Инструкция по применению набора для выявления антител к антителу gE вируса болезни Ауески иммуноферментным методом "Ауески gЕ - СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - АНО "НИИ ДПБ", г. Москва) (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному контролю от 26 июня 2008 г. N ПВР-1-3.8/02156)

I. Общие сведения

1. Набор для выявления антител к антигену gЕ вируса болезни Ауески иммуноферментным методом "Ауески gЕ - СЕРОТЕСТ".

2. Состав набора:

1). Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках гликопротеином gЕ ВБА - 2 штуки;

2). Положительный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 0,5 мл - 1 пробирка;

3). Отрицательный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 0,5 мл - 1 пробирка;

4). Моноклональные антитела к антигену gЕ вируса болезни Ауески, меченные пероксидазой хрена (Конъюгат), прозрачная жидкость от голубого до синего цвета, 22 мл, 1 флакон;

5). 20-кратный концентрат буферного раствора для промывки планшетов (ФСБТ), бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 3 флакона;

6). Буфер для разведения сывороток (БР), бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 1 флакон;

7). Субстратный раствор (СР), бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 1 флакон;

8). Стоп-раствор, бесцветная прозрачная жидкость, 25 мл - 1 флакон.

3. Набор "Ауески gE-СЕРОТЕСТ" предназначен для выявления специфических антител к антигену gЕ вируса болезни Ауески (ВБА) иммуноферментным методом (ИФА) с целью дифференциации вакцинированных маркированной вакциной от инфицированных свиней. Набор рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сыворотки крови и двух контрольных проб (в 2-х повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

4. Упаковка и маркировка

Компоненты набора выпускают во флаконах и пробирках с крышками. На флаконы или пробирки с каждым компонентом наклеивают этикетки с указанием: наименования и товарного знака организации-производителя, краткого названия набора, краткого названия компонента, его номера и количества во флаконе (согласно п. 2 инструкции), номера серии набора, номера контроля, срока годности (месяц, год). На пакет с полистироловым планшетом наклеивают этикетку с указанием организации-производителя и ее товарного знака, краткого названия набора, названия компонента, номера серии и контроля набора, срока годности (месяц, год).

На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают: наименование и товарный знак организации-производителя, полное название набора, номер серии и контроля, срок годности (месяц, год), условия хранения, обозначение СТО и надпись "для животных"; в коробку вкладывают инструкцию по применению набора.

Примечание: В наборе содержатся все необходимые для проведения анализа реактивы, за исключением дистиллированной воды. В качестве дополнительного оборудования необходимы микропипетки на 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, суховоздушный термостат с температурой 37°С, спектрофотометр с длиной волны 450 нм.

5. Срок годности компонентов набора - 12 месяцев с даты изготовления при условии хранения и транспортирования их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов! Флаконы без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета подлежат выбраковке. Микропанели и контрольные сыворотки обеззараживают 3% раствором хлорамина. Остальные компоненты набора не требуют специальных мер утилизации. Запрещено использовать наборы по окончании срока годности.

II. Принцип метода

6. Метод основан на конкурентном взаимодействии конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител к эпитопу gЕ гликопротеина ВБА и сывороточных специфических антител с иммобилизованным на поверхности иммунологического планшета гликопротеином gЕ.

При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител, моноклональный конъюгат свободно взаимодействует с иммобилизованным gЕ и после добавления субстрата и хромогена в лунке развивается окраска. Если исследуемая сыворотка содержит специфические антитела, то происходит их взаимодействие с иммобилизованным gЕ, его частичная или полная блокировка, в результате чего связывание антител конъюгата с антигеном не происходит, или происходит частично и, соответственно, окрашивание отсутствует или интенсивность окраски снижается. Таким образом, интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству антител в исследуемой сыворотке.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

II. Порядок применения

7. Подготовка биологического материала

Для анализа используют сыворотку крови свиней. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре минус 20°С. Перед исследованием замороженные образцы в течение 5-10 мин нагревают в водяной бане при температуре 37°С.

В случае выпадения осадка в пробах сыворотки крови их обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000д.

Не рекомендуется исследование проросших и гемолизированных сывороток, а также многократное замораживание и оттаивание образцов сыворотки крови.

8. Подготовка рабочих растворов

8.1. Перед началом работы все реагенты выдерживают 30 мин при комнатной температуре (20-25°С).

8.2. Рабочий раствор буфера для промывания планшетов (ФСБТ). Содержимое флакона N 5 разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. Пример: для получения 500 мл рабочего раствора ФСБТ к 25 мл концентрата добавляют 475 мл воды. Следует иметь в виду, что для обработки одного стрипа требуется примерно 30 мл рабочего раствора. Рабочий раствор ФСБТ стабилен при температуре 4°С в течение 3 суток. Для более длительного хранения раствор замораживают и хранят при температуре минус 20°С.

8.3. Все остальные компоненты набора готовы к применению.

Внимание. При неоднократном использовании компонентов набора контрольные сыворотки рекомендуется расфасовать по 120 мкл в отдельные пробирки типа Эппендорф и хранить до следующего анализа при температуре минус 20°С.

Другие компоненты, оставшиеся после частичного использования, должны храниться плотно закрытыми в заводской упаковке. Запрещено переливать в другую посуду и смешивать компоненты из наборов разных серий!

9. Проведение анализа

9.1. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл буфера для разведения сывороток (БР).

В лунки А1-В1 и C1-D1 вносят по 50 мкл контрольных проб ( и ).

В остальные лунки планшета вносят по 50 мкл исследуемой сыворотки (по две лунки на каждый образец сыворотки). При внесении образцов в лунки содержимое тщательно перемешивают пипетированием.

Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре (20-25°С) или ночь при 4°С.

9.2. Планшет 3 раза промывают рабочим раствором ФСБТ, подготовленным по п. 8.2., доверху заполняя лунки и каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

Внимание. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется перед началом работы промаркировать каждый стрип для восстановления их первоначального расположения.

9.3. В каждую лунку добавляют по 100 мкл конъюгата.

Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 30 мин при комнатной температуре (20-25°С).

9.4. Планшет 4 раза промывают рабочим раствором ФСБТ (см. этап 9.2).

9.5. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл субстратного раствора. Планшет инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре в темном месте.

9.6. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку по 100 мкл стоп-раствора.

9.7. После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм ().

10. Учет и интерпретация результатов

10.1. На первом этапе проводят оценку средних значений отрицательного и положительного контролей, входящих в состав набора. Результаты реакции считаются достоверными и могут быть учтены, если контрольные показатели соответствуют следующим критериям:

;

.

Если полученные значения не соответствуют вышеуказанным критериям, результаты ИФА считают недостоверными и реакцию повторяют. Если отрицательного и положительного контролей соответствуют вышеуказанным критериям, далее проводят оценку результатов реакции в лунках с испытуемыми образцами.

10.2. Вычисляют отсекающие значения (Cut off), необходимые для правильной интерпретации результатов:

Положительный

Отрицательный

10.3. Вычисляют среднее значение для каждой опытной пробы ().

10.4. Проводят интерпретацию результатов:

Пробу считают положительной, если ниже, чем положительный Cut off.

Проба считается отрицательной, если выше, чем отрицательный Cut off.

Пример расчета содержания антител к антигену gЕ ВБА в испытуемых образцах:

Контрольные показатели: отрицательного контроля - ;

положительного контроля - .

Все показатели соответствуют требуемым критериям:

, т.е. > 0,8;

, т.е. < 0,3.

Положительный Cut off = 1,595 - [(1,595 - 0,067) х 0,4] = 0,985

Отрицательный Cut off = 1,595 - [(1,595-0,067) х 0,35] = 1,065

опытных проб: N 1 = 0,198 и N 2 = 1,461

Интерпретация результата:

Исследуемая проба сыворотки крови N 1 содержит антитела к gЕ ВБА (положительная реакция), что свидетельствует об инфицировании животного или о проведенной вакцинации традиционной (немаркированной) вакциной. В сыворотке крови N 2 специфических антител нет (отрицательная реакция), что свидетельствует либо об отсутствии антител, либо о проведенной вакцинации маркированной по gЕ вакциной.

Пробы, значения которых, находятся между положительным Cut off и отрицательным Cut off, считают сомнительными и рекомендуется их исследовать повторно спустя 2 недели.

IV. Меры личной профилактики

11. Работу с компонентами набора следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть это место большим количеством водопроводной воды.

12. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.

13. Набор следует хранить в местах, недоступных для детей.

Инструкция разработана АНО "НИИ ДПБ" совместно с фирмой INGENASA (Испания). Юридический адрес: 109518, г. Москва, Грайвороновский 1-ый проезд, д. 2а. Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

Рекомендовано к регистрации и применению "ФГУ ВГНКИ".

Заместитель Руководителя Россельхознадзора

Н.А. Власов