до 14 суток - его хроническое токсическое действие.

К дополнительным показателям при исследовании следует относить: оценку биомассы водорослей (полученную расчетным методом), оценку скорости и темпа деления клеток (расчет генераций), содержание фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла и каротиноидов), соотношение живых и мертвых клеток водорослей (используя люминисцентный микроскоп или различные витальные красители - цитохимический метод).

1.2. Характеристика тест-объекта

В качестве основных стандартных тест-объектов используются лабораторные альгологически чистые монокультуры одноклеточных зеленых водорослей сценедесмус и хлорелла, относящиеся к родам сценедесмус (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., S.acuminatus (Lagerh.) Chod) и хлорелла (Chlorella vulgaris Beyer, Chl. pyrenoidosa Chik). Чаще других в лабораторной практике используют виды S.quadricauda и Chl. vulgaris (сценедесмус квадрикауда и хлорелла вульгарис).

Сценедесмус широко распространен в водных объектах России и имеет относительно крупные удлиненно-овальные клетки с закругленными концами. Размер клеток 7-43 х 2,5-16 мкм. Клетки неподвижные, собранные в виде плоских пластинок (ценобии) по 2-, 4-, реже 8, 16 клеток. Размножение автоспорами. Автоспоры в материнской оболочке располагаются пучком, после освобождения разворачиваются в виде пластинки. В условиях культуры вместо ценобиев образуются отдельные клетки.

Хлорелла распространена в водных объектах южных широт (диаметр клеток 4,2-10,5 мкм). Клетки одиночные, шаровидные, с тонкой оболочкой, без слизи. Хроматофор чашевидный, с пиреноидом. Размножение автоспорами, образующимися по 4-8, реже 16 и освобождающимися через разрыв материнской оболочки. Диаметр клеток 4,2 - 10,5 мкм.

После пересева культур на новую среду экспоненциальная фаза роста наступает на 4 сутки.

Численность клеток за 3 суток увеличивается не менее чем в 3 раза.

1.3. Условия лабораторного содержания одноклеточных водорослей

Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:

фильтровальная установка любого типа;

фильтры мембранные (размер пор 3,5 мкм, 0,45 мкм);

пипетки автоматические дозаторы объемом 0,1, 0,2 ;

камера счетная Горяева или Фукс-Розенталя;

предметные и покровные стекла;

климатостат (люминостат) любого типа, оснащенный лампами дневного света 3000 - 6000 лк, обеспечивающий поддержание температуры °С;

спиртовка;

рН-метр;

оксиметр любого типа с погрешностью измерения не более 0,5 ;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

стаканы стеклянные лабораторные объемом 100, 500, 1000 ;

колбы конические емкость.# 50, 100, 250 , 1000 ;

эталонное (стандартное) химическое вещество: калий двухромовокислый (бихромат калия) или стандарт-титр калия двухромовокислого для проверки физиологической чувствительности культуры водорослей;

культуры зеленых одноклеточных водорослей Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. и Chlorella vulgaris Beyer.

Культивируют водоросли (Таблица 1.3.1.) на среде Прата или на среде Успенского N 1 (Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002)

Таблица 1.3.1.

Компоненты среды	Концентрация в среде для культивирования, г/дм3		Концентрация исходных растворов для приготовления среды, г/100 см3
Компоненты среды	Прата	Успенского N 1	Прата	Успенского N 1
KNO3	0,1	0,025	10,0	2,5
MgSO4 x 7H2O	0,01	0,025	1,0	2,5
Ca(NO3)2 x 4H2O	-	0,144	-	14,4
K2HPO4 x 3H2O	0,01	-	1,0	-
KH2PO4 x 3Н2O	-	0,025	-	2,5
K2CO3	-	0,0345	-	3,45
FeCl3 x 6H2O	0,001	-	0,1

Питательные среды Прата и Успенского для культивирования водорослей готовят на дистиллированной воде. Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, каждый ее компонент предварительно готовят отдельно в 100 дистиллированной воды (исходный раствор). Исходные растворы хранят в холодильнике при температуре от +2°С до +4°С в течение месяца, в случае помутнения производят их замену.

Из исходных растворов каждого вещества (кроме солей железа) по 1 добавляют в колбу объемом 1 , наполовину наполненную дистиллированной водой (добавление в последовательности расположения веществ в таблице 1.3.1.). Доливают колбу дистиллированной водой до объема 1 , перемешивают, после чего питательную среду стерилизуют в автоклаве (30 мин при 1 атм.) или кипячением на водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения стерилизованной среды в нее добавляют соль железа в количестве 1 на 1 среды (для среды Прата 1%-ный раствор ; для среды Успенского 1% растворы одного из солей железа , , или цитрат железа).

Приготовленную среду хранят до использования в темном месте при комнатной температуре.

Культивируют водоросли в люминостате в конических колбах объемом 250-300 закрытых фольгой или ватно-марлевым тампоном. Освещенность 3000-6000 люкс. Соблюдается световой суточный ритм. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1-2 раза в сутки. Температура при культивировании водорослей °С.

Повышение температуры до 25°С и выше усиливает токсическое действие, а понижение ее до 12-15°С задерживает проявление эффекта и снижает действие вещества.

Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 со свежей средой (100-150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 15-20 верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для культивирования, примерно 300 . Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат. В течение дня содержимое колбы перемешивают 1-2 раза.

1.4. Проведение исследований

Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении (п. 1.3. Приложения 2). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 5 .

В опыте используют начальную плотность клеток 25 . Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема тестируемой (контрольной, опытной) воды (например, 100 мл) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (примерно, 5 ). В указанном случае в опытную и контрольную воду добавляется по 0,5 трехсуточной культуры водорослей.

Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют стандартное (эталонное) вещество - двухромовокислый калий марки химически чистый ("хч") или стандарт-титр калия двухромовокислого.

Готовят маточный раствор двухромокислого калия концентрацией 1 . Далее методом разбавления - серию растворов с концентрациями 0,12; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Исследование проводят в течение 48 ч в трех повторностях. По результатам опыта рассчитывают среднюю концентрацию , вызывающую уменьшение численности клеток на 50% за 48ч ( за 48 ч). Если полученное значение находится в интервале 1,3-2,5 мг/л, то культура водорослей может быть использована для экспериментов.

Если полученные значения не попадают в указанный интервал, то эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия культивирования, состав культуральной среды и проч.). Иногда культуру водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.

При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 мл наливают по 100 мл (в колбы емкостью 100 мл - по 50 мл) контрольной среды или исследуемой концентрации вещества. Контролем служит культуральная среда, на которой культивируются водоросли (среда Прата или среда Успенского N 1). Концентрации веществ также готовят на соответствующей среде.

В опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 (0,25 ) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста,

Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток, которая должна составлять 25 . Колбы помещают в люминостат.

В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная.

Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный).

В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического эксперимента.

В основном остром и хроническом эксперименте шаг между концентрациями изменяется в 2-5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях.

Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.

На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое или эвтрофирующее действие на водоросли.

1.5. Учет и анализ результатов

Основным критерием токсичности действия веществ на тест-объект следует считать изменение численности клеток водорослей, последовательность прохождения ими всех стадий развития и их способности к размножению.

Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или счетную камеру Фукса-Розенталя.

При работе с камерой Горяева - камеру и покровное стекло обезжиривают (промывают спиртом). Затем из колбы наносят пипеткой по капле суспензии водорослей на верхнюю и нижнюю сетки счетной камеры, накрывают камеру покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через 1-2 мин начинают подсчет водорослей в 5-и больших квадратах камеры, расположенных по диагонали сетки счетной камеры, или в 25 больших квадратах всей камеры при малой плотности водорослей. Под микроскопом просчет из каждой контрольной и опытной колбы проводят не менее трех раз.

По окончании эксперимента рассчитывают численность клеток водорослей в остром и хроническом опытах по сравнению с контролем (в том числе и в процентах).

Рассчитывают численности клеток на 1 среды следующим образом: количество клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева умножают на , получая количество клеток в 1 суспензии.

Учет численности клеток можно также проводить в камере Фукса-Розенталя объемом 3,2 мл. При высокой численности клеток просчитывают по диагонали 16 квадратов, при малой - считают по всему полю камеры. Количество клеток также выражают в 1 . Расчет клеток производят по формуле:

где М - количество клеток в 1 ; m - количество просчитанных клеток (сумма); n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющей площадь маленького квадрата.

Результаты исследования учитывают, если численность клеток водорослей в контроле увеличивается за 96 ч не менее чем в 3 раза. При изменении численности клеток в контроле менее чем в 3 раза, результаты опыта считаются недействительными.

Используя приемы статистической обработки, устанавливают достоверность различия (снижение или увеличение) численности клеток между и опытом и контролем.

Численность живых и мертвых клеток определяют с помощью люминесцентной микроскопии. Ранжируя клетки по интенсивности свечения, можно установить время воздействия вещества на водоросли, степень и скорость отмирания.

На практике в основном различают три цвета - жизнеспособные клетки светятся ярким пурпурно-красным светом, отмирающие - различными оттенками тускло-красного или оранжево-красного тона, мертвые - желтовато-салатным. При подсчете клеток водорослей учитываются все три группы - живые, мертвые и отмирающие клетки. В стадии интенсивного роста клеток водорослей в культуре наблюдается минимальное присутствие мертвых клеток.

Помимо люминесцентной микроскопии разделение живых и мертвых клеток может проводиться путем микроскопии в видимой области, с использованием специальных красителей.

Активная реакция среды - изменение рН среды служит интегральным косвенным показателем состояния культуры. Чем выше жизнеспособность водорослей, тем значительнее изменяется на свету реакция среды (подщелачивание) в результате фотосинтетической ассимиляции углекислоты. Измерение рН среды осуществляется с помощью рН-метра, что является обязательным в начале и конце опыта, при хроническом эксперименте - в дни учета биологических показателей.

2. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для высших водных растений

Высшие водные (сосудистые) растения являются важным компонентом сообщества организмов-продуцентов водных объектов. Иногда такие растения называют макрофитами из-за их относительно крупных размеров.

Высшие пресноводные растения образуют основную фитомассу водных объектов, являются основным звеном, создающим первичное органическое вещество и выделяющим кислород, служат основным субстратом для размножения водных животных и местом их укрытия от опасности. Важную роль играет это звено в самоочищении водных объектов.

В схеме определения ПДК вещества это звено представлено (на выбор) двумя видами - укореняющейся Elodea canadensis Rich, (элодея), у которой основная часть стебля взвешена в толще воды, и плавающей Lemna minor L. (ряска), у которой в толще воды располагаются только корешки, а основное растение стелется по поверхности.

2.1. Элодея

2.1.1. Характеристика тест-объекта

Элодея (Elodea canadensis Rich.) - представитель погруженных растений, широко распространенный в пресноводных водных объектах умеренной зоны.

Размножается вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов. Теневынослива. Температурная граница выживаемости лежит в пределах от +5°С до 41,5°С.

Для культивирования растения отбирают из естественной популяции условно чистого водного объекта в конце мая - начале июня, когда появляется много молодых, наиболее жизнеспособных растений.

У элодеи отбирают зеленые верхушечные побеги длиной 8-10 см без боковых отростков и корней, не имеющие видимых повреждений.

Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.

2.1.2. Условия лабораторного содержания

В лаборатории элодею размещают в большие широкие, но не глубокие емкости (10-15 ). Растения проходят акклимацию при комнатной температуре в течение 7-10 дней, достаточной освещенности (лучше - в люминостатной установке) и при смене воды каждые 2-3 суток.

Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:

люминостатная установка;

круглые аквариумы на 10 - 15 л;

кристаллизаторы объемом 1 л;

стаканы объемом 0,5 л;

люксметр;

термометр;

линейка;

глазной пинцет, лезвие;

воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;

планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.

Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемого водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной продувкой воздуха.

Для исследований воду используют через 4-5 дней.

Сосуды располагают у окон на дневном рассеянном свету (с южной стороны) или в люминостате при освещенности 1,5-2 лк на протяжении 10-12 ч и при температуре 22-25°С. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.

В воду добавляют среду Успенского N 1 (разведение 1:10), которая способствует быстрому образованию боковых отростков и увеличению биомассы растения и дает возможность круглогодичного содержания растений, пригодных для экспериментов.

Предварительно приготовленные основные растворы держат в холодильнике, затем из них вносят по 0,5 на 1 дистиллированной воды; рН после стерилизации раствора (равномерным кипячением в течение 0,5 ч) составляет 7,0 - 7,3.

2.1.2.1. Проведение исследований

Для экспериментов используют верхнюю часть побега элодеи длиной 4 см без боковых отростков и корней и по 5 экземпляров помещают в кристаллизаторы с растворами исследуемого вещества и с водой без токсиканта объемом по 1 . Для каждой концентрации и для контроля используют по три таких сосуда. Сосуды размещают в люминостате или у окон на дневном рассеянном свету с досвечиванием лампами дневного света при температуре 17-22°С и освещенности до 2 лк.

До проведения хронического эксперимента следует в предварительном 10-дневном опыте установить диапазон действующих концентраций вещества. Из раствора, вызывающего гибель половины особей () за 10 суток, для проведения хронического опыта готовят не менее 3-6 разведений, различающихся между собой на порядок.

Опыты, продолжительностью не менее 30 суток, наиболее удобно проводить в летний период. Смену всех растворов и воды в контроле проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2-5 суток.

Состояние выборок учитывают каждые 5 суток.

2.1.2.2. Учет и анализ результатов

Оценку токсичности веществ для элодеи осуществляют по следующим параметрам:

а) состояние растений (изменение окраски, потеря тургора, повреждение точек роста и др.);

б) выживаемость и прирост основного побега;

в) число боковых отростков и их длина;

г) число корней и длина.

Прирост основного побега элодеи определяют, вычитая исходные 4 см. Суммарный прирост растения составляется из суммы прироста основного побега и длины боковых отростков. Прирост выражают в сантиметрах, число боковых отростков и корней - в штуках (экз.).

У элодеи в лабораторных условиях боковые отростки и корни появляются, как правило, на 10-20 сутки. Отмечают время их появления. Прирост, число и длину боковых отростков и корней рассчитывают на одно растение.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

2.1.3. Ряска малая

2.1.3.1. Характеристика тест-объекта

Ряска малая (Lemna minor L.) - представитель группы растений с плавающими листьями. Тенелюбива, устойчива к низким температурам. Ее распространение ограничено участками водных объектов с рН от 6,2 до 7,5.

Для культивирования растения отбирают из естественной популяции водного объекта в конце мая - начале июня, когда много молодых, наиболее жизнеспособных растений. При отборе ряски выбирают растения с зелеными лопастями и с корнями, не имеющими видимых повреждений.

Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.

2.1.3.2. Условия лабораторного содержания

В лаборатории ряску помещают в кристаллизаторы объемом 1 с речной или отстоянной водопроводной водой. В течение 7-10 дней растения проходят акклимацию при комнатной температуре и при достаточной освещенности (лучше в люминостатной установке), со сменой воды каждые 2-3 суток для удаления продуктов метаболизма.

Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:

люминостатная установка;

круглые аквариумы на 10-15 ;

кристаллизаторы объемом 1 ;

стаканы объемом 0,5 ;

люксметр;

термометр;

линейка;

глазной пинцет, лезвие;

воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;

планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.

Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязненного водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной аэрацией воды.

Для исследований воду используют через 4-5 дней.

Ряску в количестве 5 растений, имеющих одну сформировавшуюся и одну развивающуюся лопасть и корень с неповрежденным корневым чехликом, и примерно одинаковой длины, помещают в стаканы объемом 0,5 и размещают в люминостате при температуре 22-25°С и освещенностью 5 лк. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.

Для круглогодичного культивирования ряски в целях получения достаточного количества материала рекомендуют выращивать их на среде Гапоненко-Стажецкого при круглосуточном освещении 7-8 лк и температуре +25°С.

Состав среды Гапоненко-Стажецкого:

- 0,4 г/л,

- 0,2 г/л,

- 0,3 г/л,

- 0,6 г/л,

- 0,3 г/л,

- 0,5 мг/л,

цитрат железа - 5 мг/л.

Среду автоклавируют при 1,5 атм в течение 20 минут, цитрат железа вносят после стерилизации.

2.1.3.3. Проведение исследований

До постановки хронического эксперимента следует провести предварительный 10-дневный опыт для установления диапазона действующих концентраций вещества. Для каждой концентрации и контрольной выборки отводят по 3 стакана.

Для проведения хронического опыта из концентрации, вызывающей за 10 суток гибель 50% особей, готовят не менее 3-6 разведений, отличающихся на порядок.

Хронические опыты продолжительностью не менее 30 суток наиболее удобно проводить в летний период. Растения по 5 экземпляров рассаживают в стаканы (объем 0,5 ), которые размещают в люминостате или на рассеянном свету при температуре 22-25°С и освещенности 3-4 лк.

Смену опытных растворов проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2-5 суток, одновременно меняя воду и в контроле.

2.1.3.4. Учет и анализ результатов

Состояние растений учитывают каждые 5 суток по выживаемости и изменению ряда биологических показателей.

Отмечают общее состояние растений: изменение окраски, размер лопастей, состояние корней), число растений, лопастей и корней в штуках. Общее число лопастей составляет суммарный прирост ряски.

Измерения длины проводят с помощью линейки.

Все результаты измерений пересчитывают на одно растение.

Учитывают сроки образования новых лопастей и корней, а также новых растений, которые приходятся примерно на 10 - 20-е сутки.

3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших

3.1. Введение

Простейшие, в частности инфузории, составляют до 70% численности гетеротрофного микропланктона в водных объектах. Многочисленность данной группы организмов, экологическая значимость ее в процессах самоочищения, в продукционных процессах, трофических связях, значение ее как составной части естественной кормовой базы зоопланктона и молоди рыб вызывают необходимость исследовать данную группу в токсикологическом плане. Наблюдения показали, что простейшие в силу своих физиологических особенностей проявляют большую чувствительность к изменению факторов внешней среды. Их короткий цикл развития дает возможность проследить действие отдельных веществ на ряде поколений. Данные организмы (особенно ресничные инфузории) достаточно легко культивировать. Все это делает простейших удобным тест-объектом для токсикологических опытов.

3.2. Характеристика тест-объекта

В токсикологических исследованиях в качестве тест-объектов используется парамеция (Paramecium caudatum Ehrenberg) - свободноживущая широко распространенная ресничная инфузория, предпочитающая альфа-мезосапробные условия. Температурный оптимум лежит в пределах 24-28°С, предпочитает рН, близкую к нейтральной (6,5-7,5). Основными регистрируемыми показателями являются выживаемость и скорость размножения.

Выбор парамеции в качестве тест-объекта обусловлен следующими критериями. Благодаря сочетанию в парамеции признаков клетки и организма на ней можно изучить как клеточные, так и организменные формы реакции на токсическое воздействие. Возможность культивирования в широком диапазоне температур позволяет использовать их для экспериментальных работ в любое время года.

Короткий жизненный цикл, быстрота размножения позволяют проследить реакцию на интоксикацию в относительно короткий срок в длинном ряду поколений. Используя принцип клонирования, можно получить большое количество генетически однородного материала.

3.3. Условия лабораторного содержания

Парамеций выделяют из природных водных объектов или берут чистые культуры из коллекций. Из природных водных объектов банкой на 1 у самого берега зачерпывают воду с илом. В тот же день под бинокуляром просматривают пробу.

Обнаруженных парамеций последовательно переносят в микроаквариумы сначала со смесью: природная среда и культуральная среда в соотношении 2:1, затем увеличивают содержание культуральной среды в микроаквариумах через каждый час и, наконец, помещают в чистую культуральную среду.

Монокультуру простейших культивируют при комнатной температуре °С на среде Лозина-Лозинского в чашках Петри при естественном освещении, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей или в люминостате.

Используется лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:

реактивы для приготовления среды Лозина-Лозинского;

вода дистиллированная;

бумага фильтровальная;

колбы на 1000 ;

градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 ;

пипетки для пересадки простейших (Пастеровские пипетки с укороченным концом);

мерные колбы на 100 ;

мерные пробирки на 10 ;

чашки Петри;

микроаквариумы (блок камер из оргстекла);

бинокуляр МБС-9 или МБС-10;

рН-метр;

двухромовокислый калий марки "хч" или стандарт-титр калия двухромокислого;

культура простейших (Paramecium caudatum Ehrenberg 1838)

сухие пекарские дрожжи;

Состав минеральной среды Лозина-Лозинского для культивирования P. caudatum:

в 1 дистиллированной воды растворяют:

NaCl - 0,1 г;

KCl - 0,01 г;

- 0,01 г;

- 0,02 г.

В качестве корма используют хорошо высушенные и измельченные пекарские дрожжи, которые легко хранить в закрытой посуде. Вносят их в чашки Петри в очень небольшом количестве на кончике скальпеля, или делают суспензию дрожжей и стерильной пипеткой производят подкормку парамеций из расчета 2-3 капли на чашку Петри. Можно в качестве корма использовать (на чашку Петри) частицу дробленного зерна риса.

Два раза в неделю рекомендуется просматривать состояние культуры в чашках Петри. Через две недели культуру пересаживают, т.е. 100-300 особей пипеткой переносят в чашку Петри с чистой средой, куда добавляют один из названных видов корма.

Не реже 1 раза в месяц проводят оценку физиологической чувствительности организмов. Для этого используют эталонное (стандартное) вещество - двухромовокислый калий марки "хч" или стандарт-титр калия двухромокислого. Готовят маточный раствор двухромокислого калия концентрацией 1 . Далее методом разбавления готовят серию растворов с концентрациями 100,0; 150,0; 200,0; 250,0 и 300,0 . Исследование проводят в течение 24 ч. По результатам эксперимента рассчитывают летальную концентрацию , вызывающую гибель простейших на 50% ( за 24 ч). Если полученные значения находятся в интервале 170-220,0 , то культура может быть использована для проведения экспериментов.

Если полученные значения не попадают в интервал 170-220 , эксперименты с простейшими не проводят, выясняют причину этого, эксперимент повторяют.

3.4. Проведение исследований

Перед постановкой опытов культуру простейших необходимо вывести в экспоненциальную фазу развития, что достигается пересевом культуры за трое суток до постановки опытов в чашку Петри с добавлением корма.

Эксперименты можно проводить как в чашках Петри объемом 25 , так и в камерах с рабочим объемом 4 . Плотность посадки в чашках Петри (с рабочим объемом 10 мл) 10 организмов, в камерах с рабочим объемом 4 мл - 5 организмов. Повторность - двух или трехкратная.

Для предварительных и окончательных экспериментов удобно использовать камеры из органического стекла с рабочим объемом 4 . Блок камер состоит из двух склеенных между собой пластин размером 20-21x7-8 см. В верхней пластине толщиной около 1 см просверливают отверстия диаметром 3 см. Нижняя пластина толщиной около 0,5 см служит дном. В блоке 12 камер (лунок), которые расположены в два ряда по шесть в каждом. В каждую лунку вносят по 5 парамеций. Пять рядов используют для различных концентраций вещества, а шестой - для контроля. Повторность при этом двухкратная (два ряда лунок в блоке). Сверху микроаквариум закрывают стеклянной пластинкой соответствующего размера, что препятствует испарению раствора.

В качестве показателей токсического действия целесообразно использовать выживаемость и темп деления простейших.

В первом случае в камерах из органического стекла (объем 4 ) определяют концентрации вещества, вызывающие гибель (, , ) или любое повреждающее действие (, , ) подопытных организмов за определенный срок. Длительность опыта определяется токсичностью среды и составляет обычно от нескольких часов до 5 суток. Контролем служит культуральная среда. Наблюдения проводят под бинокуляром каждые сутки.

Эксперименты на простейших проводят в два этапа (предварительный и окончательный). В предварительном эксперименте находят интервал токсических концентраций. Опыты ставят в широком диапазоне концентраций вещества, причем предыдущую концентрацию последовательно увеличивают в 10 раз (0,1; 1,0; 10,0 и т.д.). В окончательном эксперименте, установив диапазон действия вещества, разбивают найденный интервал на пять равных концентраций и устанавливают .

Темп деления простейших определяют в микроаквариумах (планшет с ячейками (лунки диаметром 1 см, глубина 0,5 см). Планшет с микроаквариумами представляет собой стеклянный или изготовленный из оргстекла квадратный или прямоугольный брусок толщиной 1 см с пятью рядами полированных лунок. В каждом ряду, соответственно, 5 или 10 лунок. Микроаквариумы накрывают стеклянной пластинкой, предохраняя испарение среды из лунок.

Лунки в каждом ряду (5-10 лунок) заполняются раствором вещества определенной концентрации. В каждую лунку микроаквариума помещают по одному организму. Ежесуточно в течение нескольких суток (3-5 суток) подсчитывают количество организмов в каждой лунке каждого ряда, оставляя, после подсчета организмов, в лунке исходное количество организмов (1 экземпляр), удаляя лишние организмы. Или можно по одному организму переносить в соответствующую лунку с теми же концентрациями вещества аналогичного планшета с микроаквариумами.

3.5. Учет и анализ результатов

В качестве показателя действия токсикантов на тест-объект используют показатель выживаемости инфузорий за определенный срок наблюдения или нарушение темпа деления клеток инфузорий, которое выражается в изменении прироста численности клеток в проценте от контроля. Прирост численности организмов оценивают по формуле: , где - численность организмов в конце опыта (или последующие сутки подсчета), a - численность организмов в начале опыта (или предыдущие сутки подсчета). Результаты обрабатывают методами статистики.

4. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для зоопланктонных ракообразных

Ракообразные включены в схему по определению ПДК вещества в качестве типичного представителя звена зоопланктона и важнейшего кормового объекта.

Метод с использованием ветвистоусых ракообразных в качестве тест-объектов является одним из наиболее широко применяемых в практике водной токсикологии у нас в стране и за рубежом. Наиболее часто используются виды дафний, цериодафний, моин (Daphnia magna, D. longispina, D. carinata, Ceriodaphnia affinis, Moina macrocopa).

По экологическим и токсикологическим характеристикам дафния карината (D. carinata) близка к дафнии магна (D. magna), но легче переходит от партеногенетического типа размножения к бисексуальному и обратно. Этот вид может быть рекомендован для использования в южных районах страны с высокой среднегодовой температурой, так как имеет довольно высокий температурный оптимум - 28 - 31°С. Вид дафния лонгиспина (D. longispina) к ксенобиотикам имеет приблизительно такую же токсикорезистентность, как и предыдущие виды, но менее вынослив к осолонению водных объектов и загрязнению гуминовыми кислотами. Кроме того, D.longispina - олигосапробный вид, тогда как D. magna и D. carinata - типичные бетамезосапробы. Не рекомендуется для экспериментов вид D. pulex из-за его полиморфности и вариабельности токсикорезистентности.

В настоящее время наиболее часто используются D. magna - стандартный биотест для токсикологических исследований в ряде стран, а также С. affinis, цикл развития которой в два раза короче, чем у дафний. Метод с использованием цериодафний при строгом соблюдении условий опыта вдвое короче, чем с использованием дафний. Эксперименты с более мелкой цериодафнией компактны - требуются меньшие объемы растворов и посуды. Однако на более крупных дафниях удобнее производить измерения, вести наблюдения за показателями размножения (четче выявляются патологические отклонения - абортирование яиц, эмбрионов, уродства).

В связи с большей требовательностью цериодафний к кислородному режиму среды, они более чувствительны к органическому загрязнению и веществам, снижающим концентрацию растворенного кислорода в воде. По отношению к действию тяжелых металлов видовая чувствительность различна: в одних случаях более устойчивы цериодафнии, в других - дафнии.

Оценку токсичности на ветвистоусых ракообразных разных видов можно проводить по единой методике, изменяя процедуру постановки опытов с учетом индивидуальных биологических характеристик вида - разной продолжительности цикла развития, размеров, оптимальных условий содержания.

В данном руководстве приводятся две методики определения хронической токсичности вещества на ракообразных:

1. Длительный опыт на серии трех поколений - D. magna или С. affinis. Проведение исследований на серии генераций предпочтительно тогда, когда есть основания полагать, что отрицательное действие веществ может накапливаться в поколениях.

2. Длительный опыт на модельных популяциях дафний - D. magna, D. longispina или D. carinata. Проведение исследований по этой схеме предпочтительно тогда, когда возможно отрицательное действие веществ на бисексуальный тип размножения, связанный с образованием самцов и латентных яиц. Кроме того, данный прием обеспечивает прямую оценку влияния вещества на продуктивные свойства дафний. В отдельных случаях выявлено, что при бисексуальном размножении дафний латентные яйца оказываются дефектными или вообще не развиваются. Дафния откладывает пустой эфиппиум.

Для работы с ракообразными необходимы оборудование и материалы:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

бинокуляр МБС;

рН-метр;

оксиметр;

микрокомпрессоры;

аквариумы для хранения чистой воды (от 50 до 200 л);

камера Горяева;

стаканы химические (на 0,05; 0,1; 0,3 л; 0,5 л);

пробирки;

колбы мерные (на 0,1 - 2 л);

цилиндры мерные (на 0,5 - 2 л);

колбы конические (на 0,2 - 0,5 л);

кристаллизаторы (на 0,5 - 1,0 л);

пипетки мерные (на 0,1 - 10 мл);

кюветы для выращивания водорослей;

шелковые мельничные сита, аквариумные сачки реактивы, входящие в состав сред для выращивания водорослей.

4.1. Дафния магна

4.1.1. Введение

Предлагаемая методика с использованием дафний вошла в состав ряда методических указаний и рекомендаций по установлению токсичности сточных и природных вод (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 06 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды"; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).

4.1.2. Характеристика тест-объекта

Рачки вида Daphnia magna Straus (класс Crustacea, отряд Cladocera) обитают в стоячих и слабопроточных водных объектах, особенно часто - во временных лужах, и распространены повсеместно на территории России.

Этот вид является типичным бетамезосапробом, перенося осолонение до 6. Оптимальное содержание кислорода для дафнии составляет 7-8 мг/л, однако рачок способен переносить снижение концентрации до 2 мг/л.

Оптимальные значения активной реакции среды рН составляют 7,0 - 8,0, однако временные изменения рН в пределах 5,8 - 9,0 не подавляют существенным образом жизнедеятельность дафнии.

При культивировании и проведении токсикологических опытов необходимо поддерживать непрерывное партеногенетическое размножение рачков, учитывая особенности биологического цикла развития рачков.

Длительное культивирование дафний в лабораторных условиях позволяет установить пределы изменчивости основных биологических показателей рачков в зависимости от сезона. В оптимальных условиях содержания выживаемость дафний не зависит от времени года, оставаясь на уровне 80-100% к концу опытов. Средние значения плодовитости за 30 суток опытов (за это время получают 7 - 8 пометов) составляют от 60 до 170 экземпляров молоди на одну самку. Могут наблюдаться повторяющиеся снижения плодовитости рачков в зимний (ноябрь - январь) и летний (июнь - июль) периоды. Длительность культивирования рачков в лаборатории в оптимальных условиях даже в течение 10 лет не влияет на результаты опытов.

4.1.3. Условия лабораторного содержания

Работу с дафниями необходимо проводить в помещении, где не используются химические летучие вещества. Недопустима также обработка помещения хлор- и фосфорорганическими пестицидами для борьбы с насекомыми и грызунами.

Дафний отлавливают в природном водном объекте (или получают культуру в одной из специализированных лабораторий). Для постепенной адаптации дафний рекомендуется смешивать 1 часть воды из природного водного объекта или воды, в которой рачки предварительно культивировались, с тремя частями лабораторной воды. Культуральная среда обновляется полностью или частично 1 раз в неделю.

Стабильные условия культивирования обеспечиваются в специально устроенном шкафу-термолюменостате. Он представляет собой застекленный бокс с раздвижными стеклами и рядом полок для сосудов. Хорошо предусмотреть ряд секций для раздельного содержания маточных культур дафний и постановки хронических экспериментов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400 - 600 люкс в течение 10 - 12 ч в сутки. В шкаф может быть встроен обогреватель с контактным термометром, обеспечивающим температуру °С.

Для культивирования дафний используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемых водных объектов. Отбор воды из природных водных объектов лучше производить в ясную погоду, желательно после ряда дней без дождя. Неблагоприятное действие на рачков может оказать вода, взятая в паводковый период. Природную воду необходимо процеживать через сито (N 68-72) во избежание попадания простейших и коловраток, которые могут паразитировать на рачках. Водопроводной водой можно пользоваться после предварительного удаления из нее остаточного хлора путем длительного продувания воздуха с помощью микрокомпрессора (около 14 дней). На дно аквариума насыпают хорошо промытый песок, сажают 5-10 растений.

Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний, должны находиться в следующих пределах:

а) содержание кислорода 7-8 ;

б) рН - 7,0-8,2;

в) окисляемость по Кубелю 4,2 - 5,8 ;

г) общая жесткость 3,0 - 6,5 ( мг );

д) соотношение Ca/Mg 4:1;

е) , - отсутствие, следы. В почти всех остальных случаях без знаков препинания!

В качестве основного корма для дафний могут быть использованы зеленые протококковые водоросли и в качестве дополнительного - пекарские дрожжи только для маточных культур. Дрожжами дафний можно подкармливать 1 - 2 раза в неделю из расчета 3 мл 1%-й суспензии на 1 среды. Взвесь дрожжей хранится в холодильнике не более трех дней.

Состав сред для культивирования кормовых водорослей представлен в таблице 4.1.1.

Быстрый рост накопительной культуры водорослей хлореллы (Chlorella vulgaris) создается при соблюдении следующих условий: питательная среда с добавлением микроэлементов (Тамия), круглосуточное освещение лампами дневного света (2-4 тыс. лк) и интенсивное продувание атмосферного воздуха (аэрация) с помощью микрокомпрессоров. При выращивании водорослей на средах Успенского и Прата (с меньшим количеством солей) аэрация не требуется, но рост водорослей идет значительно медленнее.

Питательные среды для водорослей готовят на дистиллированной воде (п. 2.2, Приложения 1 настоящих Методических указаний). Растворы солей железа и микроэлементов можно добавлять во все среды независимо от того, указано это в прописи среды или нет.

Исходная концентрация водорослей должна быть около 2 . Через 7-10 дней роста в оптимальных условиях культура достигает максимальной плотности.

Для кормления водоросли отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 3-5 дней. Осадок разбавляется дистиллированной водой и хранится в холодильнике не более трех недель.

Таблица 4.1.1.

Состав сред для культивирования кормовых водорослей

Соли	Содержание солей в средах, г/дм3
Соли	Тамия	Успенского	Прата
KNО3	5,00	0,025	0,1
MgSО4 7H2О	2,50	0,025	0,01
К2НРО4 3Н2О	-	-	0,01
КН2РО4 3Н2О	1,25	0,025	-
КСО3 или (К2СО3)	-	0,0345	-
FeSО4 7H2О	0,003	-	-
FeCl3 6H2О	-	-	0,001
Ca(NО3)2 4H2О	-	0,144	-
Микроэлементы*	по 1 см3 растворов N 1 и N 2

Примечание: раствор микроэлементов N 1: - 2,86 ; - 1,81 ; - 0,222 ; Раствор микроэлементов N 2: - 17,64 ; - 22,96 .

Число клеток в суспензии хлореллы просчитывают в камере Горяева (или любой другой камере для счета водорослей). Кормление дафний проводится 1 раз в день, концентрация корма в сосуде с дафниями 350 - 700 тыс. кл/мл.

Для культивирования рачков удобны небольшие стеклянные кристаллизаторы объемом 1 - 3 , плотность посадки 20 - 25 особей на 1 . Появившуюся молодь в необходимом количестве отсаживают в следующие сосуды от поколения к поколению. Когда вновь народившиеся рачки начинают размножаться, материнские особи удаляют. Каждое поколение маркируют и ставят дату рождения. Одновременно в лаборатории содержат культуры двух поколений дафний.

4.1.4. Проведение исследований на сериях генераций

Требования к тест-объекту. Для токсикологических исследований используют дафний, начиная с третьего поколения, полученного в лаборатории. Перед проведением эксперимента оценивают устойчивость рачков к бихромату калия. По величинам за 24 ч определяют соответствие культуры стандарту. Эта концентрация для дафний в возрасте ч должна находиться в пределах 0,9 - 2,0 мг/л.

4.1.4.1. Оценка острой токсичности. Основная цель острых (краткосрочных) опытов на дафниях - установить концентрации исследуемого вещества, которые в водных объектах могут вызвать массовую гибель наиболее продуктивной части зоопланктона - фильтраторов. Кроме того, устанавливается концентрация, начиная с которой следует проводить хронические (длительные) эксперименты.

Острые опыты по оценке токсичности состоят из двух экспериментов - предварительного и основного.

Предварительный эксперимент проводят с набором 3-5 концентраций вещества, различающихся в 10 раз. Обычно это 0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 вещества. Длительность такого опыта 24-48 ч, он позволяет установить порядок остролетальных концентраций веществ.

Основной острый опыт проводится на основании результатов предварительного варианта с набором около 5 концентраций. Выбирают такой диапазон концентраций вещества, которые вызывают иммобилизацию или гибель 10-90% рачков. Продолжительность основного острого опыта 48 ч.

В экспериментальные стеклянные стаканы заливают возрастающие объемы исследуемых растворов в количестве по 100 и помещают по 10 односуточных дафний. Повторность опытов в предварительном эксперименте составляет 2 - 3, а в окончательном - не менее трех.

Условия проведения опытов: температура °С, световой день - 10-12 ч, вода по своим свойствам должна соответствовать требованиям, перечисленным выше (п. 4.1.3 Приложения 2). В ходе острых опытов рачков не кормят. При работе со стабильными веществами замену растворов не проводят. В случае, когда исследуется быстро распадающееся вещество, исследования проводят с ежедневной заменой растворов.

4.1.4.2. Учет и анализ результатов в острых опытах. В опытах длительностью до четырех суток основным показателем токсичности среды является выживаемость дафний. Наблюдения за выживаемостью дафний проводят непрерывно в течение первого часа воздействия, затем ежечасно в первый день наблюдений и 2 - 3 раза в день - в последующие сроки.

Время гибели рачков отмечают по наступлению неподвижности (иммобилизации), при которой дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при покачивании стакана. Данные по выживаемости рачков записывают в таблицу по форме 1.

Форма 1

Учет выживаемости дафний в растворах токсиканта А и Б

Дата	Час	Срок	Контроль	Концентрации (мг/л)
				Вещество А			Вещество Б
				Повторности			Повторности
				1	2	3	1	2	3

В качестве дополнительных показателей в остром опыте можно учитывать: изменение окраски тела, кишечника, жирового тела, гонад, изменение наполнения кишечника, а также поведенческие реакции по балльной системе.

Изменения перечисленных показателей нередко предшествуют гибели организмов, что позволяет использовать их для ранней диагностики.

По результатам острых опытов определяют концентрацию вещества, вызывающую гибель 50% подопытных организмов за 48 ч экспозиции (). Наиболее простым и часто применяемым для определения является графический метод. В системе координат по оси ординат откладывают величину выживаемости (гибели) дафний в процентах за заданный срок опытов, а по оси абсцисс - логарифм концентрации. Точка пересечения горизонтальной прямой, соответствующей 50% выживаемости рачков, с экспериментальной линией определит искомую концентрацию .

Графически может быть определено также для каждой концентрации вещества медианное время выживания (), то есть время выживания 50% организмов при данной концентрации.

Более точное определение может проводиться с использованием пробит-анализа (п. 4, Приложения 4).

Результаты опытов дают возможность оценить также наличие острой токсичности по концентрациям, вызывающим достоверное снижение выживаемости рачков по сравнению с контрольными и определить максимальную концентрацию, при которой острая токсичность не проявляется.

Достоверность получаемых результатов можно считать надежной, если удовлетворены следующие условия:

а) гибель контрольных дафний не превышает 10%;

б) бихромата калия за 24 ч для дафний в возрасте ч находятся в диапазоне 0,9-2,0 мг/л;

в) содержание растворенного кислорода, определенное в конце опыта, составляет не ниже 2,0 .

4.1.4.3. Оценка токсичности в хроническом эксперименте. Хронические (длительные) опыты с дафниями служат для глубокого, более детального исследования токсичности химических соединений.

Для хронических опытов подбирают 3-4 концентрации вещества, составляющие 0,1-0,0001 от за 48 ч.

В каждой серии эксперимента (контрольной или опытной) используют не менее 20 рачков, а опыты ставят не менее чем в трех повторностях (приемлемы 4 повторности по 5 дафний или 3 повторности по 7 дафний). В опытные стаканы заливают растворы, исходя из соотношения 50 на 1 дафнию. Возраст рачков ч.

Общие условия (температура, освещенность) проведения хронических опытов те же, что и в острых опытах. Рачков ежедневно кормят хлореллой в концентрации 350 - 700 . Частота замены растворов определяется свойством веществ, но не реже двух раз в неделю. При смене растворов сохраняют соотношение 50 на 1 дафнию, если рачки погибают, количество исследуемого раствора пропорционально уменьшают.

Продолжительность опытов с каждой генерацией определяется временем появления четырех пометов у контрольных дафний, что составляет обычно около 20 суток, а общая продолжительность опытов - 40-45 суток.

При проведении опытов на поколениях придерживаются следующей схемы: молодь из первого помета, появившуюся от исходных особей, отсаживают в таком же количестве в растворы вещества с концентрациями, при которых проводились исследования с исходными особями, и ведут такие же наблюдения до получения трех поколений (Таблица 4.1.2.).

Таблица 4.1.2.

Схема опытов на серии генераций дафний

Оцениваемое поколение	Учитываемые пометы	Сумма молоди
Исходное F_исх	F(1)_исх, F(2)_исх, F(3)_исх, F(4)_исх	Сумма F(1-4)_исх
Первое F_1	F(1)_1, F(2)_1, F(3)_1, F(4)_1	Сумма F(1-4)_1
Второе F_2	F(1)_2, F(2)_2, F(3)_2, F(4)_2	Сумма F(1-4)_2
Третье F_3	F(1)_3, F(2)_3, F(3)_3, F(4)_3	Сумма F(1-4)_3

Примечание: F - поколения; верхний индекс - пометы каждого поколения; нижний индекс - оцениваемое поколение.

4.1.4.4. Учет и анализ результатов в хроническом опыте. Основными показателями токсического действия являются выживаемость, рост, плодовитость и качество потомства. При наблюдении за размножением рачков учитывают время наступления половозрелости в днях, регистрируемое по моменту откладки яиц в выводковую камеру, время рождения первого помета, количество народившейся молоди в каждом помете. Необходимо учитывать также патологические отклонения: количественный учет абортивных яиц и эмбрионов, мертворожденной и уродливой молоди. В случае появления уродливой молоди, ее отсаживают в небольшие сосуды с соответствующими концентрациями исследуемого соединения и наблюдают за ее выживаемостью минимум трое суток.

Наблюдения за выживаемостью и показателями размножения дафний ведут ежедневно, подсчет, анализ и удаление молоди удобно проводить во время смены растворов. Получаемые в ходе опытов результаты регистрируют в таблице согласно форме 2.

Общее количество народившейся жизнеспособной молоди от одной самки отражает величину реальной (фактической) плодовитости дафний.

Форма 2

Изменение биологических показателей у дафний исходного (1-го, 2-го, 3-го) поколения при действии исследуемого вещества

Дата учета	Срок в сутках	Контроль			Концентрация (мг/л)
		Повторности исходного, 1-го, 2-го, 3-го поколений			Повторности исходного, 1-го, 2-го, 3-го поколений
		Число рачков	Число молоди	Нарушения	Число рачков	Число молоди	Нарушения

Эта величина, в конечном итоге, определяет сохранность вида и имеет решающую роль при оценке токсичности.

Суммарное количество образованных яйцеклеток в организме дафний (патология и фактическая плодовитость) составляет потенциальную плодовитость дафний.

В редких случаях химические вещества могут влиять на темп роста рачков, снижая или увеличивая скорость роста на разных этапах жизни. Из каждой концентрации следует проводить измерение по 10-15 рачков после рождения (односуточных), после наступления половозрелости в течение суток и перед окончанием опыта. Измеряют длину рачков от переднего края головы до основания шипа.

По окончании опытов для каждого поколения подсчитывают средние значения выживаемости, плодовитости в пересчете на одну самку за 4 помета, количество патологических отклонений в процентах от реальной плодовитости, от размеров в разные сроки. Результаты опытов в растворах вещества сравнивают с контролем (водная среда без исследуемого вещества), достоверность отклонений результатов опыта от контроля определяют обычными методами вариационной статистики.

Достоверность получаемых результатов в хроническом опыте можно считать надежной, если соблюдены следующие условия:

а) гибель контрольных дафний на конец опыта не превышает 10% ;

б) 4 помета у контрольных рачков получены за срок не более суток;

в) количество молоди на 1 самку за 4 помета в контроле - не менее 35 штук;

г) время наступления половозрелости у контрольных рачков - не позднее 9 суток;

д) бихромата калия за 24 ч для дафний из контрольных растворов находятся в диапазоне 0,9-2,0 мг/л.

На основании результатов исследований с дафниями в остром и хроническом опыте делают вывод об уровне токсичности исследуемых веществ.

Определение концентраций, не обладающих хроническим токсическим действием, базируется на оценке трех показателей: выживаемости, плодовитости и размеров дафний. Критерием токсичности в опытах на поколениях рачков служит также наличие статистически достоверного различия трех показателей в опыте и в контроле.

При оценке влияния вещества на размножение особое внимание следует уделить эффекту стимуляции, когда количество молоди в опыте превышает количество в контроле. Опыты на серии трех поколений позволяют установить, насколько устойчив этот эффект в поколениях. Если численность молоди в опыте превышает численность в контроле не более чем на 50-70% и не сопровождается патологическими отклонениями в размножении, то стимуляция, как правило, в поколениях не закреплена. Стимулирующий эффект, превышающий 100%, всегда связан с патологическими отклонениями и в ряду поколений приводит к снижению плодовитости.

Число патологических отклонений при развитии у рачков из контрольных серий (чаще всего - абортивные яйца), не должно превышать 10% от величины реальной плодовитости на данный период времени. Появление абортивных яиц может быть связано с ухудшением некоторых условий культивирования: недостатком корма, освещенности, колебанием температуры и качеством воды.

Патологические отклонения, проявляющиеся при исследованиях токсичности вещества, могут указывать на характер действия испытываемого соединения:

а) если у рачков замедлены процессы созревания, снижена численность пометов и количество образованных яйцеклеток, то вещество обладает гонадотропным действием;

б) если у дафний опытной серии величина потенциальной плодовитости равна или превышает контроль, а реальная плодовитость значительно снижена за счет абортивных яиц, эмбрионов и мертворожденной уродливой молоди, то вещество обладает эмбриотропным действием;

в) если у дафний отмечено появление уродливой молоди, которая выживает в исследуемых растворах 3 и более суток, то предполагается наличие мутагенности и необходимо проведение специальных уточняющих экспериментов.

При установлении недействующих концентраций вещества на дафниях лимитирующими показателями, как правило, являются выживаемость и плодовитость. Направленное действие вещества только на размеры дафний наблюдается реже. Химические соединения могут тормозить рост на разных жизненных этапах:

а) если молодь рождается такая же, как в контрольных растворах, но к периоду наступления половозрелости размеры рачков уменьшены, то вещество тормозит рост дафний в ювенильный период;

б) если размеры дафнии достоверно уменьшены к концу опытов, то вещество подавляло рост дафний в период размножения;

в) если новорожденная молодь в 2 раза мельче, чем молодь контрольных рачков, то результаты указывают на наличие мутагенного эффекта.

4.1.5. Проведение исследований на модельных популяциях

4.1.5.1. Постановка исследований. Опыты по этой схеме проводятся в химических стаканах или аквариумах с объемом среды 1 . Остальные приемы сходны с описанными в предыдущей методике. Выметанную молодь после подсчета не удаляют (как в случае постановки опыта на серии генераций), а возвращают в экспериментальный стакан.

В стаканы вносится одинаковое количество одновозрастных рачков (по 8, 9 или 10 организмов). Подсчет удобно производить по трем возрастным группам дафний: молодь до начала созревания гонад (м1), молодь с гонадами, начавшими созревать (м2), и взрослые. Поскольку переход между группами регистрируется нечетко, удобно использовать вторичный половой признак - у м1 первый абдоминальный отросток неразвит или имеет малые размеры и расположен перпендикулярно спине абдомена, у м2 он начинает загибаться вперед.

Полный анализ с использованием шкал можно производить не на всех рачках, а отобрав по 15 экземпляров м1, м2 и взрослых, остальные подсчитывают только для учета соотношения их численности. Затем дафний взвешивают. Для этого следует сделать сито из планктонного газа и капроновой жилки (0,4 - 0,6 мм), используя в качестве шаблона дно химической пробирки соответствующей кривизны и сваривая все части с помощью нагретого железного предмета, например, пинцета с тонкими кончиками и т.п. Для взвешивания рачков из стакана для просмотра пипеткой переносят на сито. В сито для просмотра, помещенное в чашку Петри (где и удобно проводить просмотр), наливают немного воды из стакана, в котором они находились. Сито для взвешивания обсушивают на фильтровальной бумаге. Взвешивание производится на торсионных или аналогичных им других весах, после чего дафний немедленно переносят в новую экспериментальную среду. Взвешивают всех дафний из данной концентрации с точностью мг, поэтому вес более 10 рачков достаточно репрезентативен.

Опыт длится до начала снижения биомассы после достижения ее максимальной величины в контроле и при низких концентрациях вещества (подострый опыт) или до второго или третьего пика биомассы (хронический опыт).

4.1.5.2. Учет и анализ результатов. В течение первых двух часов наблюдение проводится регулярно: сначала каждую минуту, затем - через 5, далее - через 10 минут. Позже можно ограничиться просмотром через полчаса до конца первого рабочего дня. Со следующего дня просмотр проводится ежедневно.

Через сутки, через двое, на 5-е и 10-е сутки проводится полный анализ с просмотром под бинокуляром и описанием состояния каждой особи. Если имеются данные, что возможна задержка роста дафний, они должны регулярно измеряться под бинокуляром.

Дафнии подразделяются на следующие возрастные группы:

РИС. 1 К ПРИКАЗУ РОСРЫБОЛОВСТВА ОТ 04.08.2009 N 695

Отдельно должны учитываться все уродливые особи. Желательно пересадить их в чистую воду и проследить за их дальнейшей судьбой и за их потомством.

Как правило, наиболее чувствительным показателем является биомасса дафний в момент достижения максимальных значений в контроле и при минимальных концентрациях вещества в опыте. Если обнаруживаются нарушения в развитии партеногенетических или латентных яиц, ПДК вещества должна устанавливаться по этому показателю.

Об упитанности дафний и накоплении гемоглобина при снижении в воде содержания растворенного кислорода можно судить по цвету тела и количеству капель жира. Иногда у дафний появляется зеленовато-голубоватая окраска, особенно яиц и зародышей в выводковой сумке, расположенной между створками раковины на спинной стороне и абдоменом рачка. Обычно этот цвет приписывают каротиноидам, накапливаемым в заметных количествах.

Ниже приведены некоторые формы записи и интерпретации результатов опытов с дафниями (Таблицы 4.1.2. - 4.1.6 и Формы 3-5).

При внесении в таблицу в числителе записывают состояние яиц в гонадах, а в знаменателе - состояние яиц, зародышей в выводковой камере или в эфиппиуме на ней. Выделяют следующие градации степени повреждающего действия:

E1 - реакции дафний, не связанные с их повреждением;

Е2 - легкие повреждения, не связанные с опасностью для существования особи;

Е3 - повреждения средней тяжести;

Е4 - тяжелые повреждения;

Е5 - гибель рачков и предшествующие ей симптомы (иммобилизация, тетанические сокращения туловища, параличи и т.п.).

Таблица 4.1.2.

Шкала для оценки степени наполнения кишечника дафний

Содержимое кишечника	Балл
Отсутствует	к1
Заполняет меньше половины кишечника, часто не прилегает к его стенкам	к2
Заполняет от 1/2 до 3/4 кишечника, рыхло	к3
Заполняет больше 3/4 кишечника, но местами отстает от стенок или прозрачно в средней части кишечника	к4
Заполняет весь кишечник; если просвечивает, то только в его передней части	к5
Заполняет весь кишечник, но прозрачным еле видным содержимым	к2а
Заполняет весь кишечник, окрашено, но сильно просвечивает	к3а

Примечание: баллы к2а и к3а свидетельствуют о нарушении пищеварения, к1 и к2 - о голодании дафний, к3 - о плохом питании.

Таблица 4.1.3.

Сокращенная запись окраски содержимого кишечника

Окраска содержимого	Оливковая	Зеленая	Охристая ("песчаная")	Коричневая	Серая	Черная
Обозначение	О	З	Ох	К	С	Ч

Примечание: заполненность кишечника и окраску его содержимого удобно учитывать отдельно для передней (до перегиба при переходе из головного отдела в абдомен) и задней части.

Таблица 4.1.4.

Шкала градаций окраски тела дафний

Характеристика окраски тела дафний	Оценочный балл
Бесцветное, "стеклянное"	1
Желтоватое (полостная жидкость не видна, но ощущается плазма клеток)	2
Плазма клеток и кровь (полостная жидкость) имеют диффузно-розовое окрашивание:
бледное	3
умеренное	4
яркое	5
Мутно-желтое	2м
Мутно-розовое	3м - 5м

Примечание: балл 1м не приводится, поскольку он плохо выявляется визуально. Мутность (в первую очередь дыхательных отростков ног и туловища) обычно свидетельствует о коагуляции плазмы клеток.

Таблица 4.1.5.

Шкала развития партеногенетических и латентных яиц в гонадах дафний

Состояние гонады и проходящие в ней процессы	Оценочный балл
Развитие партеногенетических яиц
В зоне роста визуально не обнаруживается очередная партия яиц. Иногда здесь слабо видны прозрачные клетки эпителия зоны роста, но они расположены беспорядочно	1
В зоне роста расположены тетрады прозрачных яйцеклеток, содержащие капли жира (малый трофоплазматический рост)	2
Яйцеклетки становятся дымчатыми, промежутки между ними просвечивают (большой рост, накопление желтка)	3
Яйцеклетки темные, малопрозрачные в проходящем свете, промежутки между ними не видны (накопление желтка закончено, яйца готовы к поступлению в выводную камеру	4
Развитие латентных яиц
На границе зоны роста и зачатковой зоны гонады (над пятой парой брюшных ножек лежит группа клеток с более резкими границами, последняя тетрада преобразуется в латентную яйцеклетку с первичными питающими клетками)	1л
В группе клеток с более темными оболочками снизу прилегает темная треугольная полоска латентной яйцеклетки (начало накопления желтка)	2л
Первичные питающие клетки дымчатые, под ними - темная треугольная полоска латентной яйцеклетки (идет накопление желтка)	3л
Латентное яйцо сформировано, часто с небольшой перетяжкой посередине. Питающих клеток не видно	4л
Патология
Края клетки мутные, частицы желтка в клетках эпителия зоны роста. Идет резорбция яиц. Обычно заметно на стадиях 3 и 3л	Р

Таблица 4.1.6.

Шкала развития партеногенетических яиц в выводковой камере и эфиппиума. Норма и патология

Показатель состояния и происходящие процессы	Оценочный балл
Выводная камера пуста.
а) у впервые созревающих самок	0
б) у повторно созревающих	04
Развитие партеногенетических яиц (норма)
Яйца темные, непрозрачные, в начале стадии вытянутые, в конце ее округлые. Окончание образования направительных телец, слияние ядра одного из них с ядром яйцеклетки, образование первой яйцевой оболочки	1
Яйца становятся крупнее с более светлым периферическим слоем и грануляцией в середине яйца. Дробление, гаструляция	2
Стадия несформированного эмбриона. Начало становления зачатков (выступов) плавательных антенн, конец его, сформирование парного глаза	3
Стадия сформированного эмбриона. Начало стадии - слияние парного глаза и появление в нем черного пигмента, конец ее - полное сформирование молодой дафнии, которая начинает двигаться, сердце ее пульсирует. Каудальная игла иногда подогнута в момент вымета, иногда выпрямлена	4
Нарушение партеногенетического развития (патология)
Яйца мутные, непрозрачные, часто - набухшие. Их гибель и дегенерация	Д
Яйца теряют форму, разлагаются и в виде пенистой массы вытекают через заднюю щель выводковой камеры самки	S
Яйца развиваются, но не происходит яйцевой линьки (во время развития эмбрионов в норме наблюдается одна яйцевая и две эмбриональные линьки), поэтому зародыш развивается уродливо "в яйце". При сформированном глазе и уже пульсирующем сердце не видно никаких выступающих органов	мS

Форма 3

Выживаемость дафний в растворах вещества

Дата	Час	Срок опыта	Контроль			Концентрация С, мг/л
			Повторности 1-я, 2-я, 3-я			Повторности 1-я, 2-я, 3-я
			Номера стаканов			Номера стаканов
			1	2	3	1	2	3

Форма 4

Изменение биологических показателей у дафний под влиянием вещества

Дата

Срок опыта в сутках

Контроль

Концентрация С, мг/л

Исходное поколение, 1-е, 2-е, 3-е

Повторность, номера стаканов

Число

абортивные яйца

Число

абортивные яйца

дафний

карапаксов

Молоди

мертвых

Эфиппиумов

дафний

карапаксов

молоди

мертвых

эфиппиумов

Форма 5

Изменения биологических показателей у дафний в опытах на культурах

Показатели	Исходные особи		1-е поколение и т.д.
Показатели	Контроль	Концентрация, мг/л	Контроль	Концентрация, мг/л
Выживаемость, %
Срок наступления половозрелости, сут
Первый помет, сут
Реальная плодовитость
Число абортивных яиц
Число мертворожденных
Число уродливой молоди
Число эфиппиумов
Число карапаксоа#
Длина, мм
Ширина, мм

4.2. Цериодафния

4.2.1. Характеристика тест-объекта

Цериодафнии - рачки вида Ceriodaphnia affinis Lilljeborg (класс. Crustacea, отряд Cladocera, семейство Daphnidae) обитают в пресноводных водных объектах Европы, Северной Африки, Азии, Северной Америки. Этот вид относится к олиго- и бетамезосапробам и населяет водные объекты с замедленным течением - неглубокие озера, реки, водохранилища. Сведения о морфологии и физиологии рачков опубликованы ранее (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 06 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды". М.: 1991; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).

Цериодафния имеет более мелкие размеры, чем дафнии, половозрелые самки 1,5 мм, самцы - 0,8 мм, что позволяет в опытах манипулировать с меньшими объемами воды и более компактными емкостями. Биологический цикл развития от рождения до половозрелости у цериодафнии вдвое короче, чем у дафний, при оптимальных условиях развития. Так, при температуре 25°С созревание наступает на 2 - 3-й сутки от рождения, время первого помета - на 3 - 4-е сутки, а за срок 7-8 суток у рачков получают 3 помета.

При температуре 18°С сроки получения трех пометов у рачков могут растянуться до 28 суток. Численность молоди у рачков в первом помете невелика - по 2-6 особей, а начиная со второго помета - от 6 до 20 особей на самку. Этот вид цериодафний моно- или дицикличен. Максимум полового периода размножения приходится на август - сентябрь, самки образуют эфиппиум с одним яйцом. В лабораторных условиях самцы появляются при недостаточном освещении, снижении температуры, концентрации растворенного кислорода, голодании.

Цериодафния более чувствительна к кислородному фактору, чем дафния. Нормальное развитие цериодафний протекает при концентрации растворенного в воде кислорода не ниже 5 . Вследствие этого цериодафнии более чувствительны к органическому загрязнению и веществам, снижающим концентрацию растворенного кислорода в среде.

4.2.2. Условия лабораторного содержания

Требования к помещению, где содержат цериодафний, такие же, как и с дафниями. Не допустима обработка помещения химическими веществами с целью уничтожения насекомых и грызунов.

Для культивирования цериодафний используют дехлорированную, отстоянную воду, которая должна удовлетворять следующим требованиям:

а) рН 7,0 - 8,2;

б) общая жесткость - 1,3 - 2,0 ;

в) содержание растворенного кислорода - 7,0 - 8,0 .

В качестве корма для цериодафний используют хлореллу - зеленые протококковые водоросли (Chlorella vulgaris) и пекарские дрожжи. Процедура выращивания водорослей приведена в разделе с дафниями (п. 4 Приложения 2).

Для культивирования цериодафний удобны небольшие кристаллизаторы или стаканы емкостью 0,5 - 1 , плотность посадки рачков - из расчета не менее 20 объема среды на одну особь. С целью адаптации рачков к условиям новой лаборатории, их помещают в смешанную воду: 1 часть среды, в которой рачки жили ранее, и 3 части лабораторной воды. Кормление проводят ежедневно, водоросли вносят в концентрации 250 - 500 ; дрожжи дают не чаще одного раза в неделю, желательно перед сменой раствора в концентрации 1-2 1% раствора на 1 . Культуральная среда обновляется полностью один раз в неделю.

Культуру цериодафний выращивают в климатостате, люминостате или боксе при оптимальных условиях содержания: температура °С, освещенность - 400 - 600 лк, продолжительность светового дня - 10-12 ч.

При культивировании цериодафний удобно одновременно содержать рачков двух поколений - материнские размножающиеся особи и подрастающую молодь. Продолжительность использования маточных культур ограничивают 15-20 сутками. Отмечается каждое родившееся в лаборатории поколение и ставится дата рождения.

Для токсикологических исследований используют цериодафний, начиная с третьего поколения. Рачков в возрасте ч исследуют на устойчивость к стандартному токсиканту - бихромату калия в остром опыте, величина бихромата калия за 24 ч находится в интервале 1,0 - 2,2 .

В дальнейшем эксперименты с бихроматом калия ставят одновременно с постановкой основного острого опыта с каждым веществом.

4.2.3. Проведение исследований

4.2.3.1. Острый опыт. Предварительный острый опыт проводят с набором 3-5 концентраций веществ, различающихся в 10 раз: 100,0 - 0,001 . Длительность этого опыта 24 ч, он устанавливает порядок остролетальных концентраций веществ.

Основной острый опыт проводится исходя из результатов предварительного варианта с набором около 5 концентраций вещества. Выбирают диапазон концентраций вещества, которые вызывают иммобилизацию или гибель рачков в интервале 10 - 90%. Обычно эти концентрации отличаются от минимальной летальной в 2 раза. Продолжительность основного острого опыта - 48 ч.

4.2.3.2. Проведение эксперимента. В экспериментальные стеклянные стаканы емкостью 50 или пробирки наливают по 20 испытуемых растворов и сажают по 4 рачка в возрасте часа. При постановке острых опытов используют на каждую концентрацию не менее 20 рачков, распределяя их не менее чем на 4 повторности.

Условия проведения опытов: температура °С, световой день - 10-12 ч, разбавляющая контрольная вода должна отвечать всем требованиям, перечисленным выше. В ходе острых опытов рачков не кормят. Смену растворов проводят ежедневно.

В остром опыте показателем токсичности среды является выживаемость цериодафний. Наблюдения за выживаемостью ведут в том же режиме, что и в опытах с дафниями и полученные данные записывают в таблицу (п. 4.1.5 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). По результатам острых опытов рассчитывают величины за 48 ч, определяют действующие концентрации вещества по наличию статистически достоверного снижения величины выживаемости цериодафний в опыте по сравнению с контролем.

Достоверность получаемых результатов можно считать надежной, если удовлетворены следующие условия:

а) гибель контрольных цериодафний не превышает 10%;

б) бихромата калия за 24 ч для цериодафний в возрасте ч находится в интервале 1,0 - 2,2 ;

в) содержание растворенного в исследуемых растворах, определенное в конце опыта, не ниже 5,0 .

4.2.3.3 Хронический опыт. Хронические опыты на серии трех поколений с цериодафниями, так же как и с дафниями, служат для оценки действия малых концентраций токсиканта на выживаемость, плодовитость и качество потомства в поколениях.

Для хронических опытов подбирают 3-4 концентрации вещества, составляющие 0,5 - 0,001 от за 24 ч.

4.2.3.4. Проведение эксперимента. В опытные стаканы заливают по 40 испытуемых растворов и контрольной воды и помещают в них по 4 экземпляра одновозрастных цериодафний возрастом часа, повторность пятикратная. Рачков ежедневно кормят зелеными водорослями в концентрации 250-500 . Смену растворов проводят через сутки до начала размножения рачков и ежедневно в последующем. При смене растворов сохраняют соотношение 10 на 1 исходную цериодафнию, если рачки погибают количество раствора пропорционально уменьшают.

Продолжительность опытов с каждым поколением цериодафний определяется временем появления четырех пометов у контрольных рачков, что составляет около 10 суток, а общая продолжительность опытов на трех генерациях - от 20 до 25 суток.

Схема постановки опытов на поколениях цериодафний аналогична постановке опытов с дафниями.

В хроническом опыте ведут учет выживаемости и размножения цериодафний. При наблюдении за размножением учитывают время наступления половозрелости и первого помета, количество молоди в пометах и количество патологических отклонений (абортивные яйца и эмбрионы, уродливая и мертворожденная молодь).

Наблюдения в опытах ведут ежедневно, регистрируемые результаты заносят в таблицу по форме 1 и 2 (п. 4.1.4 Приложения 2).

По окончании опытов с каждым поколением цериодафний подсчитывают среднее значение по суткам выживаемости, плодовитости в пересчете на одну самку за 4 помета, процент патологических отклонений от величины реальной плодовитости. Результаты опытов сравнивают с контролем, достоверность отклонений определяется обычными методами вариационной статистики.

а) гибель в контроле на конец опыта не превышает 10%;

б) 4 помета в контроле получены за срок около 10 суток;

в) количество молоди на 1 самку за 4 помета в контроле не менее 20 штук;

г) время наступления половозрелости у цериодафний в контроле не превышает 5 суток;

д) бихромата калия за 24 ч для цериодафний из контрольных растворов находятся в интервале 1,0 - 2,2 мг/л.

5. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для бентосных организмов

5.1. Прудовик обыкновенный

5.1.1 Характеристика тест-объекта

Брюхоногие моллюски играют важную роль в круговороте органического вещества в водных экосистемах. Прудовик болотный (обыкновенный, большой) Limnea stagnalis является представителем эпибентоса. Широко распространен в прибрежной зоне стоячих или медленно текущих водных объектов.

Прудовиков отлавливают в летние месяцы на мелководьях эвтрофных водных объектов в зарослях высшей водной растительности.

5.1.2 Условия лабораторного содержания

Для содержания моллюсков и для проведения исследований необходимо следующее оборудование:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

бинокулярная лупа;

весы аналитические с разновесами;

весы технические;

термостат на 150°С;

муфельная печь на 450°С; кристаллизаторы на 2 л;

стаканы химические на 100 - 500 мл;

колбы мерные на 0,2 - 1 л;

цилиндры мерные на 50 - 1000 мл;

пипетки химические на 1 - 10 мл;

чашки Петри;

респирометры (банки по 0,5 л со стеклянными крышками);

склянки с притертыми пробками на 0,5 - 1 л для растворов;

сифоны с зажимами Мора;

пикнометры;

тигли;

ножницы, пинцеты, часовые стекла;

реактивы для определения кислорода методом Винклера.

Для исследований отбирают половозрелых моллюсков, активно передвигающихся и потребляющих корм. Кормят листьями одуванчика, капусты, салата, рдестом блестящим. Корм моллюскам дают в изобилии, что положительно сказывается на их росте и продуктивности. В каждый кристаллизатор помещают по 3 - 5 особей. После отбора проводят адаптацию к условиям лабораторного содержания в течение двух недель.

5.1.3 Проведение исследований

Для каждого опыта выбирают особей одного размера, веса и цвета раковины.

Острый опыт предназначен для определения диапазона концентраций хронического опыта. Проводится при 5-6 концентрациях в трех повторностях каждая. Концентрации различаются между собой на порядок. Продолжительность исследования - 3-5 суток. Моллюсков в опыте не кормят. В каждый кристаллизатор на 1,5 - 2,5 раствора помещают 3-5 моллюсков.

Учитывают влияние исследуемого вещества на выживаемость и поведение моллюсков.

Хронический опыт продолжается 45 - 60 суток. Исходной концентрацией для длительных исследований служит наибольшая безвредная концентрация, определенная в остром опыте. Число повторностей и плотность посадки такие же, как и в остром опыте. В течение опыта моллюсков подкармливают.

Состояние выборок учитывают ежедневно.

Для оценки влияния вещества на процессы размножения в аквариумы помещают по 2 - 3 взрослых прудовика. Ежедневно учитывают появление кладок, начало выклева и время появления молоди, которая содержится в аквариуме. Через 3-4 месяца всю молодь изымают из аквариумов и промеряют под микроскопом с помощью окуляр микрометра по высоте и ширине раковины. Мелкие особи держатся у уреза воды, быстро обсыхают и могут быть утеряны при подсчете численности. Необходимо регистрировать и погибших моллюсков, учитывая пустые раковины.

5.1.4 Учет и анализ результатов

В первые 8 ч ежечасно, а в последующие 3-е суток 2-3 раза в день, учитывают состояние моллюсков в опытных и контрольных сосудах. Регистрируют количество живых особей и их поведение (степень и характер передвижения, выдвижение ноги и ее реакцию на раздражение), интенсивность потребления корма, выделение слизи, определяемое по помутнению опытного раствора. В дальнейшем учет проводят один раз в сутки.

Особи, которые не реагируют на механическое раздражение и тело которых легко высвобождается из раковины, считаются погибшими.

Размножение и плодовитость оценивают по времени появления первых кладок, их числу и количеству яиц в каждой кладке. Потенциальную плодовитость определяют по числу яиц в кладках, полученных от каждого моллюска за период опыта, а реальную - по количеству выклюнувшейся молоди в абсолютных величинах и процентах к исходному числу яиц в кладках. Помимо этого можно контролировать процесс эмбриогенеза (время начала и конца прохождения каждой стадии, состояние эмбрионов) вплоть до выклева молоди. Особенности роста оценивают, определяя высоту и ширину раковины, отношение высоты к ширине. Водно-солевой обмен моллюсков оценивают, определяя сырую массу тела и раковины, массу полостной жидкости и воды в теле, сухой остаток и количество золы в мягких тканях. По разнице сухого остатка и сырой массы тела судят об изменении степени обводненности, а по количеству зольных элементов в теле и массе раковины - об изменении минерального обмена.

Высоту и ширину раковины измеряют штангенциркулем. За ее высоту принимают расстояние от вершины раковины до наиболее выступающего края устья, а за ширину -диаметр раковины в наиболее широкой части.

Для определения общей массы прудовика обыкновенного его обсушивают фильтровальной бумагой и, не надавливая на ногу (для сохранения в раковине полостной жидкости), переносят на технические весы и взвешивают.

При определении массы тела и раковины ножницами разрезают раковину по швам витков, освобождают тело, обсушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на аналитических весах (с точностью до 0,001 грамма). Тела особей каждой размерной группы фиксируют в бюксах в 96% этаноле. Осколки раковины взвешивают. Вычитая из общей массы массу тела и раковины, определяют количество полостной жидкости.

Для определения сухого остатка тела вес зафиксированных в спирте моллюсков доводят до постоянной величины при температуре 103-105°С. Количество сухого остатка рассчитывают на единицу сырой массы. По разности сырой и сухой массы определяют количество воды в теле прудовика и судят о степени обводненности или обезвоживания тела под воздействием химического вещества.

Сухой остаток тела прудовика (весь или его часть) переносят в тигли и сжигают в муфельной печи при температуре 450°С. Рассчитывают количество золы на единицу массы сухого остатка тела. По количеству золы судят об изменении минерального обмена.

Количество органического вещества рассчитывают по разности массы сухого остатка и золы. Эта величина, при сравнении с контрольными величинами, указывает на степень энергетических затрат организма при токсическом воздействии.

Для определения суточного рациона моллюсков находят разность между начальным количеством корма и его остатком. Задаваемую порцию корма взвешивают, а остаток изымают, обсушивают и вновь взвешивают. Для каждой размерной группы вычисляют кормовой коэффициент по формуле:

где Р - масса съеденного корма (г), - прирост массы моллюска (г).

Этот показатель позволяет судить об эффективности потребленного корма моллюсками при токсическом воздействии в опыте по сравнению с контролем.

Изучение энергетического обмена у прудовиков заключается в определении интенсивности потребления кислорода с применением метода Винклера (или с использованием чувствительного оксиметра).

Для этого в респирометры (банки на 0,5 с плотными крышками) заливают воду, помещают прудовиков, у которых предварительно определены масса и объем тела (по 3 особи), и закрывают крышками так, чтобы в банках не оставалось воздушных пузырьков. Банки с водой, но без моллюсков являются контрольными. Банки при стабильной температуре выдерживают 2 ч, после чего из них отбирают пробы воды в калиброванные пикнометры, в которых измеряют количество растворенного кислорода. Количество кислорода, потребленное прудовиками (в мг кислорода на 1 за 1 ч), определяют по формуле:

где - содержание кислорода, растворенного в воде респирометра без прудовиков, на 1 ; - содержание кислорода в воде респирометра с прудовиками; - объем респирометра в ; - общий объем тел моллюсков в мл; Р - общая масса тел прудовиков в мг; t - продолжительность экспозиции в часах.

При наличии оксиметра контроль содержания кислорода в воде можно производить непосредственно в респирометрах, не отбирая проб.

Полученные результаты по динамике роста молоди прудовика заносят в нижеследующую табличную форму 6.

Форма 6

Результаты учета динамики роста молоди прудовиков

Учитываемые параметры (по отношению к контролю)	Концентрация вещества	Размерные группы моллюсков, мм
Учитываемые параметры (по отношению к контролю)	Концентрация вещества	1,1-2,0	2,1-3,0	[...]	30,1-32,0	31,1-32,0	и т.д.
Общее количество
Ширина раковины в мм и в % к контролю
Общая масса 1 экземпляра в г и в % к контролю
Сырая масса 1 экземпляра в г и в % к контролю

По окончании экспериментов с прудовиком и обобщении полученных данных допустимыми следует считать такие концентрации вещества, которые:

а) не вызывают статистически достоверного отклонения выживаемости взрослых моллюсков и молоди от выживаемости в контроле в срок до 60 суток;

б) не вызывают достоверного угнетения размножения моллюсков за срок наблюдения;

в) не снижают интенсивность потребления кислорода более чем на 15% по сравнению с контролем; (то, что отмечено выше красным шрифтом)

г) изменяют водно-солевой обмен по сравнению с контролем не более чем на 10%.

5.2. Хирономиды

5.2.1 Характеристика тест-объекта

Из пресноводных бентосных организмов инфауны (зарывающихся в грунт) для проведения токсикологических опытов используются хирономиды. Хирономус дорзалис (Chironomus dorsalis Meig.) относится к широко распространенному семейству хирономид, личинки темно-красного цвета обитают в иле стоячих водных объектов, где строят в грунте трубчатые домики. Окукливание наступает чаще всего на 12-13-е сутки. Перед окукливанием личинки перестают питаться, теряют активность. Стадия куколки длится 2-3 суток. В конце этой стадии куколки из олигофотных становятся полифотными, покидают грунт и всплывают к поверхности воды, где происходит вылупление комаров из кукольной шкурки через ее разрыв на дорсальной стороне груди. Общая продолжительность жизни комаров 3-5 суток. В течение этого времени ни самцы, ни самки не питаются. После выклева из яиц личинки покидают кладку и плавают в воде, через несколько дней они оседают на грунт, переходя к донному образу жизни. Их дальнейшие рост и развитие определяются в основном условиями питания, дыхания, качеством грунта, температурным режимом, плотностью популяции и некоторыми другими факторами.

5.2.2 Условия лабораторного содержания

Хирономиды легко поддаются культивированию в искусственных условиях, и их личинки служат важным кормовым объектом.

При содержании мотыля в искусственных условиях создание и поддержание маточного роя комаров нужной численности осуществляется по той же методике, что и выращивание личинок. Разница состоит лишь в том, что их не отбирают на опыт, а дают им возможность закончить метаморфоз.

Устройство для выведения хирономид (хирономидник) представляет собой деревянный каркас, обтянутый марлей. Комната, где расположен хирономидник, должна быть достаточно светлой, высота хирономидника должна быть не менее 2,5-3 м. Поскольку взрослые комары не питаются, содержание маточного роя заключается в контроле за водным режимом в кюветах, в кормлении растущих личинок и в соблюдении чистоты воздуха (недопустимо наличие дыма, запаха нефтепродуктов, красок и т.п.).

Яйца, откладываемые комарами, собирают, и 20-30% их идет на воспроизводство маточного роя, остальная часть используется в качестве посадочного материала для токсикологических опытов. Яйцекладки можно вносить сразу на поверхность ила, однако лучшие результаты получают, используя их предварительное выдерживание в чистой воде до массового выклева личинок. Для постановки опытов выклюнувшуюся молодь выращивают в выростных кюветах до размеров 3-4 мм. В качестве корма используют сухие белковые дрожжи.

Для культивирования удобнее использовать фотографические кюветы высотой 2,5-3 см со сторонами размером 13x16 см. Кюветы размещают в несколько ярусов на деревянном или металлическом стеллаже в хирономиднике. Просвет между стенками кювет, расположенных на стеллаже по вертикали одна над другой, составляет 10-15 см, число ярусов - 7-15 см в зависимости от высоты хирономидника.

Наиболее целесообразно выращивание личинок на "тонком" речном иле, накапливающемся на участках с затишным течением. Желательно, чтобы слой ила был толщиной 12-15 мм. Хороший результат дает уменьшение водного слоя вплоть до его полного исчезновения. Лучше выращивать личинок во влажном грунте, периодически обрызгиваемом водой во избежание подсыхания. При поддержании комнатной температуры культивирование мотыля может идти круглогодично.

Личинок выращивают в кюветах, заполненных наполовину сметанообразной массой смеси ила с водой. Качество прудового или речного ила может быть улучшено его прогреванием до температуры 50-60°С, обуславливающим уничтожение организмов, которые могут оказаться хищными по отношению к разводимым личинкам (личинки жуков, стрекоз, другие виды хирономид).

После отстаивания грунтовой массы, налитой в кюветы (4-5 ч), вносят кладки, предварительно выдержанные в чистой воде до выхода первых личинок из слизи. На 1 м поверхности вносится примерно 100-150 кладок. Яйцекладки нужно распределять равномерно во избежание их заглубления в грунт. При температуре 18-20°С сухие белковые дрожжи в виде порошка двукратно распыляют по поверхности грунта из расчета 30-40 г/м. При температуре выше 18-20°С единовременное внесение большого количества корма может привести к интенсивному развитию гнилостных процессов с выделением метана и сероводорода. В связи с этим лучше вносить корм каждые 3-4 суток, причем вносимую порцию необходимо увеличивать соответственно росту личинок. Последнюю порцию корма вносят за 2-3 суток до отбора личинок.

Для получения яиц в маточном помещении устанавливают стеклянные кюветы или кристаллизаторы высотой 5-10 см и площадью 400-1600 и наливают в них чистую воду толщиной слоя 2-3 см. Ежедневно (лучше в середине дня, чтобы не мешать роению) выбирают яйцекладки пинцетом выше уреза воды, где они прикрепляются. Затем кристаллизаторы ополаскивают для удаления обрывков кладок и заполняют чистой водой. Один-два раза в месяц кюветы и кристаллизаторы рекомендуется протирать спиртом.

5.2.3 Проведение исследований

Эксперименты на хирономидах можно проводить в трех вариантах:

а) в чашках Петри или Коха с регулярной заменой среды;

б) в циркуляционных устройствах;

в) в проточных установках.

В опытах с осуществлением проточности установка представляет собой два расположенных один над другим сосуда, между которыми находятся чашка Петри с подопытными организмами (10 экземпляров в чашке).

Соответствующие концентрации токсичного вещества, введенные в верхний сосуд, по каплям проходят через чашки, стекая в нижний сосуд. Таким образом обеспечиваются проточность и аэрация.

Выбор концентраций определяется токсичностью того или иного вещества. Опытные растворы готовят на дехлорированной воде и меняют раз в двое суток. Нестойкие токсичные вещества необходимо менять каждый день. Объем 2 в проточной установке обеспечивает подачу опытной жидкости в течение 10-12 ч, после чего ее снова переливают в верхние сосуды. Температуру измеряют три раза в день.

Растертые в порошок и просеянные через сито N 27 белковые дрожжи замачивают в воде до получения густой массы, затем вносят в опытную чашку стеклянной палочкой. Масса, опущенная на конце стеклянной палочки, располагается под водой в опытной чашке в форме кружков диаметром 6-8 мм. Десяти маленьким личинкам в начале опыта хватает 3-4 кружков. По мере роста личинок количество корма, вносимого в опытные чашки, увеличивают.

С начала окукливания кормление сводится к минимуму, а к моменту вылета имаго совсем прекращается. Дрожжи используются хирономидами и как строительный материал для домиков. Разведенные дрожжи на протяжении всего опыта хранят в холодном месте.

Острые опыты проводят без добавления грунта в течение 10-15 суток. Длительность хронических опытов от III стадии личинки (длиной 3-4 мм) до вылета имаго составляет около 30 суток.

Вначале отбирают одну из кладок хирономид (в ней до 200 яиц) в кристаллизатор с водой. После вылупления личинок их подращивают на иле до определенного размера (3-4 мм) и затем сифоном со стеклянной трубочкой осторожно отбирают по 10 экземпляров на опытную чашку. В течение двух суток они обживают опытные площади (чашки), строят домики из дрожжей, вносимых заранее. Слабых особей заменяют новыми из той же одновозрастной популяции. К концу вторых суток личинки подрастают до 3-й стадии (4-5 мм). Перед опытом воду из опытной чашки отсасывают сифоном вместе с остатками корма и заменяют раствором определенной концентрации. Опытную жидкость следует менять по возможности быстро, чтобы куколки и личинки не обсыхали. После очистки опытную чашку наполняют на 2/3 жидкостью и только затем вносят корм. Каждая концентрация испытывается в трех повторностях.

5.2.4 Учет и анализ результатов

При проведении токсикологических опытов регистрируются следующие показатели:

основные:

а) выживаемость личинок;

б) сроки их окукливания;

в) сроки и процент вылетевших комаров;

г) процент уродливых особей.

дополнительные:

а) окраска личинок;

б) их поведенческие реакции;

в) вес;

г) активность имаго.

Среди погибших имаго встречаются насекомые, которые не смогли высвободиться из экзувия или при выходе из него повредили конечности или крылья. Часто встречаются имаго с уродствами, обусловленными действием токсических веществ, в частности кровоизлиянием в области брюшка, крыльев или общим кровоизлиянием. Такие экземпляры с трудом высвобождаются из экзувия. При выходе они еще больше раздуваются, происходит выпячивание отдельных участков тела между хитиновыми пластинками в области брюшка с последующим их разрывом.

У некоторых особей под действием токсичных веществ кишечник выпадает наружу. Вес личинок регистрируется на 7-е и 10-е сутки опыта.

Наблюдения за организмами ведутся ежедневно. Дрожжевые домики вскоре становятся непроницаемыми, и наблюдения ведутся в основном за пораженными особями, которые обычно остаются в домиках. Особое внимание обращают на форму домиков, поведение организмов, окраску тела, стадию, готовность к линьке и окукливанию, наполнение кишечника. Погибших особей измеряют и рассматривают под бинокуляром.

Размеры живых зрелых куколок и имаго в опыте и контроле можно оценивать визуально. Здоровые особи, как правило, не покидают домиков даже на небольшой срок. Сравнивают линейные размеры погибших особей с их первоначальной длиной и имеющимися в литературе нормативами роста для хирономид.

Для оценки острого летального действия можно использовать два способа:

а) определение концентраций, вызывающих гибель за определенный срок 50% особей, взятых в опыт;

б) определение медианного летального времени для ряда концентраций, а по форме кривой - границы между остролетальными и хронически летальными концентрациями.

В течение длительных опытов учитывают и основные, и дополнительные показатели, указанные выше. Выживаемость всех стадий выражают в процентах с поправкой по Абботу. Личинок взвешивают на торзионных весах на 7-е и 10-е сутки опыта. Удельный прирост биомассы определяют по формуле:

где: и - вес в начале и в конце опыта соответственно.

Личинок после взвешивания в опыте не используют из-за травмирования, а эксперименты продолжаются с особями двух других линий той же популяции.

Регистрируют сроки вылета насекомых (в сутках) и проводят статистическую обработку данных.

По окончании опыта все полученные данные сводят в таблицу согласно форме 7.

Форма 7

Оценка токсического действия вещества на хирономид (среднее 00 из трех повторностей)

Концентрация (мг/л)	Число личинок в варианте	Мертвые особи (экземпляры)			Выживаемость с поправкой по Абботу (%)	Сутки вылета М+-m	Критерий достоверности (t)
Концентрация (мг/л)	Число личинок в варианте	личинки	куколки	имаго	Выживаемость с поправкой по Абботу (%)	Сутки вылета М+-m	Критерий достоверности (t)
Контроль
C_1
C_2
С_3
и т.д.

Примечание: С - концентрация вещества

6. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для рыб

Рыбы (наряду с водными млекопитающими) находятся в области конечного звена трофической цепи водных экосистем и включают две трофические группы - мирных и хищных видов рыб, из которых хищники занимают высшее звено по сравнению с мирными.

Определение ПДК веществ на ранних стадиях эмбриогенеза и на взрослых рыбах важно с двух точек зрения - установления опасности вещества для существования популяции рыб в водном объекте и угрозы здоровью человека при употреблении их в пищу.

Эти особенности рыб учитываются при выборе тест-объектов, установлении параметров и критериев токсичности, кумулятивных свойств, патологических изменений и отдаленных последствий действия исследуемых веществ.

Для определения наиболее чувствительных (уязвимых) звеньев среди разных групп рыб, параметры токсичности следует определять на наиболее чувствительных к веществу видах и возрастных группах, кумулятивные эффекты и поиск наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей - на средне- и малочувствительных.

Выделяют три группы рыб, обладающих разной чувствительностью по отношению к большому числу токсических веществ.

а) высокочувствительные - все виды лососевых, а также голец, судак, плотва, пескарь, верховка;

б) среднечувствительные - голавль (возраст 1+), гольян, лещ, окунь, красноперка;

в) малочувствительные - голавль (возраст 2+ и старше), карп, карась.

Целесообразно использовать виды рыб, широко распространенные в местных водных объектах и хорошо переносящие содержание в лабораторных условиях.

6.1. Эмбрионы и личинки рыб

6.1.1. Вводные замечания

Контролируются эмбриональное развитие рыб в исследуемой воде, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Из литературных источников и из опыта нормирования известно, что эмбрионы рыб и предличинки более чувствительны к токсическому воздействию по сравнению со взрослыми особями.

В настоящих Методических указаниях описан порядок работы с аквариумной рыбкой данио рерио, но наряду с этим видом могут быть использованы вьюн, осетр, форель и др.

6.1.2. Характеристика тест-объекта

В качестве тест-объекта для определения ПДК вещества по эмбриональному развитию удобно использовать икромечущую аквариумную рыбу данио Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), поскольку материал для исследования можно получать в течение всего года, независимо от периодичности работы рыбоводных заводов. В природе данио обитает в медленно текущих водных объектах Юго-Восточной Азии. Длина взрослых рыб до 4,5 см. Тело цилиндрической формы, серебристое с 7-9 темно-синими горизонтальными полосами. Полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина окрашена в оливково-зеленый цвет.

6.1.3. Условия лабораторного содержания

Для содержания рыб-производителей могут быть использованы аквариумы объемом от 25 , заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22°С. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, отмытый трубочник).

Для получения икры самок и самцов отделяют друг от друга и кормят живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. В конце второй недели самцы приобретают густой золотистый блеск, а брюшко самок значительно увеличивается в объеме за счет икры. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливают и помещают в нерестовый аквариум.

Нерестовый аквариум наполняют свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27°С и рН 6,8-6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.

В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2-3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света.

Обычно выклев у данио завершается через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.

6.1.4. Проведение исследований

Для определения ПДК вещества на эмбрионах и личинках рыб ведут наблюдение за эмбриональным развитием данио и выклевом предличинок в контроле и исследуемых концентрациях веществ. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри. В каждую чашку с отстоянной водой (контроль) и с исследуемыми растворами помещают по 10 икринок. Концентрации исследуемого вещества готовят с шагом либо на порядок, либо в арифметической прогрессии, ориентируясь на максимальные допустимые концентрации вещества, полученные в опытах на других организмах. Исследование каждой концентрации проводится в трехкратной повторности.

Выклюнувшиеся предличинки помещаются по 10 штук в контрольную и тестируемую воду. Наблюдение ведется, как и в первом случае, в чашках Петри, которые должны находиться в термостатируемых условиях. Длительность эксперимента определяется переходом личинок на активное питание.

6.1.5. Учет и анализ результатов

Основными показателями токсичности вещества являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры, тератологический анализ. В качестве дополнительных показателей эмбриотоксикологической оценки влияния исследуемых, веществ могут служить биохимические исследования (например, липидный и белковый обмен у эмбрионов и предличинок рыб).

В опытах через каждые 6 ч учитывают состояние тест-объекта и ход выклева. Учитывается оплодотворение икры, а также гибель и морфологические изменения у эмбрионов в процентах по отношению к контролю.

Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся, которые остаются прозрачными.

Становятся белыми также и погибшие эмбрионы вследствие коагулирования белка. Гибель эмбрионов бывает наибольшей в начале и в конце эмбрионального периода.

Выклев - наиболее чувствительный и важный этап, завершающий эмбриональное развитие у рыб. Эмбрионы, достигшие стадии выклева, в результате действия токсичного агента часто оказываются неспособными выйти из оболочек и погибают. Важным показателем является распределение выклева на весь период эмбрионального развития. Если под влиянием токсикантов нарушается эмбриональное развитие, то максимум выклева смещается по сравнению с контролем или растягивается во времени.

Морфометрические исследования лучше всего проводить на выклюнувшихся предличинках. У эмбрионов вредные воздействия веществ могут вызывать морфологические изменения, которые, служат в качестве интегрального показателя эффекта действия вещества. Появление уродств свидетельствует о тератогенном действии. Уродливые эмбрионы, погибшие во время эмбрионального развития, включаются в число погибшей икры, а средний процент уродств подсчитывается после выклева и прохождения стадий предличинки.

Личинки, которые способны нормально плавать и переходят на активное питание, считаются выжившими. Нормальными считаются особи, не имеющие морфологических отклонений и не отличающиеся размерами от контрольных.

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для ранних стадий онтогенеза рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок, увеличения числа особей с дефектами развития или отставания личинок в размерах и темпах развития.

6.2. Мальки и взрослые рыбы

6.2.1. Характеристика тест-объекта

В экспериментах используются мальки, сеголетки, годовики отдельных видов рыб с разной чувствительностью (п. 6 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). При отсутствии достаточного количества промысловых рыб и условий их содержания, целесообразно проводить опыты на "сорных" рыбах с высокой и средней чувствительностью к токсическим веществам, например верховках и пескарях, а также использовать аквариумных рыбок, например данио. Выбор других рыб в качестве тест-организмов должен быть обоснован литературными и экспериментальными данными.

6.2.2. Условия лабораторного содержания

Для исследований подбирают некрупных одноразмерных рыб в хорошем физиологическом состоянии из водных объектов Рыб транспортируют на специально оборудованном транспорте с регулируемой подачей кислорода. При длительных перевозках необходим постоянный контроль за кислородным режимом и температурой воды, так как при резких перепадах гидрохимических показателей возможна значительная гибель перевозимой рыбы. При кратковременных перевозках можно использовать молочные бидоны или полиэтиленовые мешки, не допуская травмирования рыбы и резкого снижения содержания кислорода в воде.

В аквариальных условиях привезенную рыбу рассаживают в специально оборудованные проточные лотки, ванны или бассейны. Вода в данных емкостях должна быть одинаковой температуры с температурой воды в перевозимых емкостях.

При содержании рыб необходимо поддерживать оптимальный водообмен в емкостях из расчета 1-1,5 воды в сутки на 1 кг лососевых рыб и 0,5-1 на 1 кг карповых рыб. Если нет условий для осуществления постоянного протока воды, необходимо проводить смену ее в емкостях с рыбой, исходя из содержания кислорода в воде. Для лососевых рыб содержание растворенного кислорода в воде должно быть не ниже 9,5-10,5 , а для карповых - не менее 6-8 .

После помещения рыб в емкости, в течение 10 дней (при постепенной адаптации рыб к аквариальным условиям) проводят контроль за температурой и кислородом в емкостях, проводя измерения два раза в день. Для обогащения воды кислородом рекомендуется применять принудительную аэрацию, а для повышения до необходимого уровня температуры - аквариумные водонагреватели с датчиками.

Для кормления рыб используют пастообразные, гранулированные или живые корма из расчета от 0,8 до 5% к весу тела рыб. Емкости, используемые для содержания рыб, необходимо ежедневно очищать от скапливающихся остатков корма и фекальных масс.

Помещение аквариальной должно быть оборудовано стеллажами с аквариумами или ваннами.

Из другого оборудования необходимо иметь:

холодильные установки для хранения корма и реактивов;

весы аналитические с разновесами;

весы аптекарские (чашечные и ручные);

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

лупу;

электромешалку;

вентиляторы;

ведра эмалированные;

бидоны;

тазы и кюветы разных размеров;

фотоаппарат;

сачки разноячейные;

покрытия из мелкоячейной сети, газа или дели для емкостей с рыбой;

микрокомпрессоры;

аквариумные водонагреватели с датчиками;

скальпели, пинцеты, ножницы, шприцы на 1 - 20 мл, инъекционные иглы;

секундомер, линейки;

набор инструментов и реактивов для исследования крови;

стеклянную посуду емкостью от 0,1 до 3 л, мерные пипетки, глазные пипетки, бюретки, мерные стаканы, колбы, чашки Петри, стеклянные трубки и палочки;

резиновые шланги разного диаметра и длины, резиновые груши;

полиэтиленовую пленку, клеенку, марлю, халаты, резиновые фартуки, сапоги и перчатки;

карандаши по стеклу, лейкопластырь, фиксирующие и дезинфицирующие жидкости;

журналы для записей и прочие необходимые материалы и инструменты.

6.2.3. Проведение исследований

Перед началом экспериментов рыб помещают в аквариумы или другие экспериментальные емкости на 7-10 суток с целью адаптации к новым условиям. Опыты проводят на двух-трех видах рыб из различных семейств (желательно хищных и мирных) и выявляют рыб с высокой чувствительностью к токсиканту путем определения , и в острых опытах длительностью 96 ч. Хронические опыты начинают с концентрации, равной 1/2 за 96 ч, и создают токсикологический ряд из 5-10 убывающих концентраций вещества с множителем 1/2. Длительность хронических опытов составляет 1-3 месяца. В зависимости от стабильности исследуемого вещества в воде.

Эксперименты проводят в стеклянных аквариумах или пластмассовых ваннах емкостью 20-40 в двукратной повторности с использованием 6-10 особей в каждой концентрации вещества. Два аквариума служат контролем.

Норма посадки молоди, сеголеток и годовиков лососевых и сиговых рыб в экспериментальные емкости для проведения опытов должна быть не более 1 г ихтиомассы на 1 воды в сутки. Для рыб возрастом более года, а также для карповых рыб, эта величина составляет не более 3 г на 1 воды в сутки.

Взвешивание рыб производят перед началом опытов, затем через каждые 10-15 суток до их окончания. Для этого на весы ставят сосуд емкостью 2-2,5 , в который наливают 0,5-1 воды и уравновешивают его с помощью гирь или другого сосуда с водой. Затем отловленных сачком рыб быстро помещают в сосуд с водой для взвешивания, предварительно осушив низ сачка от избытка влаги марлей. Мальков взвешивают с помощью химических стаканов на аптекарских или других более точных весах.

Для опытов используется незагрязненная вода из природных водных объектов или водопроводная дехлорированная вода, отстоянная в течение трех суток. Ежедневно измеряется температура воды, и один раз в 10 суток проводятся гидрохимические исследования за содержанием растворенного в воде кислорода и рН.

В зависимости от стабильности исследуемого вещества смену воды в опытных емкостях проводят один раз в 1-3-е суток, спустя 1,5-2 ч после кормления рыб. При этом недопустимо травмирование рыб. Аэрация воды возможна лишь в тех случаях, когда состав и концентрация исследуемого вещества не изменяются. Толщина слоя воды в аквариуме для сеголеток и годовиков должна быть не менее 20 см, для более крупных рыб ее следует увеличивать.

В аквариумах должна постоянно поддерживаться оптимальная для исследуемого вида температура воды.

При кормлении необходимо учитывать видовые и возрастные особенности питания рыб. Используют рыбные комбикорма, говяжью и свиную селезенку в смеси с комбикормами, а также живые корма - дафнии, хирономиды, гаммарусы и др.

Схема и динамика проведения опытов, учет регистрируемых показателей ведется в лабораторном журнале.

Опыты по определению параметров острой и хронической токсичности веществ, по установлению коэффициентов кумуляции ставят на мальках или сеголетках. После этого ставят острые и хронические опыты на сеголетках или двухлетках для определения их токсичности по физиолого-биохимическим показателям, используя среднесмертельные, максимально переносимые и более низкие концентрации для установления пороговых.

6.2.4. Учет и анализ результатов

6.2.4.1. Выживаемость рыб определяется путем систематического учета живых и погибших рыб на протяжении всего опыта (в острых опытах через 24, 48 и 96 ч, в хронических - через 5, 10 и далее через каждые 10 суток опыта). Полученные данные обобщают и выражают в абсолютных и процентных величинах. Устанавливают границы выживания рыб в зависимости от концентрации вещества и времени его воздействия на организм. Находят переносимую концентрацию вещества, которая не вызывает гибели рыб.

6.2.4.2. Прирост или снижение ихтиомассы устанавливают на основе данных периодического взвешивания рыб в хроническом опыте (каждые 10 суток). Этот показатель выражают в процентах от начальной массы или индивидуально.

6.2.4.3. Клиническую картину (симптомы отравления) оценивают по изменению поведения рыб в водной среде и реакции на внешние раздражители путем периодического осмотра их в опыте. Изменение поведения и местонахождения рыб в воде может свидетельствовать о поражении многих систем организма.

С повышением токсичности вещества чаще наблюдается тенденция к подъему рыб в поверхностные слои при наличии возбуждения или общего угнетения, дискоординации движений, расстройств дыхания и других патологических признаков. Незадолго до гибели большая часть рыб опускается на дно.

При отравлениях реакции рыб на внешние раздражители могут усиливаться, ослабевать или полностью исчезать. В качестве раздражителей при проведении токсикологических исследований можно использовать стук по стенкам аквариума, включение и выключение света, всплеск воды в аквариуме, прикосновение сачком или стеклянной палочкой к телу рыб, искусственно создаваемый ток жидкости путем слива или слабого вращения воды при помощи лопаточки и другие приспособления.

Несмотря на некоторые различия в развитии процесса отравления рыб ядами, как правило, наблюдают следующие стадии интоксикации - начало беспокойства (учащение дыхательного ритма, беспокойное дыхание, отставление плавников), первые признаки расстройства чувствительности (судорожное дыхание, поднятие лучей плавников, неполное закрытие рта), усиление раздражимости (стремительное плавание или неподвижность, сильная реакция на внешние раздражители или полное ее отсутствие), первое расстройство координации движений (кратковременное опрокидывание на бок или на спину, кружение вокруг продольной оси тела, толчкообразные движения), полная потеря равновесия (стабильное изменение положения тела, плавание на боку, вверх брюшком по кругу и штопорообразно, дрожание мышц и плавников, судороги тела), агония (опускание на дно аквариума, удушье, паралич). Все эти признаки регистрируют через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах. Выявляют концентрацию вещества, при которой не проявляются внешние признаки интоксикации.

На основании сачковой пробы оценивают резервную силу, организма рыб по времени трепетания на сачке. Отловленных взрослых рыб из растворов с разными концентрациями вещества помещают на плоскодонный сачок и регистрируют время прекращения трепетания, оценивают характер и силу движений. Полученные данные сравнивают с результатами, полученными на рыбах из контрольных аквариумов, а в естественных условиях - из незагрязненных водных объектов или контрольных участков. При острых, подострых и хронических токсикозах всегда отмечается резкое сокращение времени трепетания рыб. Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической обработке и по графической зависимости времени трепетания от концентрации вещества устанавливают пороговую и недействующую концентрации.

6.2.4.4. Характер питания зависит от вида рыб и от особенности поедания корма. Хищные рыбы (радужная форель, лосось и др.) активно набрасываются на корм, стараясь поймать его на лету у поверхности воды. Мирные рыбы (карп, сазан) корм берут спокойно, заглатывая его в толще воды или собирая на дне аквариума. При отравлениях эти реакции угнетаются или полностью подавляются. При явных признаках интоксикации рыбы полностью отказываются от корма. В конце экспериментов устанавливается концентрация раствора, при которой не происходит нарушения рефлекса питания.

6.2.4.5. Характер и частота дыхания. Наблюдения ведутся через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах путем оценки силы, частоты и ритма дыхательных движений жаберных крышек с помощью секундомера по отношению к контролю в течение 1-10 минут. Нормальное дыхание у рыб характеризуется спокойными, ритмичными, умеренной силы (амплитуда) и частоты колебательными движениями жаберных крышек. Норма устанавливается в каждом конкретном случае на здоровых рыбах. При отравлениях можно наблюдать различные расстройства дыхания, в том числе резкое учащение колебательных движений жаберных крышек, беспорядочное дрожание жабр с последующей остановкой дыхания, периодическое прекращение и возобновление учащенных или замедленных дыхательных движений с увеличенной или уменьшенной амплитудой колебательных движений жаберных крышек.

6.2.4.6. Внешний вид (состояние кожных покровов, плавников, органов зрения). Хорошее состояние рыб характеризуется энергичностью, округлостью спины, упругостью мышц, полным упругим животом с наличием полостного жира во внутренних органах при нормальном состоянии печени. Истощенные рыбы характеризуются как вялые, пассивные, с опавшей и заостренной спиной, запавшими глазами, подтянутым животом, мягкой мускулатурой, истонченной брюшной стенкой и отсутствием полостного жира на внутренних органах. Состояние отдельных органов и систем организма оценивают в конце опыта и у погибших рыб в течение эксперимента общими методами исследования (вскрытие, осмотр, определение запаха, измерение, фотографирование и зарисовки). Используют также разнообразные специальные методы исследования (микроскопия, электрокардиография, рентгенография, запись дыхания и др.). При отравлениях могут быть обнаружены самые разнообразные изменения в органах и тканях рыб, которые в совокупности характеризуют особенности течения того или иного токсикологического процесса.

На коже часто обнаруживают изменения слизистого покрова, покраснения (гиперемия), кровоизлияния, новообразования (опухоли), рубцы, эрозии, язвы, ерошение и выпадение чешуи, появление налетов и выделение слизи. Аналогичные изменения возникают на плавниках, которые иногда деформируются и разрушаются вплоть до оголения лучей. Мускулатура рыб при отравлениях может стать дряблой, водянистой, тургор ослабляется, при надавливании пальцем обнаруживается медленно выправляющаяся вмятина. Нередко наблюдаются парезы, параличи, уплотнение или расслабление отдельных групп мышц головы, туловища и хвостового стебля с соответствующими искривлениями тела. Глаза больных рыб застланы пеленой, тусклые, помутневшие, с бледным рисунком. Иногда обнаруживаются пучеглазие, кровенаполнение сосудов, кровоизлияние в переднюю, заднюю камеры и ткани глаз.

6.2.4.7. Состояние жаберного аппарата. Осмотр производится при жизни и после гибели рыб под водой и в воздушной среде. Рыб отлавливают, заворачивают в марлевую салфетку, отводят пальцем жаберную крышку в сторону и осматривают жабры визуально или с помощью лупы. Осмотр жабр под водой производится путем погружения рыбы на глубину 3-5 см, при этом многие патологические изменения гораздо лучше заметны, чем при осмотре в воздушной среде. В норме жабры полнокровные, ярко-красного цвета, чистые, жаберные лепестки ровные, лежат параллельно, соприкасаясь друг с другом, свободный край их образует ровный полукруг относительно жаберной дужки. При отравлениях рыб жабры приобретают различные оттенки - темно-вишневый, красный, бледно-красный, бледный желтовато-розовый, темно-бурый, сероватый и др. Жаберные лепестки набухают и лежат беспорядочно.

6.2.4.8. Патологоанатомическое вскрытие рыб проводится при гибели и обязательно после окончания опыта. Перед вскрытием рыб измеряют, взвешивают, фотографируют, изготавливают препараты. После вскрытия определяют цвет, запах, консистенцию, местоположение, деформацию, кровенаполнение, дегенерацию органов и тканей, а также наличие или отсутствие жировых отложений (по балльной системе). Отбирают материал для гистологических исследований при , и предполагаемой пороговой концентрации.

6.2.4.9. Гистологические и гистохимические свидетельства поражения органов и тканей рыб могут наблюдаться и в отсутствие клинических симптомов интоксикации. Для исследований берут только свежий материал - от живых или находящихся в состоянии агонии рыб, либо от только что погибших особей. В хронических опытах фиксацию органов подопытных рыб следует производить в конце опытов. Для изучения воздействия токсических веществ гистологическому и гистохимическому исследованию подвергают жабры, печень, почки, желудочно-кишечный тракт, половые продукты, селезенку, поджелудочную и щитовидную железы, головной мозг, сердце, мышцы туловища, кожные покровы. Для сравнения обязательно фиксируют и исследуют органы и ткани контрольных рыб. После вскрытия рыбы материал немедленно фиксируется во избежание обезвоживания и деформации поверхностных слоев клеток. Толщина кусочков органов для фиксации должна быть не более 1 см, чтобы фиксирующая жидкость легко и быстро проникала в ткань. Сроки фиксации для разных фиксаторов различны, как правило, они тем короче, чем выше температура фиксатора. При использовании большинства фиксаторов наилучшие результаты дает длительная фиксация (3-5 минут) при температуре от 1 до 18°С. Объем фиксирующей жидкости должен в 15-20 раз превышать объем фиксируемых кусочков. Мелкие органы фиксируются целиком, из крупных вырезают пластинки с таким расчетом, чтобы на гистологических препаратах были как нормальные, так и изменившиеся части органа. Во избежание разрушения внутренние органы рыхлой консистенции, особенно мелких рыб, фиксируют вместе с близлежащими тканями. Хорошими фиксаторами служат жидкость Буэна, 5-10%-й нейтральный формалин, смесь спирта, формалина и уксусной кислоты, жидкость Карнуа. При оценке изменений описывают общую микроскопическую картину и данные гистохимических исследований (на гликоген, жир и др.).

Морфологические изменения у рыб при воздействии токсических веществ не всегда являются строго специфическими для каждого яда, чаще всего по ним можно определить, к какой группе относится ядовитое вещество. Гистохимические реакции и электрономикроскопические исследования более чувствительны и позволяют точнее определить пороговую концентрацию.

6.2.4.10. Гематологические и биохимические показатели широко используются в ихтиопатологии, ветеринарии, медицине, в токсикогигиенических исследованиях. Они углубляют представление о динамике интоксикации организма гораздо раньше, чем появляются внешние признаки отравления рыб. Определяют следующие показатели: количество эритроцитов и лейкоцитов, эритроцитарные картины и морфология форменных элементов крови, размеры клеток крови, общий белок, активность пероксидазы (каталазы) или холинэстеразы.

Для взятия крови рыбу завертывают в марлевую салфетку. Место, откуда предполагают взятие крови, освобождают от слизи и избытка влаги ватно-марлевым тампоном. Пробы крови получают из жаберной вены путем введения тонко оттянутой пастеровской пипетки в жаберный сосуд нижней трети жаберной дужки, а также из сердца с помощью полой иглы или пастеровской пипетки. Место укола в сердце лежит в середине линии, соединяющей основание правого и левого грудных плавников. Иглу вводят в сердце под углом 45° относительно фронтальной плоскости тела рыб. Кровь можно также отобрать из хвостовой артерии после отрезания хвоста или с помощью полой иглы или пастеровской пипетки, погружая их на медиальной линии позади анального плавника под углом 45° до упора в позвоночник рыбы. Взятая кровь быстро свертывается, поэтому необходимо в возможно более короткий срок (40-50 секунд) взять максимальное количество проб на определение различных гематологических и биохимических показателей.

В качестве антикоагулянта применяют гепарин или лимоннокислый натрий в виде порошка или 3,8% раствора, которым ополаскивают пробирки, или добавляют 1/4 часть раствора к объему крови. Для определения общего белка антикоагулянт не добавляют, а оставляют пробирки с кровью в теплом месте для отделения плазмы и получения сыворотки.

Отбор проб крови и анализ проводят в следующей последовательности:

а) берут кровь от рыб;

б) приготавливают мазок крови;

в) заряжают меланжер для количественного подсчета форменных элементов крови или отбирают пробы крови в пробирку с раствором хлористого натрия для определения количества эритроцитов фотоколориметрическим методом на эритрогемометре;

г) заряжают гемометр Сали для определения содержания гемоглобина крови или отбирают пробы крови для определения этого показателя на эритрогемометре;

д) определяют содержание гемоглобина в крови по методу Сали или на эритрогемометре;

е) подсчитывают число эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева или на эритрогемометре;

ж) фиксируют и окрашивают взятые мазки крови;

з) подсчитывают количество лейкоцитов и определяют эритроцитарные картины; - определяют общий белок сыворотки крови методом Лоури;

и) исследуют пероксидазную активность по методу Попова и Нейковска.

Приемы и методы гематологических анализов описаны в соответствующих руководствах (Кудрявцев А.А., Кудрявцев Л.А., Привольнов Т.И. Гематология животных и рыб. М.: Колос, 1969; Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. М.: Медгиз, 1953).

Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической обработке и в соответствии с изменениями исследуемых показателей от концентраций вещества устанавливают пороговую и недействующую концентрации ( и ) в хроническом эксперименте.

6.2.4.11. Органолептические свойства и вкусовые качества бульона и мяса рыб. После вскрытия и обследования по показателям, приведенным выше, рыб обмывают чистой питьевой водой, помещают в стаканы или колбы, заливают чистой питьевой водой в соотношении 5 частей воды на 1 часть рыбы и без добавления соли варят в течение 5-10 мин на слабом огне. После охлаждения до комнатной температуры у сваренных контрольных и опытных рыб вырезают кусочки спинных мышц весом 0,2-0,5 г (в зависимости от веса рыбы). Кусочки мяса помещают в рыбный бульон, разлитый по нумерованным чашкам Петри. Порядок нумерации чашек Петри с контрольными и подопытными рыбами оглашается дегустаторам только после окончания дегустации. Для проведения дегустации приглашается 3-5 человек. Испытатели отмечают цвет бульона, присутствие или отсутствие постороннего запаха, а затем цвет и присутствие или отсутствие постороннего запаха мяса рыб.

После этого определяют вкусовые качества мяса рыб и наличие постороннего привкуса. В норме вкус мяса рыб сладковатый. После дегустации образец продукта выбрасывают в банку, полость рта ополаскивают питьевой водой. Результаты дегустации испытатель вносит, не оглашая, в таблицу по форме 8.

Форма 8

Запись результатов органолептических исследований

Номер пробы	Органолептические свойства бульона		Органолептические свойства и вкусовые качества мяса рыб
Номер пробы	Цвет	Запах	Цвет	Запах	Вкус
	Изменен или нет	Наличие или отсутствие постороннего запаха	Изменен или нет	Наличие или отсутствие постороннего запаха	Наличие или отсутствие постороннего вкуса

Обобщая дегустационные таблицы, испытатель делает заключение о наибольшей концентрации вещества, которая, по данным большинства дегустаторов, не вызывает изменений органолептических свойств бульона и мяса, вкусовых качеств мяса рыб.

6.2.4.12. Кумулятивные свойства (материальная и функциональная кумуляции) химических веществ на рыбах определяются по нижеописанной схеме в соответствии с Методическими указаниями по разработке предельно допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных водоемов. (Минрыбхоз СССР введены в действие от 19 января 1979 г. N 08-3/178 "Методическими указаниями по разработке предельно допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных водоемов". Ростов-на-Дону, 1979)

а. Оценка накопления вещества в рыбах (материальная кумуляция вещества) проводится минимум при двух концентрациях. Опыты ставят по методике проведения хронического эксперимента длительностью не менее 30 суток (или используют для анализа рыб из проводимого хронического эксперимента). В течение этого периода через каждые 5 суток (5, 10, 20, 25, 30-е) отбирают особей для оценки содержания вещества в органах и тканях опытных и контрольных рыб, которые до окончания эксперимента можно хранить в холодильнике. Из 6 отобранных проб эффект накопления можно предварительно оценить в пробе, отобранной на 30-е сутки. Если при этом концентрация вещества в рыбе превышает концентрацию в исследуемой воде, проводится анализ всех проб, если не превышает - аналитическое исследование остальных проб можно не проводить.

Для количественной оценки материальной кумуляции используют коэффициент накопления (), который представляет собой отношение максимального содержания вещества в организме рыб (мг/кг) к его концентрации в воде (мг/л).

В зависимости от величины коэффициента материального накопления () вещество по классификации К.К. Врочинского (Таблица 6.2.1.) относят к соответствующей группе с коэффициентом запаса ().

Таблица 6.2.1.

Классификация веществ по степени накопления их в организмах

Группа	Степень накопления вещества	Коэффициент накопления (К_н)	Коэффициент запаса (Кз_н)
1	Слабая	50	1
2	Умеренная	51-200	2
3	Высокая	201 -1000	4
4	Сверхвысокая	>1000	16

б. Оценка функциональной кумуляции вещества проводится для характеристики возможного перехода материальной кумуляции вещества в токсический эффект в хроническом эксперименте (накопление токсического эффекта при воздействии вещества на организм).

Для оценки функциональной кумуляции вещества, после расчета параметров острой и хронической токсичности по каждому биологическому объекту (икра, личинки, молодь, взрослые рыбы), рассчитывают характеристику опасности развивающегося токсического эффекта по отношению вероятностных смертельных концентраций. Наиболее полно отмечаемое явление характеризуется фактором угла наклона "доза - эффект" (S):

Оценка кумулятивного действия вещества проводится по коэффициенту функциональной кумуляции (), который определяется отношением острой среднелетальной концентрации, умноженной на фактор утла "доза - эффект", к хронической среднелетальной концентрации, умноженной на свой фактор:

Таблица 6.2.2.

Оценка веществ по коэффициенту функциональной кумуляции ()

Степень кумуляции	Коэффициент кумуляции остр остр хр хр К = ЛК х S /ЛК х S кум 50 50	Коэффициент запаса (Кз_кум)
Слабая	1-50	1
Умеренная	51-200	5
Выраженная	201 -1000	10
Высокая	1000	20

В зависимости от величины коэффициента функциональной кумуляции вещество относят к одной из четырех групп (Таблица 6.2.2.), каждой из которых соответствует определенный коэффициент запаса ().

Кумулятивные коэффициенты запаса по степени накопления вещества в организмах () и по степени накопления токсического эффекта () используются при расчете ПДК для пестицидов (п. 3.1.4. Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям). Коэффициент материальной кумуляции () используется при установлении класса опасности вещества (п. 1.1 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям).

6.2.4.13. Токсикологическая оценка исследованного вещества. При токсикологической оценке вещества в качестве обязательных используются наиболее общие показатели и признаки отравления рыб. По ним устанавливают максимальные допустимые концентрации испытуемого вещества, то есть концентрации, которые в хроническом опыте не вызывают никаких отклонений исследуемых показателей от контроля. Максимальные допустимые концентрации, установленные по каждому обязательному показателю, вносят в сводную таблицу по форме 9.

Форма 9

Сводная таблица допустимых концентраций для рыб

Организмы (вид, возраст)	Показатели и длительность опыта	Максимальные допустимые концентрации (мг/л)
	Выживаемость
	Прирост ихтиомассы
	Поведение
	Реакции на внешние раздражители
	Поедание корма
	Характер и частота дыхания
	Внешний вид
	Состояние наружных покровов
	Состояние жаберного аппарата
	Патологоанатомическое вскрытие
	Состояние внутренних органов
	Гематологические и биохимические показатели
	Органолептические свойства и вкусовые качества бульона и мяса рыб
	Функциональная и материальная кумуляция

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для взрослых рыб принимается наименьшая концентрация из допустимых, установленных по каждому обязательному показателю.

7. Оценка генотоксичности вещества

7.1. Вводные замечания

Генотоксичность вещества исследуется на генном, хромосомном или геномном уровне. По этим данным устанавливается его максимальная допустимая концентрация для рыбохозяйственных водных объектов по показателю "генотоксичность".

Для выявления мутаций на генном уровне рекомендуется тест Эймса.

Для выявления хромосомных аберраций в хроническом опыте проводят следующие исследования генетического аппарата на клетках различных тканей рыб:

а) учет частоты хромосомных аберраций и нарушений митотического аппарата деления клеток эпителия хрусталика на стадии анафазы и телофазы;

б) учет частоты хромосомных аберраций на стадии метафазы на жаберном эпителии;

в) учет частоты образования микроядер (микроядерный тест) в эритроцитах.

Оценка генотоксичности вещества по нарушению дифференциальной активности генов может проводиться на политенных хромосомах из слюнных желез хирономид.

В обязательную программу генетических исследований должно входить изучение генных мутаций и хромосомных аберраций одним из методов. Вы их выделили жирным шрифтом. При подозрении, что вещество воздействует на митотическую активность клеток и обладает канцерогенностью, необходимо провести дополнительно исследования по выявлению воздействия вещества на дифференциальную активность генов.

Исследуемые концентрации вещества в эксперименте должны укладываться в диапазон от пороговой концентрации (или ниже) до концентрации выше значения ПДК вещества в 5 раз.

7.2. Учет генных мутаций (тест Эймса)

7.2.1. Характеристика тест-объекта

Наиболее удобными, быстрыми и экономичными способами выявления мутагенной активности являются методы с использованием бактерий. Широкое применение находит тест-система с использованием бактерии сальмонелла тифимуриум (Salmonella typhimurium) (Таблица 7.2.1.). Эти методы основаны на аналогичности генетических механизмов повреждения и репарации ДНК у клеток низших и высших организмов.

Таблица 7.2.1.

Штаммы S. typhimurium, используемые для выявления мутагенной активности соединений

Штаммы	Основная мутация в опероне	Дополнительные мутации	Наличие фактора	Выявленный тип мутагенного эффекта
ТА 1950 ТА 1535 ТА 100	his G 46	+ urvB	-	R-BPS
	his G 46	rfa urvB	-	R-BPS
	his G 46	rfa urvB	pKM-101	R-BPS
ТА 1534 ТА 1538 ТА 98	his D 3052	+urvB	-	R-FS
	his D 3052	rfa urvB	-	R-FS
	his D 3052	rfa urvB	pKM-101	R-FS
ТА 97	his D 6610	rfa urvB	pKM-101	R-FS
ТА 102	his G 428	rfa+(PAO 1)	pKM-101	R-BPS
А 1537	his С 3076	rfa urvB	-	RPS

Примечание: "+" - обозначение генов дикого типа; rfa - нарушение липополисахаридной капсулы; urvB - нарушение системы эксцизионной реакции; RPS - сдвиг рамки считывания; R-BPS - замена пар оснований.

Сущность использования системы "бактерии-микросомы" заключается в определении способности вещества или его метаболитов индуцировать генные мутации у подопытных штаммов. Если исследуемое вещество (или его метаболиты) обладают мутагенной активностью, то увеличивается количество колоний - ревертантов на чашку Петри в опыте по сравнению с контролем. Под влиянием мутагенных веществ у микроорганизмов - ревертантов происходят обратные мутации, и они приобретают способность жить на среде, лишенной гистидина или другой аминокислоты, по которой отобран тот или другой штамм.

Для выявления промутагенов производят микросомальную активацию, после которой промутагены проявляют мутагенные свойства. Методы приготовления микросомальных ферментов из гепатопан-креаса карпа или других рыб приводятся ниже.

При определении мутагенной активности веществ, нормируемых для воды рыбохозяйственных водных объектов, целесообразно использовать микросомы именно из тканей рыб, а не теплокровных животных, так как экстраполяция результатов, полученных с применением микросом печени теплокровных животных, не всегда оправдана при установлении ПДК веществ вследствие неадекватности протекания метаболических процессов у различных видов животных.

7.2.2. Проведение исследований

7.2.2.1. Оборудование:

бактерицидные облучатели;

центрифуги;

автоклавы;

термостаты;

размельчитель тканей;

водяные термостатирующие бани;

счетчик колоний;

весы;

сушильный шкаф;

дистиллятор.

Реактивы:

, лимоннокислый натрий, NADP (Rianal);

, , биотин;

КCI, , L-гистидин;

, БСА, нитрозогуанидин;

, глюкозо-6-фосфат, ДМСО.

Мутагены:	Промутагены:
бенз/а/пирен,	2-ацетиламинофлуоредин,
9-аминоакридин,	2-аминофлуорен.
Циклофосфамид;

7.2.2.2. Приготовление минимальной среды (МС). МС готовят следующим образом. К 300 мл расплавленного агара (компонент 2) добавляют 100 мл солевого раствора (компонент 1), 10 мл 20%-ного раствора глюкозы и 2,0 мл раствора :

1. Компонент 1 (солевой раствор):

лимоннокислый натрий - 2,0 г,

- 42,0 г,

- 18,0 г,

- 4,0 г,

(дист.) - 1,0 .

2. Компонент 2 (водный агар):

агар -20,0 г; - 1,0 л.

3. 20%-ный раствор глюкозы.

4. 1%-ный раствор .

5. Агар для верхнего слоя:

NaCI - 6,0 г,

Агар - 7,0 г,

- 1,0 .

Компоненты 1, 2, 4 и 5 автоклавируют при 0,8 атм 30 мин. Затем на каждые 80 мл агара добавляют 10 мл L-гистидина (0,5 мм) и биотина (0,25 мМ) в виде стерильных растворов. В качестве полноценной среды (ПС) может использоваться любая среда для энтеробактерий (МПБ и МПА, или АП и АПА). Она стерилизуются в автоклаве при 0,5 атм 30 мин (после стерилизации рН=7,0).

7.2.2.3. Проверка генетических маркеров. Получают отдельные клоны соответствующих штаммов. Готовят три варианта селективных сред:

а) МС с добавкой L-гистидина;

б) МС с добавкой биотина;

в) МС с добавкой L-гистидина и биотина.

Растворы аминокислоты и биотина вносят в МС из расчета 50 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно. Отбирают по 25 отдельных колоний и пересеивают на селективные среды, чашки Петри инкубируют при 37°С двое суток. По характеру роста колоний делают вывод о способности того или иного штамма расти на среде, лишенной гистидина.

7.2.2.4. Хранение индикаторных штаммов. Суспензии штаммов рекомендуется хранить в диметилсульфоксиде (ДМСО) или глицерине при замораживании (-70°С), а также в слое 0,6% МПА под стерильным вазелиновым маслом. Периодически при пересевах штаммы проверяют на соответствие генотипу.

7.2.2.5. Приготовление фракций. Фракцию микросомных ферментов получают по следующей схеме:

1. Индуцируют синтез микросомальных ферментов в гепатопанкреасе карпа и белого толстолобика ежедневными внутрибрюшинными инъекциями метилхоланна из расчета 80 мг/кг веса в течение трех дней.

2. Извлекают из животных гепатопанкреас, взвешивают, промывают стерильным раствором 0,15 М KCI, измельчают и гомогенизируют в трехкратном объеме 0,15 М KCI. Среда гомогенизации гепатопанкреаса рыб дополнительно содержит 0,6% Na-фосфатный буфер с рН 7,4. Все операции проводят на льду.

3. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 9000 об/мин и аликвот ("фракция Sg") разливают в пластмассовые емкости объемом 3-6 мл.

Фракцию хранят до момента использования не более двух недель (при температуре -80°С).

7.2.2.6. Приготовление микросомальной активирующей системы. Фракцию Sg размораживают при комнатной температуре и ставят на лед. В эксперименте используют микросомальную активирующую среду, в 1,0 мл которой содержится фракция Sg, 5 мМ глюкозо-6-фосфат, 4 мМ NAPR, 33 мМ KCI, 8 мМ MgCI в 0,1 М К-фосфатном буфере в рН 7,4.

Приготовление исследуемых веществ: Готовят стандартные растворы в дистиллированной воде или в растворе ДМСО (0,1; 1,0; 10,0; 100,0; 1000,0 мкг на чашку Петри).

7.2.2.7. Приготовление бактериальной суспензии. В экспериментах используют чистую культуру. Для этого культуру штамма с косяка пересевают в 10 мл АП и инкубируют без аэрации 18 ч при 37°С. Затем 19 мл АПБ необходимо засеять 1 мл культуры и инкубировать ее при 37°С на качалке в течение 2-3 ч до плотности кл/мл. Культуру центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Осадок ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы получить суспензию плотностью кл/мл.

7.2.3. Проведение исследований

Чашки Петри заливают минимальной средой и выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Полужидкий полуобогащенный агар расплавляют и помещают в термостатируемую водяную баню (46°С) на 20 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,1 мл культуры тест-штамма, 0,2 мл раствора исследуемого вещества определенной концентрации и 0,5 мл микросомальной реактивирующей системы. Полученную смесь сразу же перемешивают и выливают на поверхность чашки. Верхний агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара тонким слоем. Вся процедура в целом занимает не более 20 секунд. Затем дают агару застыть и инкубируют при 37°С двое суток. Через два дня отмечают колонии гистидиновых ревертантов. Чтобы выяснить, нуждается ли исследуемое вещество в предварительной активации, имеет смысл проводить исследования как в присутствии, так и в отсутствии микросомальной активирующей системы, содержащей фракцию Sg.

Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие:

а) только культуру бактерий и растворитель;

б) культуру бактерий, растворитель и микросомальную активирующую систему, содержащую фракцию Sg;

в) культуру бактерий с добавлением мутагенов и промутагенов, указанных выше (п. 7.2.2.1., Реактивы):

для штамма ТА 100 - цилофосфамида - 500 мкг на чашку;

для штамма ТА 98 - бенз-а-пирена -10 мкг, 9-аминоакридина - 10 мкг на чашку.

В качестве промутагенов для штаммов ТА 98 и ТА 100 используются 2-ацетиламинофлуоредин и 2-аминофлуорен соответственно.

Степень мутагенного эффекта определяют по кратности превышения числа колоний реверантов при данной дозе над таковым в контроле. При сравнении числа колонии на опытных и контрольных чашках могут быть получены следующие результаты, представленные в таблице 7.2.2.

Таблица 7.2.2.

Учет мутагенности

Отношение числа колоний в опыте и в контроле	Характеристика мутагенности	Обозначение
Менее 2,5	Отсутствие мутагенности	-
Менее 10	Слабая мутагенность	+
10-100	Средняя мутагенность	++
100 и более	Сильная мутагенность	+++

Методы статистической обработки полученных результатов приведены в приложении 4 данных Методических указаний.

7.3. Выявление хромосомных мутаций

7.3.1 Определение хромосомных аберраций в эпителии хрусталика глаза рыб

7.3.1.1. Характеристика тест-объекта. Исследования проводятся на видах рыб, у которых нет резкого падения митотической активности в осенне-зимний период. Для исследований подходят сеголетки и годовики обыкновенного окуня и радужной форели. Можно использовать другие виды рыб, не прекращающие активно питаться в естественных водных объектах зимой. Для морских рыб получены первые результаты исследований на покатниках семги, а также на морской камбале.

7.3.1.2. Лабораторное оборудование и материалы:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

микроскальпель;

препаровальная игла с трехгранным сечением;

препаровальная игла с тонким изогнутым концом типа "кочерги";

обычная препаровальная игла;

пинцет с тонкоотточенными и изогнутыми концами;

глазные ножницы;

гистологическая проводка от дистиллированной воды до ксилола, с присутствием дополнительных стаканчиков с 30% и 50% этиловым спиртом;

банка с притертой пробкой для фиксации препаратов глаз;

обезвоженный медный купорос;

этиловый спирт;

ледяная уксусная кислота;

краситель - гемалаун Майера либо другой краситель (для ядер и хромосом, в зависимости от поставленной задачи).

7.3.1.3. Проведение исследований

а. Без предварительной травматизации хрусталика глаза. Рыбы выдерживаются в исследуемых концентрациях токсиканта. Возможно проведение подострых и хронических опытов. После экспозиции в растворах вещества рыб забивают декапитацией. У них извлекают глаза, которые помещают в фиксатор из смеси абсолютного этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Глаза могут помещаться в марлевый мешочек с этикеткой на дно банки с фиксатором. Банку на 1/4 заполняют обезвоженным медным купоросом. Продолжительность фиксации 24 ч. После фиксации глаза рыб обрабатываются поочередно.

Глаза из фиксатора перемещают в дистиллированную воду на 20 минут. По мере обводнения они опускаются на дно стакана с водой. После положенного срока поочередно каждый глаз помещают на ладонь вниз роговицей и вверх отверстием зрительного нерва. Глазными ножницами срезают дно глаза так, чтобы в образовавшееся отверстие мог пройти хрусталик. Хрусталик при этом становится видимым, но повернут к препаратору задним полюсом. В задний полюс вводят иглу с трехгранным сечением до упора в ядро хрусталика. Хрусталик изымается из глаза.

Дальнейшие операции сводятся к снятию передней капсулы хрусталика с эпителием и к получению плоскостного препарата из снятой с хрусталика полусферы. Сразу же после изъятия хрусталика из глаза трехгранной иглой, которая не дает возможности ему вращаться по оси, хрусталик перемещают в каплю дистиллированной воды. В этой капле микроскальпелем по экватору хрусталика делают надрез, и переднюю капсулу с эпителием помещают с волоконной частью глазной линзы в воду. Наряду с капсулой на предметном стекле в капле воды могут оказаться фрагменты волокон хрусталика, частицы сетчатки и радужной оболочки.

Необходимо подготовить другое предметное стекло с каплей воды, в которую микропинцетом или обычной препаровальной иглой переносят капсулу хрусталика с эпителием.

Далее микроскальпелем наносятся насечки от периферии к центру полусферы капсулы хрусталика. Обычно бывает достаточно 5-6 глубоких насечек, чтобы полусферическую переднюю капсулу хрусталика можно было бы уложить в одной плоскости на предметном стекле. Отдельные части капсулы расправляют препаровальной иглой и "микрокочергой". Одновременно удаляют оставшиеся на эпителии волокна хрусталика. После первого расправления вода частично отсасывается фильтровальной бумагой.

Отдельные лепестки капсулы после насечек должны подворачиваться внутрь. Это гарантирует то, что эпителий хрусталика оказывается между стеклом и капсулой. В этом случае плоскостной препарат приклеивается к предметному стеклу при частичном подсушивании.

Дальнейшие операции сводятся к подсушиванию фильтровальной бумагой плоскостного препарата эпителия хрусталика и к частичному выправлению капсулы, она присушивается к стеклу, но не доводится до полного высыхания. Побелевшую, но еще влажную капсулу закрывают каплей красителя (при использовании красителя гемалаун Майера процесс окрашивания длится 5-8 мин). При окраске гемалаун Майера препарат помещают в водопроводную воду, отмывают от красителя и проявляют там до подсинения.

После окраски препарата на предметном стекле его проводят через спирты, доводят до ксилола и заключают в канадский бальзам или в другую синтетическую среду.

Подсчет хромосомных аберраций проводят по методике, описанной на стадиях ана-телофазы в клетках эпителия как для всего хрусталика, так и для отдельных зон цитодифференцировки эпителия: центральной, герминативной и предэкваториальной. Высокая митотическая активность в герминативной и предэкваториальной зонах позволяет более полно выявить хромосомные мутации по сравнению с исследованием на других тканях.

б) Исследование с предварительной травматизацией хрусталика. Рыбы после экспозиции в растворах токсикантов за двое суток до приготовления препаратов эпителия хрусталика подвергаются травматизации уколом. Укол наносят тонкой энтомологической иглой в передний полюс хрусталика на 1/5 его диаметра. В первые сутки травматизацией гасятся спонтанные митозы в эпителии хрусталика, а затем появляются синхронизированные посттравматические митозы, полоса которых повторяет конфигурацию травмы. Таким образом, хромосомные аберрации на стадии ана-телофазы подсчитываются в посттравматических, синхронизированных митозах. Приемы подготовки препаратов эпителия хрусталика не отличаются от вышеописанных.

7.3.2 Определение частоты хромосомных аберраций в клетках жаберного эпителия рыб

Исследования проводят с аквариумной рыбой нотобранхиус (Nothobranchius rachovi) Метод позволяет учитывать частоту структурных нарушений хромосом на стадии метафазы и предполагает более полную оценку аберраций в качественном и количественном отношениях.

7.3.2.1. Характеристика тест-объекта. Нотобранхиус (Nothobranchius rachovi) имеет размер 3 - 4 см, имеет сравнительно небольшое количество хромосом (16), у которой в тканях отмечается высокая митотическая активность. Рыба легко воспроизводится и достаточно неприхотлива при содержании.

7.3.2.2. Лабораторное оборудование и материалы:

холодильник для хранения фиксированного материала;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз с фотонасадкой;

мерная посуда для приготовления растворов;

флаконы (по 10 мл) для хранения фиксированного материала;

вегетационные сосуды для рыб;

предметные стекла;

препаровальные иглы;

пинцеты;

скальпель;

шприцы и иглы для инъекций;

краситель Гимза;

фиксатор (спирт/96%-ная ледяная уксусная кислота 3:1);

колхицин (0,4%);

гипотонический раствор KCI (0,4%);

уксусная кислота (60%).

7.3.2.3. Проведение исследований

Для учета средней частоты структурных перестроек хромосом используются клетки жаберного эпителия, богатые митозами.

Рыбе инъецируют внутримышечно 0,4% раствор колхицина и, умертвив ее через 5-6 часов, отделяют жабры, которые выдерживают в течение 20 минут в 0,4% растворе KCI, фиксируют в этанол-уксусной смеси (3:1) и мацерируют ткань в 60%-ной уксусной кислоте. Клеточную суспензию наносят на предметные стекла, высушивают, окрашивают раствором Гимза.

Для анализа выбираются метафазные пластинки с явно выраженными хромосомами, располагающимися в одной плоскости без наложений.

Для каждой рыбы анализируют до 40 метафаз. Независимо от числа аберраций в одной клетке, они засчитываются как одно нарушение.

Учитывают следующие виды нарушений:

а) структурные хромосомные аномалии, включающие хромосомные и хроматидные разрывы, фрагменты, дицентрики, кольцевые хромосомы, ацентрические фрагменты;

б) анеуплоидные клетки;

в) полиплоидные клетки.

Подсчитывают на одну особь количество нормальных метафаз и клеток с аберрациями хромосом, рассчитывают процент нарушений (N) по следующей формуле:

Вычисляют среднее арифметическое из N для каждой группы рыб.

7.4. Учет частоты образования микроядер в эритроцитах рыб

Метод позволяет учитывать в цитоплазме эритроцитов рыб частоту образования микроядер, которые представляют собой фрагменты ядерного материала, элимининирующиеся из ядра клетки при аберрациях митотических хромосом.

7.4.1. Проведение исследований

7.4.1.1. Оборудование и материалы:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз с фотокамерой;

мерная посуда для приготовления растворов;

предметные стекла;

вегетационные сосуды для рыб;

краситель Гимза;

этиловый спирт (96%) для фиксации.

7.4.1.2. Подготовка мазков крови

Для приготовления мазков кровь берут из хвостовой вены. Мазки фиксируют в чистом этаноле, высушивают, окрашивают 10%-ным раствором красителя Гимза и просматривают под микроскопом.

7.4.1.3. Учет и анализ результатов

Анализу подлежат мазки, где клетки располагаются равномерно, образуя монослой без наложений и повреждений цитоплазмы. Учитываются только целые эритроциты.

Для определения частоты встречаемости клеток с одним или двумя микроядрами анализируют 1000 эритроцитов на особь на 1 предметное стекло. Перед подсчетом стекла можно шифровать.

7.5. Микроядерный тест на эпителии гуппи

7.5.1. Характеристика тест-объекта

С целью выявления тест-реакции на индукцию микроядер можно использовать покровный эпителий гуппи.

Применение метода обосновано тем, что во время деления клеток ацентрические фрагменты хромосом и отставшие хромосомы не входят в дочерние ядра, а формируют в цитоплазме одно и реже два ДНК-содержащих образования, получивших название микроядра. Микроядра представляют собой округлые образования в цитоплазме, имеющие темную окраску, сходную с окраской ядер исследуемых клеток. Размеры микроядер изменяются от 1/5 до 1/20 размера ядра.

7.5.2. Оборудование и материалы

аквариумы емкостью 5 л;

микрокомпрессоры;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

чашки Петри;

покровные и предметные стекла, пипетки объемом 1-5 мл;

препаровальные иглы;

микроскальпели;

глазные пинцеты;

счетчик для подсчета форменных элементов крови.

7.5.3. Проведение исследований

Для выявления микроядер используют те же методики, что и для выявления хромосомных аберраций (п. 7.3.1 Раздела 7). В препаратах определяют количество клеток с микроядрами на 1 тыс. подсчитанных клеток и выражают их число в процентах.

При этом учитывают на временно окрашенных препаратах появление микроядер в клетках эпителия в опыте и контроле.

7.5.4. Учет и анализ результатов

Критерием генотоксичности вещества является статистически достоверное увеличение числа клеток, содержащих микроядра в опытных препаратах по сравнению с контролем.

7.6. Определение генотоксичности вещества по действию на дифференциальную активность генов

7.6.1. Характеристика тест-объекта

Исследования проводятся на политенных хромосомах в слюнных железах предкуколки хирономид. В качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид - хирономус тами и хирономус плумозус (Chironomus thummi и Ch. Plumosus). При исследовании вещества в соленой воде в качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид (Chironomus sp.) из азовских лиманов, адаптированная к солености 20. В результате проведения работы выявляется действие веществ на структуру интерфазных хромосом и на дифференциальную активность проявления пуффинга в процессе метаморфоза личинки в куколку.

7.6.2. Оборудование и материалы

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

тонкий пинцет;

препаровальные иглы;

предметные и покровные стекла;

кисточка;

фильтровальная бумага;

краситель ацетоарсеин (0,5% арсеина в 45%-ной уксусной кислоте);

среда для заливки (краситель, разведенный в соотношении 1:3 45%-ной уксусной кислотой);

7.6.3. Проведение исследований

Определение генотоксичности химических соединений и их действия на дифференциальную активность генов проводят на предкуколке, развитие которой наблюдается с 36-го по 38-й день при температуре 20-25°С. Стадия предкуколки характеризуется набуханием грудных сегментов, укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек. Метаморфоз проходит в 6-й, 7-й, 8-й и 9-й фазах развития. Изменение цвета тела с красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза.

Для синхронизации развития и отбора хирономид в эксперименте заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе четвертого возраста, перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Отбирают личинок, у которых красный цвет головы меняется на темно-коричневый, и затем ждут момента набухания грудных сегментов и укорачивания тела. Препараты политенных хромосом из слюнных желез получают следующим образом. Личинку помещают на фильтровальную бумагу для обсушивания, затем переносят на предметное стекло, тонко отточенным пинцетом берут за мандибулы и тянут, отрывая голову. Вместе с головой из тела вытягивается кишечник, по бокам которого видны слюнные железы, прикрепленные к голове протоками. Препаровальными иглами слюнные железы отделяют от остальных тканей и окрашивают их в течение 10-15 мин ацетоорсеином. После окрашивания слюнные железы изымают из красителя и помещают на чистое предметное стекло. На покровное стекло наносится капля среды для заливки. Покровное стекло переворачивают так, чтобы капля покрыла слюнные железы. На покровное стекло помещают кусочек фильтровальной бумаги и большим пальцем, без сдвигов в стороны, клетки слюнных желез раздавливают. Среда для заливки, выступившая из-под покровного стекла, впитывается в фильтровальную бумагу. Затем бумагу удаляют, а края покровного стекла смазывают бесцветным лаком. Благодаря лаку, препарат предохраняют от высыхания.

7.6.4. Учет и анализ результатов

Генотоксичность вещества оценивается по нарушению структуры политенных хромосом (возможны разрывы, распад концов и дезинтеграция) и по нарушению пуфинга во время метаморфоза. Отмечается следующее образование пуфов в норме. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается в размерах на 7-й и 8-й фазах развития. На второй хромосоме 2Азв постепенно сужается, а пуф 2Азе увеличивается на каждой последующей фазе. На 8-й фазе появляются 2 пуфа 2Д2де и пуф 2Г2. На третьей хромосоме на 6-й и 7-й фазах имеется пуф 3Дih, а после 7-й фазы появляется пуф 3Дif, который отмечается до конца метаморфоза. На четвертой хромосоме видны тельца Бальбиани, которые резко увеличиваются на 8-й фазе. Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро исчезающий пуф 4Дс.

При действии некоторых токсикантов у личинок насекомых, имеющих политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов.

8. Определение требований к оценке временных нормативов вещества для пресноводных водных объектов

8.1. Расчетный метод оценки ОБУВ органических пестицидов

Для вычисления величин ОБУВ пестицидов органического состава необходимо обычным порядком (п. 7 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям) установить следующие величины:

X1 - коэффициент распределения "октанол-вода" - ;

Х2 - для дафний - за 48 ч (мг/л);

Х3 - для взрослых или годовиков рыб - за 96 ч (мг/л);

Х4 - для личинок рыб - за 48 ч (мг/л).

Полученные величины вставляются в следующее обобщающее уравнение:

Коэффициенты A, , , и выбираются из таблицы 8.1.1. в соответствие с имеющимся максимальным набором известных исходных показателей (предикторов). Если какие-либо предикторы неизвестны, то из общего уравнения исключают соответствующие члены.

Для пестицидов, обладающих высокой токсичностью, имеющих менее 0,1 мг/л, рекомендуется вычислять уравнение и с другой подборкой коэффициентов (Таблица 8.1.2.).

Из двух вариантов следует выбрать меньшее количественное значение ОБУВ вещества.

8.1.1. Примеры расчета ОБУВ

1. Пример расчета ОБУВ среднетоксичного пестицида (ридомила):

а) полный набор

мг/л,

для дафний = 0,6 (),

для рыб = 91,8 (),

для личинок = 34,3 ();

проводим логарифмирование:

;

находим по таблице 8.1.1. для набора :

А=-3,35; ; ; ; ;

подставляем в уравнение:

ОБУВ=0,006 мг/л;

Таблица 8.1.1.

Коэффициенты формулы для расчета ОБУВ при разных вариантах исходной информации (общий случай)

Набор установленных предикторов	Коэффициенты
Набор установленных предикторов	А	b_1	b_2	b_3	b_4
X_1	-2,05	-0,42	-	-	-
X_2	-3,23	-	0,89	-	-
Х_3	-3,90	-	-	0,91	-
Х_4	-3,55	-	-	-	0,90
X_1X_2	-2,62	-0,22	0,57	-	-
Х_1Х_3	-3,42	-0,12	-	0,74	-
X_1X_4	-2,87	-0,19	-	-	0,69
Х_2Х_3	-3,76	-	0,32	0,68	-
Х_2Х_4	-3,48	-	0,37	-	0,62
Х_3Х_4	-3,82	-	-	0,63	0,32
Х_1Х_2Х_3	-3,50	-0,08	0,18	0,66	-
X_1X_2X_4	-2,95	-0,16	0.12	-	0,63
X_1X_3X_4	-3,29	-0,13	-	0,44	0,35
Х_2Х_3Х_4	-3,72	-	0,27	0,54	0,19
X_1Х_2Х_3Х_4	-3,35	-0,11	0,10	0,43	0,31

Таблица 8.1.2.

Коэффициенты формулы для расчета ОБУВ при разных вариантах исходной информации (для высокотоксичных препаратов, мг/л)

Набор установленных предикторов	Коэффициенты
Набор установленных предикторов	А	b_1	b_2	b_3	b_4
X_1	-2,05	-0,42	-	-	-
X_2	-3,13	-	0,96	-	-
Х_3	-4,28	-	-	0,73	-
Х_4	-2,97	-	-	-	1,21
Х_1Х_2	-2,61	-0,30	0,29	-	-
Х_1Х_3	-2,86	-0,28	-	0,57	-
X_1X_4	-2,23	-0,27	-	-	0,82
Х_2Х_3	-3,22	-	0,56	0,78
Х_2Х_4	-2,17	-	0,68	-	1,13
Х_3Х_4	-3,32	-	-	0,25	0,99
Х_1Х_2Х_3	-2,13	-0,24	0,16	-	0,85
X_1X_3X_4	-2,50	-0,24	-	0,28	0,61
Х_2Х_3Х_4	-2,44	-	0,51	0,33	0,91

б) пусть неизвестны и для личинок. Тогда используем набор : А = -3,76; ; , который подставляем в уравнение:

мг/л.

2. Пример расчета ОБУВ высокотоксичного пестицида (карате):

а) по таблице 8.1.2:

пусть неизвестен . Тогда используем набор :

для дафний = 0,00059 (), ПДК - 0,00000002 мг/л,

для рыб = 0,005 (),

для личинок = 0,0034 ();

проводим логарифмирование:

;

находим по таблице 8.1.1. для набора :

А=-3,72; ; ; ;

подставляем в уравнение

мг/л;

б) по таблице 8.1.2:

пусть неизвестен . Тогда используем набор

для дафний = 0,00059 (), ПДК = 0,00000002 мг/л,

для рыб = 0,005 (),

для личинок = 0,0034 ();

проводим логарифмирование:

;

находим по таблице 8.1.2. для набора :

А = -2,44; ; ; ;

подставляем в уравнение

мг/л.

По таблице 8.1.1. получено меньшее значение, его и выбираем в качестве ОБУВ пестицида карате.

8.2. Определение требований по оценке ОБУВ веществ, помимо органических пестицидов

Помимо ОБУВ органических пестицидов, в пресноводных водных объектах устанавливаются в краткосрочных исследованиях исходные данные для оценки ОБУВ веществ:

а) ядохимикатов сельскохозяйственного и промышленного назначения неорганического состава;

б) соединений и их смесей, используемых в газо-, нефте-, горно-добывающих, перерабатывающих и других отраслях промышленности;

в) химических средств обработки воды;

г) веществ, планируемых к широкому использованию в строительстве и транспорте.

8.2.1. Исследования на водорослях

Целесообразно проведение 7-суточных исследований действия вещества на рост культуры водорослей (п. 1.4 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям). В качестве альтернативы возможно полное проведение хронического эксперимента с одноклеточными водорослями в течение 14 суток.

В конце опытов оценивается статистическая достоверность отклонений опытных данных от контрольных.

Условия культивирования водорослей и постановки токсикологических исследований с ними приведены в п.п. 1.3. и 1.4 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям.

8.2.2. Исследование на зоопланктонных организмах

Исследования проводятся на односуточных дафниях около 20 суток, что определяется временем появления трех пометов у контрольных дафний, или на односуточных цериодафниях в течение 7-8 суток, когда у рачков появляется 3-й помет.

Постановка токсикологических исследований изложена в п.п. 4.1.4. и 4.2.3. Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям.

8.2.3 Исследования на эмбрионах и личинках рыб

8.2.3.1. Проведение исследований

Условия содержания рыб, получения икринок и проведения исследований на них приведены в п. 6 Приложения 2 настоящих Методических указаний.

8.2.3.2. Анализ результатов исследований

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок.

8.2.4 Исследования изменений санитарных показателей водной среды

8.2.4.1. Проведение исследований

Исследуемое вещество оценивают по изменению показателя , характеризующего процессы самоочищения водной среды.

Исследования проводятся при 20°С в стеклянных сосудах объемом 5 , заполняемых природной морской водой, профильтрованной через мельничный газ N 76 и насыщенной кислородом.

В сосуды вносится исследуемое вещество в 5-7 концентрациях, различающихся на порядок. Один из сосудов остается чистым и используется в качестве контроля. В исходные сутки, а также через 5 суток в пикнометры отбираются пробы воды (по 2 пикнометра на каждую пробу), которые выдерживаются в термостате при 20°С в течение 5 суток.

Через 5 суток после экспозиции в каждом из пикнометров в воде определяют содержание кислорода по Винклеру или с применением специально приспособленных оксиметров.

Расчет величины производится следующим образом:

где: - исходная концентрация кислорода в воде,

- концентрация кислорода в пробах на 5 сутки наблюдения.

Результаты используются для составления таблицы или графиков зависимости от времени и концентрации исследуемого вещества.

8.2.4.2. Анализ результатов исследования

Оценка эффекта химического вещества производится по сравнению величин в опыте и в контроле:

где: и , соответственно, в опыте и в контроле на один и тот же срок.

Безвредной для процесса самоочищения следует считать такую концентрацию, при которой показатель отклоняется от соответствующих значений в контроле не более чем на 20% (т.е. N<20%).

Для вычисления концентрации, вызывающей 20% отклонение, путем интерполяции может быть использовано следующее уравнение:

где: С - концентрация вещества, вызывающая отклонение значений от аналогичных значений в контроле на 20%; и - концентрации вещества, вызвавшие отклонения менее и более чем на 20% соответственно; и - величины этих отклонений.

Определение величины временного норматива

Из концентраций, выведенных в процессе исследований в качестве максимальных допустимых для каждого из объектов исследования, выбирается наименьшая, которая и рассматривается в качестве временного норматива вещества - ориентировочного безопасного уровня воздействия (ОБУВ вещества).

Открыть документ в системе ГАРАНТ

Открыть в бесплатной Интернет-версии Открыть в Интернет-версии (только для пользователей системы ГАРАНТ)

<< Приложение 1. Общие требования к разработке ПДК веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения		Приложение 3. >> Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для морских биологических тест-объектов
	Содержание Приказ Федерального агентства по рыболовству от 4 августа 2009 г. N 695 "Об утверждении Методических указаний по разработке...