Приложение 2. Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для пресноводных биологических тест-объектов

2.1.1. Характеристика тест-объекта

Элодея (Elodea canadensis Rich.) - представитель погруженных растений, широко распространенный в пресноводных водных объектах умеренной зоны.

Размножается вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов. Теневынослива. Температурная граница выживаемости лежит в пределах от +5°С до 41,5°С.

Для культивирования растения отбирают из естественной популяции условно чистого водного объекта в конце мая - начале июня, когда появляется много молодых, наиболее жизнеспособных растений.

У элодеи отбирают зеленые верхушечные побеги длиной 8-10 см без боковых отростков и корней, не имеющие видимых повреждений.

Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.

2.1.2. Условия лабораторного содержания

В лаборатории элодею размещают в большие широкие, но не глубокие емкости (10-15 ). Растения проходят акклимацию при комнатной температуре в течение 7-10 дней, достаточной освещенности (лучше - в люминостатной установке) и при смене воды каждые 2-3 суток.

Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:

люминостатная установка;

круглые аквариумы на 10 - 15 л;

кристаллизаторы объемом 1 л;

стаканы объемом 0,5 л;

люксметр;

термометр;

линейка;

глазной пинцет, лезвие;

воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;

планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.

Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемого водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной продувкой воздуха.

Для исследований воду используют через 4-5 дней.

Сосуды располагают у окон на дневном рассеянном свету (с южной стороны) или в люминостате при освещенности 1,5-2 лк на протяжении 10-12 ч и при температуре 22-25°С. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.

В воду добавляют среду Успенского N 1 (разведение 1:10), которая способствует быстрому образованию боковых отростков и увеличению биомассы растения и дает возможность круглогодичного содержания растений, пригодных для экспериментов.

Предварительно приготовленные основные растворы держат в холодильнике, затем из них вносят по 0,5  на 1  дистиллированной воды; рН после стерилизации раствора (равномерным кипячением в течение 0,5 ч) составляет 7,0 - 7,3.

2.1.3.1. Характеристика тест-объекта

Ряска малая (Lemna minor L.) - представитель группы растений с плавающими листьями. Тенелюбива, устойчива к низким температурам. Ее распространение ограничено участками водных объектов с рН от 6,2 до 7,5.

Для культивирования растения отбирают из естественной популяции водного объекта в конце мая - начале июня, когда много молодых, наиболее жизнеспособных растений. При отборе ряски выбирают растения с зелеными лопастями и с корнями, не имеющими видимых повреждений.

Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.

2.1.3.2. Условия лабораторного содержания

В лаборатории ряску помещают в кристаллизаторы объемом 1  с речной или отстоянной водопроводной водой. В течение 7-10 дней растения проходят акклимацию при комнатной температуре и при достаточной освещенности (лучше в люминостатной установке), со сменой воды каждые 2-3 суток для удаления продуктов метаболизма.

Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:

люминостатная установка;

круглые аквариумы на 10-15 ;

кристаллизаторы объемом 1 ;

стаканы объемом 0,5 ;

люксметр;

термометр;

линейка;

глазной пинцет, лезвие;

воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;

планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.

Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязненного водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной аэрацией воды.

Для исследований воду используют через 4-5 дней.

Ряску в количестве 5 растений, имеющих одну сформировавшуюся и одну развивающуюся лопасть и корень с неповрежденным корневым чехликом, и примерно одинаковой длины, помещают в стаканы объемом 0,5  и размещают в люминостате при температуре 22-25°С и освещенностью 5 лк. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.

Для круглогодичного культивирования ряски в целях получения достаточного количества материала рекомендуют выращивать их на среде Гапоненко-Стажецкого при круглосуточном освещении 7-8 лк и температуре +25°С.

Состав среды Гапоненко-Стажецкого:

- 0,4 г/л,

- 0,2 г/л,

- 0,3 г/л,

- 0,6 г/л,

- 0,3 г/л,

- 0,5 мг/л,

цитрат железа - 5 мг/л.

Среду автоклавируют при 1,5 атм в течение 20 минут, цитрат железа вносят после стерилизации.

2.1.3.3. Проведение исследований

До постановки хронического эксперимента следует провести предварительный 10-дневный опыт для установления диапазона действующих концентраций вещества. Для каждой концентрации и контрольной выборки отводят по 3 стакана.

Для проведения хронического опыта из концентрации, вызывающей за 10 суток гибель 50% особей, готовят не менее 3-6 разведений, отличающихся на порядок.

Хронические опыты продолжительностью не менее 30 суток наиболее удобно проводить в летний период. Растения по 5 экземпляров рассаживают в стаканы (объем 0,5 ), которые размещают в люминостате или на рассеянном свету при температуре 22-25°С и освещенности 3-4 лк.

Смену опытных растворов проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2-5 суток, одновременно меняя воду и в контроле.

2.1.3.4. Учет и анализ результатов

Состояние растений учитывают каждые 5 суток по выживаемости и изменению ряда биологических показателей.

Отмечают общее состояние растений: изменение окраски, размер лопастей, состояние корней), число растений, лопастей и корней в штуках. Общее число лопастей составляет суммарный прирост ряски.

Измерения длины проводят с помощью линейки.

Все результаты измерений пересчитывают на одно растение.

Учитывают сроки образования новых лопастей и корней, а также новых растений, которые приходятся примерно на 10 - 20-е сутки.

4.1.1. Введение

Предлагаемая методика с использованием дафний вошла в состав ряда методических указаний и рекомендаций по установлению токсичности сточных и природных вод (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 06 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды"; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).

4.1.2. Характеристика тест-объекта

Рачки вида Daphnia magna Straus (класс Crustacea, отряд Cladocera) обитают в стоячих и слабопроточных водных объектах, особенно часто - во временных лужах, и распространены повсеместно на территории России.

Этот вид является типичным бетамезосапробом, перенося осолонение до 6. Оптимальное содержание кислорода для дафнии составляет 7-8 мг/л, однако рачок способен переносить снижение концентрации до 2 мг/л.

Оптимальные значения активной реакции среды рН составляют 7,0 - 8,0, однако временные изменения рН в пределах 5,8 - 9,0 не подавляют существенным образом жизнедеятельность дафнии.

При культивировании и проведении токсикологических опытов необходимо поддерживать непрерывное партеногенетическое размножение рачков, учитывая особенности биологического цикла развития рачков.

Длительное культивирование дафний в лабораторных условиях позволяет установить пределы изменчивости основных биологических показателей рачков в зависимости от сезона. В оптимальных условиях содержания выживаемость дафний не зависит от времени года, оставаясь на уровне 80-100% к концу опытов. Средние значения плодовитости за 30 суток опытов (за это время получают 7 - 8 пометов) составляют от 60 до 170 экземпляров молоди на одну самку. Могут наблюдаться повторяющиеся снижения плодовитости рачков в зимний (ноябрь - январь) и летний (июнь - июль) периоды. Длительность культивирования рачков в лаборатории в оптимальных условиях даже в течение 10 лет не влияет на результаты опытов.

4.1.3. Условия лабораторного содержания

Работу с дафниями необходимо проводить в помещении, где не используются химические летучие вещества. Недопустима также обработка помещения хлор- и фосфорорганическими пестицидами для борьбы с насекомыми и грызунами.

Дафний отлавливают в природном водном объекте (или получают культуру в одной из специализированных лабораторий). Для постепенной адаптации дафний рекомендуется смешивать 1 часть воды из природного водного объекта или воды, в которой рачки предварительно культивировались, с тремя частями лабораторной воды. Культуральная среда обновляется полностью или частично 1 раз в неделю.

Стабильные условия культивирования обеспечиваются в специально устроенном шкафу-термолюменостате. Он представляет собой застекленный бокс с раздвижными стеклами и рядом полок для сосудов. Хорошо предусмотреть ряд секций для раздельного содержания маточных культур дафний и постановки хронических экспериментов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400 - 600 люкс в течение 10 - 12 ч в сутки. В шкаф может быть встроен обогреватель с контактным термометром, обеспечивающим температуру °С.

Для культивирования дафний используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемых водных объектов. Отбор воды из природных водных объектов лучше производить в ясную погоду, желательно после ряда дней без дождя. Неблагоприятное действие на рачков может оказать вода, взятая в паводковый период. Природную воду необходимо процеживать через сито (N 68-72) во избежание попадания простейших и коловраток, которые могут паразитировать на рачках. Водопроводной водой можно пользоваться после предварительного удаления из нее остаточного хлора путем длительного продувания воздуха с помощью микрокомпрессора (около 14 дней). На дно аквариума насыпают хорошо промытый песок, сажают 5-10 растений.

Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний, должны находиться в следующих пределах:

а) содержание кислорода 7-8 ;

б) рН - 7,0-8,2;

в) окисляемость по Кубелю 4,2 - 5,8 ;

г) общая жесткость 3,0 - 6,5 ( мг );

д) соотношение Ca/Mg 4:1;

е) , - отсутствие, следы. В почти всех остальных случаях без знаков препинания!

В качестве основного корма для дафний могут быть использованы зеленые протококковые водоросли и в качестве дополнительного - пекарские дрожжи только для маточных культур. Дрожжами дафний можно подкармливать 1 - 2 раза в неделю из расчета 3 мл 1%-й суспензии на 1  среды. Взвесь дрожжей хранится в холодильнике не более трех дней.

Состав сред для культивирования кормовых водорослей представлен в таблице 4.1.1.

Быстрый рост накопительной культуры водорослей хлореллы (Chlorella vulgaris) создается при соблюдении следующих условий: питательная среда с добавлением микроэлементов (Тамия), круглосуточное освещение лампами дневного света (2-4 тыс. лк) и интенсивное продувание атмосферного воздуха (аэрация) с помощью микрокомпрессоров. При выращивании водорослей на средах Успенского и Прата (с меньшим количеством солей) аэрация не требуется, но рост водорослей идет значительно медленнее.

Питательные среды для водорослей готовят на дистиллированной воде (п. 2.2, Приложения 1 настоящих Методических указаний). Растворы солей железа и микроэлементов можно добавлять во все среды независимо от того, указано это в прописи среды или нет.

Исходная концентрация водорослей должна быть около 2 . Через 7-10 дней роста в оптимальных условиях культура достигает максимальной плотности.

Для кормления водоросли отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 3-5 дней. Осадок разбавляется дистиллированной водой и хранится в холодильнике не более трех недель.

Таблица 4.1.1.

Состав сред для культивирования кормовых водорослей

Примечание: раствор микроэлементов N 1: - 2,86 ; - 1,81 ; - 0,222  ; Раствор микроэлементов N 2: - 17,64 ; - 22,96 .

Число клеток в суспензии хлореллы просчитывают в камере Горяева (или любой другой камере для счета водорослей). Кормление дафний проводится 1 раз в день, концентрация корма в сосуде с дафниями 350 - 700 тыс. кл/мл.

Для культивирования рачков удобны небольшие стеклянные кристаллизаторы объемом 1 - 3 , плотность посадки 20 - 25 особей на 1 . Появившуюся молодь в необходимом количестве отсаживают в следующие сосуды от поколения к поколению. Когда вновь народившиеся рачки начинают размножаться, материнские особи удаляют. Каждое поколение маркируют и ставят дату рождения. Одновременно в лаборатории содержат культуры двух поколений дафний.

4.1.4. Проведение исследований на сериях генераций

Требования к тест-объекту. Для токсикологических исследований используют дафний, начиная с третьего поколения, полученного в лаборатории. Перед проведением эксперимента оценивают устойчивость рачков к бихромату калия. По величинам за 24 ч определяют соответствие культуры стандарту. Эта концентрация для дафний в возрасте ч должна находиться в пределах 0,9 - 2,0 мг/л.

4.1.5. Проведение исследований на модельных популяциях

4.1.5.2. Учет и анализ результатов. В течение первых двух часов наблюдение проводится регулярно: сначала каждую минуту, затем - через 5, далее - через 10 минут. Позже можно ограничиться просмотром через полчаса до конца первого рабочего дня. Со следующего дня просмотр проводится ежедневно.

Через сутки, через двое, на 5-е и 10-е сутки проводится полный анализ с просмотром под бинокуляром и описанием состояния каждой особи. Если имеются данные, что возможна задержка роста дафний, они должны регулярно измеряться под бинокуляром.

Дафнии подразделяются на следующие возрастные группы:

 

 

Отдельно должны учитываться все уродливые особи. Желательно пересадить их в чистую воду и проследить за их дальнейшей судьбой и за их потомством.

Как правило, наиболее чувствительным показателем является биомасса дафний в момент достижения максимальных значений в контроле и при минимальных концентрациях вещества в опыте. Если обнаруживаются нарушения в развитии партеногенетических или латентных яиц, ПДК вещества должна устанавливаться по этому показателю.

Об упитанности дафний и накоплении гемоглобина при снижении в воде содержания растворенного кислорода можно судить по цвету тела и количеству капель жира. Иногда у дафний появляется зеленовато-голубоватая окраска, особенно яиц и зародышей в выводковой сумке, расположенной между створками раковины на спинной стороне и абдоменом рачка. Обычно этот цвет приписывают каротиноидам, накапливаемым в заметных количествах.

Ниже приведены некоторые формы записи и интерпретации результатов опытов с дафниями (Таблицы 4.1.2. - 4.1.6 и Формы 3-5).

При внесении в таблицу в числителе записывают состояние яиц в гонадах, а в знаменателе - состояние яиц, зародышей в выводковой камере или в эфиппиуме на ней. Выделяют следующие градации степени повреждающего действия:

E1 - реакции дафний, не связанные с их повреждением;

Е2 - легкие повреждения, не связанные с опасностью для существования особи;

Е3 - повреждения средней тяжести;

Е4 - тяжелые повреждения;

Е5 - гибель рачков и предшествующие ей симптомы (иммобилизация, тетанические сокращения туловища, параличи и т.п.).

 

Таблица 4.1.2.

 

Шкала для оценки степени наполнения кишечника дафний

 

Содержимое кишечника	Балл
Отсутствует	к1
Заполняет меньше половины кишечника, часто не прилегает к его стенкам	к2
Заполняет от 1/2 до 3/4 кишечника, рыхло	к3
Заполняет больше 3/4 кишечника, но местами отстает от стенок или прозрачно в средней части кишечника	к4
Заполняет весь кишечник; если просвечивает, то только в его передней части	к5
Заполняет весь кишечник, но прозрачным еле видным содержимым	к2а
Заполняет весь кишечник, окрашено, но сильно просвечивает	к3а

Примечание: баллы к2а и к3а свидетельствуют о нарушении пищеварения, к1 и к2 - о голодании дафний, к3 - о плохом питании.

 

Таблица 4.1.3.

 

Сокращенная запись окраски содержимого кишечника

 

Окраска содержимого	Оливковая	Зеленая	Охристая ("песчаная")	Коричневая	Серая	Черная
Обозначение	О	З	Ох	К	С	Ч

Примечание: заполненность кишечника и окраску его содержимого удобно учитывать отдельно для передней (до перегиба при переходе из головного отдела в абдомен) и задней части.

 

Таблица 4.1.4.

 

Шкала градаций окраски тела дафний

 

Характеристика окраски тела дафний	Оценочный балл
Бесцветное, "стеклянное"	1
Желтоватое (полостная жидкость не видна, но ощущается плазма клеток)	2
Плазма клеток и кровь (полостная жидкость) имеют диффузно-розовое окрашивание:
бледное	3
умеренное	4
яркое	5
Мутно-желтое	2м
Мутно-розовое	3м - 5м

Примечание: балл 1м не приводится, поскольку он плохо выявляется визуально. Мутность (в первую очередь дыхательных отростков ног и туловища) обычно свидетельствует о коагуляции плазмы клеток.

 

Таблица 4.1.5.

 

Шкала развития партеногенетических и латентных яиц в гонадах дафний

 

Состояние гонады и проходящие в ней процессы	Оценочный балл
Развитие партеногенетических яиц
В зоне роста визуально не обнаруживается очередная партия яиц. Иногда здесь слабо видны прозрачные клетки эпителия зоны роста, но они расположены беспорядочно	1
В зоне роста расположены тетрады прозрачных яйцеклеток, содержащие капли жира (малый трофоплазматический рост)	2
Яйцеклетки становятся дымчатыми, промежутки между ними просвечивают (большой рост, накопление желтка)	3
Яйцеклетки темные, малопрозрачные в проходящем свете, промежутки между ними не видны (накопление желтка закончено, яйца готовы к поступлению в выводную камеру	4
Развитие латентных яиц
На границе зоны роста и зачатковой зоны гонады (над пятой парой брюшных ножек лежит группа клеток с более резкими границами, последняя тетрада преобразуется в латентную яйцеклетку с первичными питающими клетками)	1л
В группе клеток с более темными оболочками снизу прилегает темная треугольная полоска латентной яйцеклетки (начало накопления желтка)	2л
Первичные питающие клетки дымчатые, под ними - темная треугольная полоска латентной яйцеклетки (идет накопление желтка)	3л
Латентное яйцо сформировано, часто с небольшой перетяжкой посередине. Питающих клеток не видно	4л
Патология
Края клетки мутные, частицы желтка в клетках эпителия зоны роста. Идет резорбция яиц. Обычно заметно на стадиях 3 и 3л	Р

 

Таблица 4.1.6.

 

Шкала развития партеногенетических яиц в выводковой камере и эфиппиума. Норма и патология

 

Показатель состояния и происходящие процессы	Оценочный балл
Выводная камера пуста.
а) у впервые созревающих самок	0
б) у повторно созревающих	04
Развитие партеногенетических яиц (норма)
Яйца темные, непрозрачные, в начале стадии вытянутые, в конце ее округлые. Окончание образования направительных телец, слияние ядра одного из них с ядром яйцеклетки, образование первой яйцевой оболочки	1
Яйца становятся крупнее с более светлым периферическим слоем и грануляцией в середине яйца. Дробление, гаструляция	2
Стадия несформированного эмбриона. Начало становления зачатков (выступов) плавательных антенн, конец его, сформирование парного глаза	3
Стадия сформированного эмбриона. Начало стадии - слияние парного глаза и появление в нем черного пигмента, конец ее - полное сформирование молодой дафнии, которая начинает двигаться, сердце ее пульсирует. Каудальная игла иногда подогнута в момент вымета, иногда выпрямлена	4
Нарушение партеногенетического развития (патология)
Яйца мутные, непрозрачные, часто - набухшие. Их гибель и дегенерация	Д
Яйца теряют форму, разлагаются и в виде пенистой массы вытекают через заднюю щель выводковой камеры самки	S
Яйца развиваются, но не происходит яйцевой линьки (во время развития эмбрионов в норме наблюдается одна яйцевая и две эмбриональные линьки), поэтому зародыш развивается уродливо "в яйце". При сформированном глазе и уже пульсирующем сердце не видно никаких выступающих органов	мS

 

Форма 3

 

Выживаемость дафний в растворах вещества

 

Дата	Час	Срок опыта	Контроль			Концентрация С, мг/л
			Повторности 1-я, 2-я, 3-я			Повторности 1-я, 2-я, 3-я
			Номера стаканов			Номера стаканов
			1	2	3	1	2	3

 

Форма 4

 

Изменение биологических показателей у дафний под влиянием вещества

 

Дата

Срок опыта в сутках

Контроль

Концентрация С, мг/л

Исходное поколение, 1-е, 2-е, 3-е

Исходное поколение, 1-е, 2-е, 3-е

Повторность, номера стаканов

Повторность, номера стаканов

Число

абортивные яйца

Число

абортивные яйца

дафний

карапаксов

Молоди

мертвых

Эфиппиумов

дафний

карапаксов

молоди

мертвых

эфиппиумов

 

Форма 5

 

Изменения биологических показателей у дафний в опытах на культурах

 

Показатели	Исходные особи			1-е поколение и т.д.
	Контроль	Концентрация, мг/л		Контроль	Концентрация, мг/л
Выживаемость, %
Срок наступления половозрелости, сут
Первый помет, сут
Реальная плодовитость
Число абортивных яиц
Число мертворожденных
Число уродливой молоди
Число эфиппиумов
Число карапаксоа#
Длина, мм
Ширина, мм

 

4.2.1. Характеристика тест-объекта

Цериодафнии - рачки вида Ceriodaphnia affinis Lilljeborg (класс. Crustacea, отряд Cladocera, семейство Daphnidae) обитают в пресноводных водных объектах Европы, Северной Африки, Азии, Северной Америки. Этот вид относится к олиго- и бетамезосапробам и населяет водные объекты с замедленным течением - неглубокие озера, реки, водохранилища. Сведения о морфологии и физиологии рачков опубликованы ранее (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 06 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды". М.: 1991; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).

Цериодафния имеет более мелкие размеры, чем дафнии, половозрелые самки 1,5 мм, самцы - 0,8 мм, что позволяет в опытах манипулировать с меньшими объемами воды и более компактными емкостями. Биологический цикл развития от рождения до половозрелости у цериодафнии вдвое короче, чем у дафний, при оптимальных условиях развития. Так, при температуре 25°С созревание наступает на 2 - 3-й сутки от рождения, время первого помета - на 3 - 4-е сутки, а за срок 7-8 суток у рачков получают 3 помета.

При температуре 18°С сроки получения трех пометов у рачков могут растянуться до 28 суток. Численность молоди у рачков в первом помете невелика - по 2-6 особей, а начиная со второго помета - от 6 до 20 особей на самку. Этот вид цериодафний моно- или дицикличен. Максимум полового периода размножения приходится на август - сентябрь, самки образуют эфиппиум с одним яйцом. В лабораторных условиях самцы появляются при недостаточном освещении, снижении температуры, концентрации растворенного кислорода, голодании.

Цериодафния более чувствительна к кислородному фактору, чем дафния. Нормальное развитие цериодафний протекает при концентрации растворенного в воде кислорода не ниже 5 . Вследствие этого цериодафнии более чувствительны к органическому загрязнению и веществам, снижающим концентрацию растворенного кислорода в среде.

4.2.2. Условия лабораторного содержания

Требования к помещению, где содержат цериодафний, такие же, как и с дафниями. Не допустима обработка помещения химическими веществами с целью уничтожения насекомых и грызунов.

Для культивирования цериодафний используют дехлорированную, отстоянную воду, которая должна удовлетворять следующим требованиям:

а) рН 7,0 - 8,2;

б) общая жесткость - 1,3 - 2,0 ;

в) содержание растворенного кислорода - 7,0 - 8,0 .

В качестве корма для цериодафний используют хлореллу - зеленые протококковые водоросли (Chlorella vulgaris) и пекарские дрожжи. Процедура выращивания водорослей приведена в разделе с дафниями (п. 4 Приложения 2).

Для культивирования цериодафний удобны небольшие кристаллизаторы или стаканы емкостью 0,5 - 1 , плотность посадки рачков - из расчета не менее 20  объема среды на одну особь. С целью адаптации рачков к условиям новой лаборатории, их помещают в смешанную воду: 1 часть среды, в которой рачки жили ранее, и 3 части лабораторной воды. Кормление проводят ежедневно, водоросли вносят в концентрации 250 - 500 ; дрожжи дают не чаще одного раза в неделю, желательно перед сменой раствора в концентрации 1-2  1% раствора на 1 . Культуральная среда обновляется полностью один раз в неделю.

Культуру цериодафний выращивают в климатостате, люминостате или боксе при оптимальных условиях содержания: температура °С, освещенность - 400 - 600 лк, продолжительность светового дня - 10-12 ч.

При культивировании цериодафний удобно одновременно содержать рачков двух поколений - материнские размножающиеся особи и подрастающую молодь. Продолжительность использования маточных культур ограничивают 15-20 сутками. Отмечается каждое родившееся в лаборатории поколение и ставится дата рождения.

Для токсикологических исследований используют цериодафний, начиная с третьего поколения. Рачков в возрасте ч исследуют на устойчивость к стандартному токсиканту - бихромату калия в остром опыте, величина бихромата калия за 24 ч находится в интервале 1,0 - 2,2 .

В дальнейшем эксперименты с бихроматом калия ставят одновременно с постановкой основного острого опыта с каждым веществом.

4.2.3. Проведение исследований

5.1.1 Характеристика тест-объекта

Брюхоногие моллюски играют важную роль в круговороте органического вещества в водных экосистемах. Прудовик болотный (обыкновенный, большой) Limnea stagnalis является представителем эпибентоса. Широко распространен в прибрежной зоне стоячих или медленно текущих водных объектов.

Прудовиков отлавливают в летние месяцы на мелководьях эвтрофных водных объектов в зарослях высшей водной растительности.

5.1.2 Условия лабораторного содержания

Для содержания моллюсков и для проведения исследований необходимо следующее оборудование:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

бинокулярная лупа;

весы аналитические с разновесами;

весы технические;

термостат на 150°С;

муфельная печь на 450°С; кристаллизаторы на 2 л;

стаканы химические на 100 - 500 мл;

колбы мерные на 0,2 - 1 л;

цилиндры мерные на 50 - 1000 мл;

пипетки химические на 1 - 10 мл;

чашки Петри;

респирометры (банки по 0,5 л со стеклянными крышками);

склянки с притертыми пробками на 0,5 - 1 л для растворов;

сифоны с зажимами Мора;

пикнометры;

тигли;

ножницы, пинцеты, часовые стекла;

реактивы для определения кислорода методом Винклера.

Для исследований отбирают половозрелых моллюсков, активно передвигающихся и потребляющих корм. Кормят листьями одуванчика, капусты, салата, рдестом блестящим. Корм моллюскам дают в изобилии, что положительно сказывается на их росте и продуктивности. В каждый кристаллизатор помещают по 3 - 5 особей. После отбора проводят адаптацию к условиям лабораторного содержания в течение двух недель.

5.1.3 Проведение исследований

Для каждого опыта выбирают особей одного размера, веса и цвета раковины.

Острый опыт предназначен для определения диапазона концентраций хронического опыта. Проводится при 5-6 концентрациях в трех повторностях каждая. Концентрации различаются между собой на порядок. Продолжительность исследования - 3-5 суток. Моллюсков в опыте не кормят. В каждый кристаллизатор на 1,5 - 2,5  раствора помещают 3-5 моллюсков.

Учитывают влияние исследуемого вещества на выживаемость и поведение моллюсков.

Хронический опыт продолжается 45 - 60 суток. Исходной концентрацией для длительных исследований служит наибольшая безвредная концентрация, определенная в остром опыте. Число повторностей и плотность посадки такие же, как и в остром опыте. В течение опыта моллюсков подкармливают.

Состояние выборок учитывают ежедневно.

Для оценки влияния вещества на процессы размножения в аквариумы помещают по 2 - 3 взрослых прудовика. Ежедневно учитывают появление кладок, начало выклева и время появления молоди, которая содержится в аквариуме. Через 3-4 месяца всю молодь изымают из аквариумов и промеряют под микроскопом с помощью окуляр микрометра по высоте и ширине раковины. Мелкие особи держатся у уреза воды, быстро обсыхают и могут быть утеряны при подсчете численности. Необходимо регистрировать и погибших моллюсков, учитывая пустые раковины.

5.1.4 Учет и анализ результатов

В первые 8 ч ежечасно, а в последующие 3-е суток 2-3 раза в день, учитывают состояние моллюсков в опытных и контрольных сосудах. Регистрируют количество живых особей и их поведение (степень и характер передвижения, выдвижение ноги и ее реакцию на раздражение), интенсивность потребления корма, выделение слизи, определяемое по помутнению опытного раствора. В дальнейшем учет проводят один раз в сутки.

Особи, которые не реагируют на механическое раздражение и тело которых легко высвобождается из раковины, считаются погибшими.

Размножение и плодовитость оценивают по времени появления первых кладок, их числу и количеству яиц в каждой кладке. Потенциальную плодовитость определяют по числу яиц в кладках, полученных от каждого моллюска за период опыта, а реальную - по количеству выклюнувшейся молоди в абсолютных величинах и процентах к исходному числу яиц в кладках. Помимо этого можно контролировать процесс эмбриогенеза (время начала и конца прохождения каждой стадии, состояние эмбрионов) вплоть до выклева молоди. Особенности роста оценивают, определяя высоту и ширину раковины, отношение высоты к ширине. Водно-солевой обмен моллюсков оценивают, определяя сырую массу тела и раковины, массу полостной жидкости и воды в теле, сухой остаток и количество золы в мягких тканях. По разнице сухого остатка и сырой массы тела судят об изменении степени обводненности, а по количеству зольных элементов в теле и массе раковины - об изменении минерального обмена.

Высоту и ширину раковины измеряют штангенциркулем. За ее высоту принимают расстояние от вершины раковины до наиболее выступающего края устья, а за ширину -диаметр раковины в наиболее широкой части.

Для определения общей массы прудовика обыкновенного его обсушивают фильтровальной бумагой и, не надавливая на ногу (для сохранения в раковине полостной жидкости), переносят на технические весы и взвешивают.

При определении массы тела и раковины ножницами разрезают раковину по швам витков, освобождают тело, обсушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на аналитических весах (с точностью до 0,001 грамма). Тела особей каждой размерной группы фиксируют в бюксах в 96% этаноле. Осколки раковины взвешивают. Вычитая из общей массы массу тела и раковины, определяют количество полостной жидкости.

Для определения сухого остатка тела вес зафиксированных в спирте моллюсков доводят до постоянной величины при температуре 103-105°С. Количество сухого остатка рассчитывают на единицу сырой массы. По разности сырой и сухой массы определяют количество воды в теле прудовика и судят о степени обводненности или обезвоживания тела под воздействием химического вещества.

Сухой остаток тела прудовика (весь или его часть) переносят в тигли и сжигают в муфельной печи при температуре 450°С. Рассчитывают количество золы на единицу массы сухого остатка тела. По количеству золы судят об изменении минерального обмена.

Количество органического вещества рассчитывают по разности массы сухого остатка и золы. Эта величина, при сравнении с контрольными величинами, указывает на степень энергетических затрат организма при токсическом воздействии.

Для определения суточного рациона моллюсков находят разность между начальным количеством корма и его остатком. Задаваемую порцию корма взвешивают, а остаток изымают, обсушивают и вновь взвешивают. Для каждой размерной группы вычисляют кормовой коэффициент по формуле:

,

где Р - масса съеденного корма (г), - прирост массы моллюска (г).

Этот показатель позволяет судить об эффективности потребленного корма моллюсками при токсическом воздействии в опыте по сравнению с контролем.

Изучение энергетического обмена у прудовиков заключается в определении интенсивности потребления кислорода с применением метода Винклера (или с использованием чувствительного оксиметра).

Для этого в респирометры (банки на 0,5  с плотными крышками) заливают воду, помещают прудовиков, у которых предварительно определены масса и объем тела (по 3 особи), и закрывают крышками так, чтобы в банках не оставалось воздушных пузырьков. Банки с водой, но без моллюсков являются контрольными. Банки при стабильной температуре выдерживают 2 ч, после чего из них отбирают пробы воды в калиброванные пикнометры, в которых измеряют количество растворенного кислорода. Количество кислорода, потребленное прудовиками (в мг кислорода на 1  за 1 ч), определяют по формуле:

,

где - содержание кислорода, растворенного в воде респирометра без прудовиков, на 1 ; - содержание кислорода в воде респирометра с прудовиками; - объем респирометра в ; - общий объем тел моллюсков в мл; Р - общая масса тел прудовиков в мг; t - продолжительность экспозиции в часах.

При наличии оксиметра контроль содержания кислорода в воде можно производить непосредственно в респирометрах, не отбирая проб.

Полученные результаты по динамике роста молоди прудовика заносят в нижеследующую табличную форму 6.

По окончании экспериментов с прудовиком и обобщении полученных данных допустимыми следует считать такие концентрации вещества, которые:

а) не вызывают статистически достоверного отклонения выживаемости взрослых моллюсков и молоди от выживаемости в контроле в срок до 60 суток;

б) не вызывают достоверного угнетения размножения моллюсков за срок наблюдения;

в) не снижают интенсивность потребления кислорода более чем на 15% по сравнению с контролем; (то, что отмечено выше красным шрифтом)

г) изменяют водно-солевой обмен по сравнению с контролем не более чем на 10%.

5.2.1 Характеристика тест-объекта

Из пресноводных бентосных организмов инфауны (зарывающихся в грунт) для проведения токсикологических опытов используются хирономиды. Хирономус дорзалис (Chironomus dorsalis Meig.) относится к широко распространенному семейству хирономид, личинки темно-красного цвета обитают в иле стоячих водных объектов, где строят в грунте трубчатые домики. Окукливание наступает чаще всего на 12-13-е сутки. Перед окукливанием личинки перестают питаться, теряют активность. Стадия куколки длится 2-3 суток. В конце этой стадии куколки из олигофотных становятся полифотными, покидают грунт и всплывают к поверхности воды, где происходит вылупление комаров из кукольной шкурки через ее разрыв на дорсальной стороне груди. Общая продолжительность жизни комаров 3-5 суток. В течение этого времени ни самцы, ни самки не питаются. После выклева из яиц личинки покидают кладку и плавают в воде, через несколько дней они оседают на грунт, переходя к донному образу жизни. Их дальнейшие рост и развитие определяются в основном условиями питания, дыхания, качеством грунта, температурным режимом, плотностью популяции и некоторыми другими факторами.

5.2.2 Условия лабораторного содержания

Хирономиды легко поддаются культивированию в искусственных условиях, и их личинки служат важным кормовым объектом.

При содержании мотыля в искусственных условиях создание и поддержание маточного роя комаров нужной численности осуществляется по той же методике, что и выращивание личинок. Разница состоит лишь в том, что их не отбирают на опыт, а дают им возможность закончить метаморфоз.

Устройство для выведения хирономид (хирономидник) представляет собой деревянный каркас, обтянутый марлей. Комната, где расположен хирономидник, должна быть достаточно светлой, высота хирономидника должна быть не менее 2,5-3 м. Поскольку взрослые комары не питаются, содержание маточного роя заключается в контроле за водным режимом в кюветах, в кормлении растущих личинок и в соблюдении чистоты воздуха (недопустимо наличие дыма, запаха нефтепродуктов, красок и т.п.).

Яйца, откладываемые комарами, собирают, и 20-30% их идет на воспроизводство маточного роя, остальная часть используется в качестве посадочного материала для токсикологических опытов. Яйцекладки можно вносить сразу на поверхность ила, однако лучшие результаты получают, используя их предварительное выдерживание в чистой воде до массового выклева личинок. Для постановки опытов выклюнувшуюся молодь выращивают в выростных кюветах до размеров 3-4 мм. В качестве корма используют сухие белковые дрожжи.

Для культивирования удобнее использовать фотографические кюветы высотой 2,5-3 см со сторонами размером 13x16 см. Кюветы размещают в несколько ярусов на деревянном или металлическом стеллаже в хирономиднике. Просвет между стенками кювет, расположенных на стеллаже по вертикали одна над другой, составляет 10-15 см, число ярусов - 7-15 см в зависимости от высоты хирономидника.

Наиболее целесообразно выращивание личинок на "тонком" речном иле, накапливающемся на участках с затишным течением. Желательно, чтобы слой ила был толщиной 12-15 мм. Хороший результат дает уменьшение водного слоя вплоть до его полного исчезновения. Лучше выращивать личинок во влажном грунте, периодически обрызгиваемом водой во избежание подсыхания. При поддержании комнатной температуры культивирование мотыля может идти круглогодично.

Личинок выращивают в кюветах, заполненных наполовину сметанообразной массой смеси ила с водой. Качество прудового или речного ила может быть улучшено его прогреванием до температуры 50-60°С, обуславливающим уничтожение организмов, которые могут оказаться хищными по отношению к разводимым личинкам (личинки жуков, стрекоз, другие виды хирономид).

После отстаивания грунтовой массы, налитой в кюветы (4-5 ч), вносят кладки, предварительно выдержанные в чистой воде до выхода первых личинок из слизи. На 1 м поверхности вносится примерно 100-150 кладок. Яйцекладки нужно распределять равномерно во избежание их заглубления в грунт. При температуре 18-20°С сухие белковые дрожжи в виде порошка двукратно распыляют по поверхности грунта из расчета 30-40 г/м. При температуре выше 18-20°С единовременное внесение большого количества корма может привести к интенсивному развитию гнилостных процессов с выделением метана и сероводорода. В связи с этим лучше вносить корм каждые 3-4 суток, причем вносимую порцию необходимо увеличивать соответственно росту личинок. Последнюю порцию корма вносят за 2-3 суток до отбора личинок.

Для получения яиц в маточном помещении устанавливают стеклянные кюветы или кристаллизаторы высотой 5-10 см и площадью 400-1600  и наливают в них чистую воду толщиной слоя 2-3 см. Ежедневно (лучше в середине дня, чтобы не мешать роению) выбирают яйцекладки пинцетом выше уреза воды, где они прикрепляются. Затем кристаллизаторы ополаскивают для удаления обрывков кладок и заполняют чистой водой. Один-два раза в месяц кюветы и кристаллизаторы рекомендуется протирать спиртом.

5.2.3 Проведение исследований

Эксперименты на хирономидах можно проводить в трех вариантах:

а) в чашках Петри или Коха с регулярной заменой среды;

б) в циркуляционных устройствах;

в) в проточных установках.

В опытах с осуществлением проточности установка представляет собой два расположенных один над другим сосуда, между которыми находятся чашка Петри с подопытными организмами (10 экземпляров в чашке).

Соответствующие концентрации токсичного вещества, введенные в верхний сосуд, по каплям проходят через чашки, стекая в нижний сосуд. Таким образом обеспечиваются проточность и аэрация.

Выбор концентраций определяется токсичностью того или иного вещества. Опытные растворы готовят на дехлорированной воде и меняют раз в двое суток. Нестойкие токсичные вещества необходимо менять каждый день. Объем 2  в проточной установке обеспечивает подачу опытной жидкости в течение 10-12 ч, после чего ее снова переливают в верхние сосуды. Температуру измеряют три раза в день.

Растертые в порошок и просеянные через сито N 27 белковые дрожжи замачивают в воде до получения густой массы, затем вносят в опытную чашку стеклянной палочкой. Масса, опущенная на конце стеклянной палочки, располагается под водой в опытной чашке в форме кружков диаметром 6-8 мм. Десяти маленьким личинкам в начале опыта хватает 3-4 кружков. По мере роста личинок количество корма, вносимого в опытные чашки, увеличивают.

С начала окукливания кормление сводится к минимуму, а к моменту вылета имаго совсем прекращается. Дрожжи используются хирономидами и как строительный материал для домиков. Разведенные дрожжи на протяжении всего опыта хранят в холодном месте.

Острые опыты проводят без добавления грунта в течение 10-15 суток. Длительность хронических опытов от III стадии личинки (длиной 3-4 мм) до вылета имаго составляет около 30 суток.

Вначале отбирают одну из кладок хирономид (в ней до 200 яиц) в кристаллизатор с водой. После вылупления личинок их подращивают на иле до определенного размера (3-4 мм) и затем сифоном со стеклянной трубочкой осторожно отбирают по 10 экземпляров на опытную чашку. В течение двух суток они обживают опытные площади (чашки), строят домики из дрожжей, вносимых заранее. Слабых особей заменяют новыми из той же одновозрастной популяции. К концу вторых суток личинки подрастают до 3-й стадии (4-5 мм). Перед опытом воду из опытной чашки отсасывают сифоном вместе с остатками корма и заменяют раствором определенной концентрации. Опытную жидкость следует менять по возможности быстро, чтобы куколки и личинки не обсыхали. После очистки опытную чашку наполняют на 2/3 жидкостью и только затем вносят корм. Каждая концентрация испытывается в трех повторностях.

5.2.4 Учет и анализ результатов

При проведении токсикологических опытов регистрируются следующие показатели:

основные:

а) выживаемость личинок;

б) сроки их окукливания;

в) сроки и процент вылетевших комаров;

г) процент уродливых особей.

дополнительные:

а) окраска личинок;

б) их поведенческие реакции;

в) вес;

г) активность имаго.

Среди погибших имаго встречаются насекомые, которые не смогли высвободиться из экзувия или при выходе из него повредили конечности или крылья. Часто встречаются имаго с уродствами, обусловленными действием токсических веществ, в частности кровоизлиянием в области брюшка, крыльев или общим кровоизлиянием. Такие экземпляры с трудом высвобождаются из экзувия. При выходе они еще больше раздуваются, происходит выпячивание отдельных участков тела между хитиновыми пластинками в области брюшка с последующим их разрывом.

У некоторых особей под действием токсичных веществ кишечник выпадает наружу. Вес личинок регистрируется на 7-е и 10-е сутки опыта.

Наблюдения за организмами ведутся ежедневно. Дрожжевые домики вскоре становятся непроницаемыми, и наблюдения ведутся в основном за пораженными особями, которые обычно остаются в домиках. Особое внимание обращают на форму домиков, поведение организмов, окраску тела, стадию, готовность к линьке и окукливанию, наполнение кишечника. Погибших особей измеряют и рассматривают под бинокуляром.

Размеры живых зрелых куколок и имаго в опыте и контроле можно оценивать визуально. Здоровые особи, как правило, не покидают домиков даже на небольшой срок. Сравнивают линейные размеры погибших особей с их первоначальной длиной и имеющимися в литературе нормативами роста для хирономид.

Для оценки острого летального действия можно использовать два способа:

а) определение концентраций, вызывающих гибель за определенный срок 50% особей, взятых в опыт;

б) определение медианного летального времени для ряда концентраций, а по форме кривой - границы между остролетальными и хронически летальными концентрациями.

В течение длительных опытов учитывают и основные, и дополнительные показатели, указанные выше. Выживаемость всех стадий выражают в процентах с поправкой по Абботу. Личинок взвешивают на торзионных весах на 7-е и 10-е сутки опыта. Удельный прирост биомассы определяют по формуле:

,

где: и - вес в начале и в конце опыта соответственно.

Личинок после взвешивания в опыте не используют из-за травмирования, а эксперименты продолжаются с особями двух других линий той же популяции.

Регистрируют сроки вылета насекомых (в сутках) и проводят статистическую обработку данных.

По окончании опыта все полученные данные сводят в таблицу согласно форме 7.

6.1.1. Вводные замечания

Контролируются эмбриональное развитие рыб в исследуемой воде, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Из литературных источников и из опыта нормирования известно, что эмбрионы рыб и предличинки более чувствительны к токсическому воздействию по сравнению со взрослыми особями.

В настоящих Методических указаниях описан порядок работы с аквариумной рыбкой данио рерио, но наряду с этим видом могут быть использованы вьюн, осетр, форель и др.

6.1.2. Характеристика тест-объекта

В качестве тест-объекта для определения ПДК вещества по эмбриональному развитию удобно использовать икромечущую аквариумную рыбу данио Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), поскольку материал для исследования можно получать в течение всего года, независимо от периодичности работы рыбоводных заводов. В природе данио обитает в медленно текущих водных объектах Юго-Восточной Азии. Длина взрослых рыб до 4,5 см. Тело цилиндрической формы, серебристое с 7-9 темно-синими горизонтальными полосами. Полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина окрашена в оливково-зеленый цвет.

6.1.3. Условия лабораторного содержания

Для содержания рыб-производителей могут быть использованы аквариумы объемом от 25 , заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22°С. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, отмытый трубочник).

Для получения икры самок и самцов отделяют друг от друга и кормят живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. В конце второй недели самцы приобретают густой золотистый блеск, а брюшко самок значительно увеличивается в объеме за счет икры. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливают и помещают в нерестовый аквариум.

Нерестовый аквариум наполняют свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27°С и рН 6,8-6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.

В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2-3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света.

Обычно выклев у данио завершается через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.

6.1.4. Проведение исследований

Для определения ПДК вещества на эмбрионах и личинках рыб ведут наблюдение за эмбриональным развитием данио и выклевом предличинок в контроле и исследуемых концентрациях веществ. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри. В каждую чашку с отстоянной водой (контроль) и с исследуемыми растворами помещают по 10 икринок. Концентрации исследуемого вещества готовят с шагом либо на порядок, либо в арифметической прогрессии, ориентируясь на максимальные допустимые концентрации вещества, полученные в опытах на других организмах. Исследование каждой концентрации проводится в трехкратной повторности.

Выклюнувшиеся предличинки помещаются по 10 штук в контрольную и тестируемую воду. Наблюдение ведется, как и в первом случае, в чашках Петри, которые должны находиться в термостатируемых условиях. Длительность эксперимента определяется переходом личинок на активное питание.

6.1.5. Учет и анализ результатов

Основными показателями токсичности вещества являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры, тератологический анализ. В качестве дополнительных показателей эмбриотоксикологической оценки влияния исследуемых, веществ могут служить биохимические исследования (например, липидный и белковый обмен у эмбрионов и предличинок рыб).

В опытах через каждые 6 ч учитывают состояние тест-объекта и ход выклева. Учитывается оплодотворение икры, а также гибель и морфологические изменения у эмбрионов в процентах по отношению к контролю.

Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся, которые остаются прозрачными.

Становятся белыми также и погибшие эмбрионы вследствие коагулирования белка. Гибель эмбрионов бывает наибольшей в начале и в конце эмбрионального периода.

Выклев - наиболее чувствительный и важный этап, завершающий эмбриональное развитие у рыб. Эмбрионы, достигшие стадии выклева, в результате действия токсичного агента часто оказываются неспособными выйти из оболочек и погибают. Важным показателем является распределение выклева на весь период эмбрионального развития. Если под влиянием токсикантов нарушается эмбриональное развитие, то максимум выклева смещается по сравнению с контролем или растягивается во времени.

Морфометрические исследования лучше всего проводить на выклюнувшихся предличинках. У эмбрионов вредные воздействия веществ могут вызывать морфологические изменения, которые, служат в качестве интегрального показателя эффекта действия вещества. Появление уродств свидетельствует о тератогенном действии. Уродливые эмбрионы, погибшие во время эмбрионального развития, включаются в число погибшей икры, а средний процент уродств подсчитывается после выклева и прохождения стадий предличинки.

Личинки, которые способны нормально плавать и переходят на активное питание, считаются выжившими. Нормальными считаются особи, не имеющие морфологических отклонений и не отличающиеся размерами от контрольных.

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для ранних стадий онтогенеза рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок, увеличения числа особей с дефектами развития или отставания личинок в размерах и темпах развития.

6.2.1. Характеристика тест-объекта

В экспериментах используются мальки, сеголетки, годовики отдельных видов рыб с разной чувствительностью (п. 6 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). При отсутствии достаточного количества промысловых рыб и условий их содержания, целесообразно проводить опыты на "сорных" рыбах с высокой и средней чувствительностью к токсическим веществам, например верховках и пескарях, а также использовать аквариумных рыбок, например данио. Выбор других рыб в качестве тест-организмов должен быть обоснован литературными и экспериментальными данными.

6.2.2. Условия лабораторного содержания

Для исследований подбирают некрупных одноразмерных рыб в хорошем физиологическом состоянии из водных объектов Рыб транспортируют на специально оборудованном транспорте с регулируемой подачей кислорода. При длительных перевозках необходим постоянный контроль за кислородным режимом и температурой воды, так как при резких перепадах гидрохимических показателей возможна значительная гибель перевозимой рыбы. При кратковременных перевозках можно использовать молочные бидоны или полиэтиленовые мешки, не допуская травмирования рыбы и резкого снижения содержания кислорода в воде.

В аквариальных условиях привезенную рыбу рассаживают в специально оборудованные проточные лотки, ванны или бассейны. Вода в данных емкостях должна быть одинаковой температуры с температурой воды в перевозимых емкостях.

При содержании рыб необходимо поддерживать оптимальный водообмен в емкостях из расчета 1-1,5  воды в сутки на 1 кг лососевых рыб и 0,5-1  на 1 кг карповых рыб. Если нет условий для осуществления постоянного протока воды, необходимо проводить смену ее в емкостях с рыбой, исходя из содержания кислорода в воде. Для лососевых рыб содержание растворенного кислорода в воде должно быть не ниже 9,5-10,5 , а для карповых - не менее 6-8 .

После помещения рыб в емкости, в течение 10 дней (при постепенной адаптации рыб к аквариальным условиям) проводят контроль за температурой и кислородом в емкостях, проводя измерения два раза в день. Для обогащения воды кислородом рекомендуется применять принудительную аэрацию, а для повышения до необходимого уровня температуры - аквариумные водонагреватели с датчиками.

Для кормления рыб используют пастообразные, гранулированные или живые корма из расчета от 0,8 до 5% к весу тела рыб. Емкости, используемые для содержания рыб, необходимо ежедневно очищать от скапливающихся остатков корма и фекальных масс.

Помещение аквариальной должно быть оборудовано стеллажами с аквариумами или ваннами.

Из другого оборудования необходимо иметь:

холодильные установки для хранения корма и реактивов;

весы аналитические с разновесами;

весы аптекарские (чашечные и ручные);

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

лупу;

электромешалку;

вентиляторы;

ведра эмалированные;

бидоны;

тазы и кюветы разных размеров;

фотоаппарат;

сачки разноячейные;

покрытия из мелкоячейной сети, газа или дели для емкостей с рыбой;

микрокомпрессоры;

аквариумные водонагреватели с датчиками;

скальпели, пинцеты, ножницы, шприцы на 1 - 20 мл, инъекционные иглы;

секундомер, линейки;

набор инструментов и реактивов для исследования крови;

стеклянную посуду емкостью от 0,1 до 3 л, мерные пипетки, глазные пипетки, бюретки, мерные стаканы, колбы, чашки Петри, стеклянные трубки и палочки;

резиновые шланги разного диаметра и длины, резиновые груши;

полиэтиленовую пленку, клеенку, марлю, халаты, резиновые фартуки, сапоги и перчатки;

карандаши по стеклу, лейкопластырь, фиксирующие и дезинфицирующие жидкости;

журналы для записей и прочие необходимые материалы и инструменты.

6.2.3. Проведение исследований

Перед началом экспериментов рыб помещают в аквариумы или другие экспериментальные емкости на 7-10 суток с целью адаптации к новым условиям. Опыты проводят на двух-трех видах рыб из различных семейств (желательно хищных и мирных) и выявляют рыб с высокой чувствительностью к токсиканту путем определения , и в острых опытах длительностью 96 ч. Хронические опыты начинают с концентрации, равной 1/2 за 96 ч, и создают токсикологический ряд из 5-10 убывающих концентраций вещества с множителем 1/2. Длительность хронических опытов составляет 1-3 месяца. В зависимости от стабильности исследуемого вещества в воде.

Эксперименты проводят в стеклянных аквариумах или пластмассовых ваннах емкостью 20-40  в двукратной повторности с использованием 6-10 особей в каждой концентрации вещества. Два аквариума служат контролем.

Норма посадки молоди, сеголеток и годовиков лососевых и сиговых рыб в экспериментальные емкости для проведения опытов должна быть не более 1 г ихтиомассы на 1  воды в сутки. Для рыб возрастом более года, а также для карповых рыб, эта величина составляет не более 3 г на 1 воды в сутки.

Взвешивание рыб производят перед началом опытов, затем через каждые 10-15 суток до их окончания. Для этого на весы ставят сосуд емкостью 2-2,5 , в который наливают 0,5-1  воды и уравновешивают его с помощью гирь или другого сосуда с водой. Затем отловленных сачком рыб быстро помещают в сосуд с водой для взвешивания, предварительно осушив низ сачка от избытка влаги марлей. Мальков взвешивают с помощью химических стаканов на аптекарских или других более точных весах.

Для опытов используется незагрязненная вода из природных водных объектов или водопроводная дехлорированная вода, отстоянная в течение трех суток. Ежедневно измеряется температура воды, и один раз в 10 суток проводятся гидрохимические исследования за содержанием растворенного в воде кислорода и рН.

В зависимости от стабильности исследуемого вещества смену воды в опытных емкостях проводят один раз в 1-3-е суток, спустя 1,5-2 ч после кормления рыб. При этом недопустимо травмирование рыб. Аэрация воды возможна лишь в тех случаях, когда состав и концентрация исследуемого вещества не изменяются. Толщина слоя воды в аквариуме для сеголеток и годовиков должна быть не менее 20 см, для более крупных рыб ее следует увеличивать.

В аквариумах должна постоянно поддерживаться оптимальная для исследуемого вида температура воды.

При кормлении необходимо учитывать видовые и возрастные особенности питания рыб. Используют рыбные комбикорма, говяжью и свиную селезенку в смеси с комбикормами, а также живые корма - дафнии, хирономиды, гаммарусы и др.

Схема и динамика проведения опытов, учет регистрируемых показателей ведется в лабораторном журнале.

Опыты по определению параметров острой и хронической токсичности веществ, по установлению коэффициентов кумуляции ставят на мальках или сеголетках. После этого ставят острые и хронические опыты на сеголетках или двухлетках для определения их токсичности по физиолого-биохимическим показателям, используя среднесмертельные, максимально переносимые и более низкие концентрации для установления пороговых.

6.2.4. Учет и анализ результатов

     Коэффициент кумуляции

        остр   остр   хр    хр

К   = ЛК    х S    /ЛК   х S

 кум    50            50

7.2.1. Характеристика тест-объекта

Наиболее удобными, быстрыми и экономичными способами выявления мутагенной активности являются методы с использованием бактерий. Широкое применение находит тест-система с использованием бактерии сальмонелла тифимуриум (Salmonella typhimurium) (Таблица 7.2.1.). Эти методы основаны на аналогичности генетических механизмов повреждения и репарации ДНК у клеток низших и высших организмов.

Таблица 7.2.1.

Штаммы S. typhimurium, используемые для выявления мутагенной активности соединений

Примечание: "+" - обозначение генов дикого типа; rfa - нарушение липополисахаридной капсулы; urvB - нарушение системы эксцизионной реакции; RPS - сдвиг рамки считывания; R-BPS - замена пар оснований.

Сущность использования системы "бактерии-микросомы" заключается в определении способности вещества или его метаболитов индуцировать генные мутации у подопытных штаммов. Если исследуемое вещество (или его метаболиты) обладают мутагенной активностью, то увеличивается количество колоний - ревертантов на чашку Петри в опыте по сравнению с контролем. Под влиянием мутагенных веществ у микроорганизмов - ревертантов происходят обратные мутации, и они приобретают способность жить на среде, лишенной гистидина или другой аминокислоты, по которой отобран тот или другой штамм.

Для выявления промутагенов производят микросомальную активацию, после которой промутагены проявляют мутагенные свойства. Методы приготовления микросомальных ферментов из гепатопан-креаса карпа или других рыб приводятся ниже.

При определении мутагенной активности веществ, нормируемых для воды рыбохозяйственных водных объектов, целесообразно использовать микросомы именно из тканей рыб, а не теплокровных животных, так как экстраполяция результатов, полученных с применением микросом печени теплокровных животных, не всегда оправдана при установлении ПДК веществ вследствие неадекватности протекания метаболических процессов у различных видов животных.

7.2.2. Проведение исследований

7.2.3. Проведение исследований

Чашки Петри заливают минимальной средой и выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Полужидкий полуобогащенный агар расплавляют и помещают в термостатируемую водяную баню (46°С) на 20 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,1 мл культуры тест-штамма, 0,2 мл раствора исследуемого вещества определенной концентрации и 0,5 мл микросомальной реактивирующей системы. Полученную смесь сразу же перемешивают и выливают на поверхность чашки. Верхний агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара тонким слоем. Вся процедура в целом занимает не более 20 секунд. Затем дают агару застыть и инкубируют при 37°С двое суток. Через два дня отмечают колонии гистидиновых ревертантов. Чтобы выяснить, нуждается ли исследуемое вещество в предварительной активации, имеет смысл проводить исследования как в присутствии, так и в отсутствии микросомальной активирующей системы, содержащей фракцию Sg.

Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие:

а) только культуру бактерий и растворитель;

б) культуру бактерий, растворитель и микросомальную активирующую систему, содержащую фракцию Sg;

в) культуру бактерий с добавлением мутагенов и промутагенов, указанных выше (п. 7.2.2.1., Реактивы):

для штамма ТА 100 - цилофосфамида - 500 мкг на чашку;

для штамма ТА 98 - бенз-а-пирена -10 мкг, 9-аминоакридина - 10 мкг на чашку.

В качестве промутагенов для штаммов ТА 98 и ТА 100 используются 2-ацетиламинофлуоредин и 2-аминофлуорен соответственно.

Степень мутагенного эффекта определяют по кратности превышения числа колоний реверантов при данной дозе над таковым в контроле. При сравнении числа колонии на опытных и контрольных чашках могут быть получены следующие результаты, представленные в таблице 7.2.2.

Таблица 7.2.2.

Учет мутагенности

Методы статистической обработки полученных результатов приведены в приложении 4 данных Методических указаний.

7.3.1 Определение хромосомных аберраций в эпителии хрусталика глаза рыб

7.3.2 Определение частоты хромосомных аберраций в клетках жаберного эпителия рыб

Исследования проводят с аквариумной рыбой нотобранхиус (Nothobranchius rachovi) Метод позволяет учитывать частоту структурных нарушений хромосом на стадии метафазы и предполагает более полную оценку аберраций в качественном и количественном отношениях.

7.4.1. Проведение исследований

7.5.1. Характеристика тест-объекта

С целью выявления тест-реакции на индукцию микроядер можно использовать покровный эпителий гуппи.

Применение метода обосновано тем, что во время деления клеток ацентрические фрагменты хромосом и отставшие хромосомы не входят в дочерние ядра, а формируют в цитоплазме одно и реже два ДНК-содержащих образования, получивших название микроядра. Микроядра представляют собой округлые образования в цитоплазме, имеющие темную окраску, сходную с окраской ядер исследуемых клеток. Размеры микроядер изменяются от 1/5 до 1/20 размера ядра.

7.5.2. Оборудование и материалы

аквариумы емкостью 5 л;

микрокомпрессоры;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

чашки Петри;

покровные и предметные стекла, пипетки объемом 1-5 мл;

препаровальные иглы;

микроскальпели;

глазные пинцеты;

счетчик для подсчета форменных элементов крови.

7.5.3. Проведение исследований

Для выявления микроядер используют те же методики, что и для выявления хромосомных аберраций (п. 7.3.1 Раздела 7). В препаратах определяют количество клеток с микроядрами на 1 тыс. подсчитанных клеток и выражают их число в процентах.

При этом учитывают на временно окрашенных препаратах появление микроядер в клетках эпителия в опыте и контроле.

7.5.4. Учет и анализ результатов

Критерием генотоксичности вещества является статистически достоверное увеличение числа клеток, содержащих микроядра в опытных препаратах по сравнению с контролем.

7.6.1. Характеристика тест-объекта

Исследования проводятся на политенных хромосомах в слюнных железах предкуколки хирономид. В качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид - хирономус тами и хирономус плумозус (Chironomus thummi и Ch. Plumosus). При исследовании вещества в соленой воде в качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид (Chironomus sp.) из азовских лиманов, адаптированная к солености 20. В результате проведения работы выявляется действие веществ на структуру интерфазных хромосом и на дифференциальную активность проявления пуффинга в процессе метаморфоза личинки в куколку.

7.6.2. Оборудование и материалы

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;

тонкий пинцет;

препаровальные иглы;

предметные и покровные стекла;

кисточка;

фильтровальная бумага;

краситель ацетоарсеин (0,5% арсеина в 45%-ной уксусной кислоте);

среда для заливки (краситель, разведенный в соотношении 1:3 45%-ной уксусной кислотой);

7.6.3. Проведение исследований

Определение генотоксичности химических соединений и их действия на дифференциальную активность генов проводят на предкуколке, развитие которой наблюдается с 36-го по 38-й день при температуре 20-25°С. Стадия предкуколки характеризуется набуханием грудных сегментов, укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек. Метаморфоз проходит в 6-й, 7-й, 8-й и 9-й фазах развития. Изменение цвета тела с красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза.

Для синхронизации развития и отбора хирономид в эксперименте заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе четвертого возраста, перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Отбирают личинок, у которых красный цвет головы меняется на темно-коричневый, и затем ждут момента набухания грудных сегментов и укорачивания тела. Препараты политенных хромосом из слюнных желез получают следующим образом. Личинку помещают на фильтровальную бумагу для обсушивания, затем переносят на предметное стекло, тонко отточенным пинцетом берут за мандибулы и тянут, отрывая голову. Вместе с головой из тела вытягивается кишечник, по бокам которого видны слюнные железы, прикрепленные к голове протоками. Препаровальными иглами слюнные железы отделяют от остальных тканей и окрашивают их в течение 10-15 мин ацетоорсеином. После окрашивания слюнные железы изымают из красителя и помещают на чистое предметное стекло. На покровное стекло наносится капля среды для заливки. Покровное стекло переворачивают так, чтобы капля покрыла слюнные железы. На покровное стекло помещают кусочек фильтровальной бумаги и большим пальцем, без сдвигов в стороны, клетки слюнных желез раздавливают. Среда для заливки, выступившая из-под покровного стекла, впитывается в фильтровальную бумагу. Затем бумагу удаляют, а края покровного стекла смазывают бесцветным лаком. Благодаря лаку, препарат предохраняют от высыхания.

7.6.4. Учет и анализ результатов

Генотоксичность вещества оценивается по нарушению структуры политенных хромосом (возможны разрывы, распад концов и дезинтеграция) и по нарушению пуфинга во время метаморфоза. Отмечается следующее образование пуфов в норме. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается в размерах на 7-й и 8-й фазах развития. На второй хромосоме 2Азв постепенно сужается, а пуф 2Азе увеличивается на каждой последующей фазе. На 8-й фазе появляются 2 пуфа 2Д2де и пуф 2Г2. На третьей хромосоме на 6-й и 7-й фазах имеется пуф 3Дih, а после 7-й фазы появляется пуф 3Дif, который отмечается до конца метаморфоза. На четвертой хромосоме видны тельца Бальбиани, которые резко увеличиваются на 8-й фазе. Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро исчезающий пуф 4Дс.

При действии некоторых токсикантов у личинок насекомых, имеющих политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов.

8.1.1. Примеры расчета ОБУВ

8.2.1. Исследования на водорослях

Целесообразно проведение 7-суточных исследований действия вещества на рост культуры водорослей (п. 1.4 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям). В качестве альтернативы возможно полное проведение хронического эксперимента с одноклеточными водорослями в течение 14 суток.

В конце опытов оценивается статистическая достоверность отклонений опытных данных от контрольных.

Условия культивирования водорослей и постановки токсикологических исследований с ними приведены в п.п. 1.3. и 1.4 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям.

8.2.2. Исследование на зоопланктонных организмах

Исследования проводятся на односуточных дафниях около 20 суток, что определяется временем появления трех пометов у контрольных дафний, или на односуточных цериодафниях в течение 7-8 суток, когда у рачков появляется 3-й помет.

Постановка токсикологических исследований изложена в п.п. 4.1.4. и 4.2.3. Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям.

8.2.3 Исследования на эмбрионах и личинках рыб

8.2.4 Исследования изменений санитарных показателей водной среды

Определение величины временного норматива

Из концентраций, выведенных в процессе исследований в качестве максимальных допустимых для каждого из объектов исследования, выбирается наименьшая, которая и рассматривается в качестве временного норматива вещества - ориентировочного безопасного уровня воздействия (ОБУВ вещества).