Приложение 1. Специфическая лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки

Приложение 1

к приказу комитета здравоохранения

Волгоградской области

от 31.03.2015 N 973

ГАРАНТ:

По-видимому, в грифе настоящего приложения и далее по тексту допущена опечатка, номер названного приказа следует читать как N 974

Специфическая лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки

Лабораторные исследования клинического, секционного и полевого материала при подозрении на КГЛ проводятся лабораториями, имеющими разрешение на работу с материалом, зараженным или подозрительным на заражение микроорганизмами II-IV групп патогенности.

Все работы с материалом, подозрительным на заражение возбудителем КГЛ, включая забор, транспортировку и подготовку материала для лабораторных исследований, проводятся в соответствии с законодательством Российской Федерации, регламентирующим деятельность с возбудителями II-IV групп патогенности.

Лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) проводится молекулярно-биологическими, серологическими и вирусологическими методами.

Исследование материала от больных КГЛ проводят: серологическим методом - твердофазный иммуноферментный анализ (далее - ТИФА), молекулярно-генетическим методом - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (далее - ОТ-ПЦР) и вирусологическим методом.

При проведении лабораторной диагностики КГЛ исследуют:

- от больных людей: цельную кровь, плазму, сгусток крови, сыворотку крови;

- от умерших людей: печень, легкие, селезенку, почки, головной мозг.

Клинический диагноз КГЛ считают подтвержденным в случаях:

- выделения вируса ККГЛ из крови больного;

- выявления РНК вируса ККГЛ в клиническом материале, взятом на ранних сроках заболевания (в первые 5-7 дней);

- обнаружения антител класса Ig М в сыворотке крови в титре 1:800 и более (Ig М появляются в крови на 5-7-й день болезни и достигают максимальных титров на 2-3 неделе);

- четырехкратного нарастания титра антител (Ig G появляются на 7-10-й день болезни) при исследовании парных сывороток крови на наличие антител класса Ig G.

Вирус ККГЛ (РНК вируса ККГЛ) и его антиген обнаруживаются в крови больного до 5-7, иногда, до 10-ого дня болезни. Специфические антитела иммуноглобулины класса М к вирусу КГЛ начинают выявляться у больного с 7-10 дня болезни.

Отбор проб и транспортировка биологического материала от больных людей (трупов)

Организация отбора проб и транспортировка биологического материала от людей (трупов) для лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки осуществляется в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.11.2013 N 64, методических указаний МУ 3.4.2552-09 "Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17.09.2009 и МУК 4.2.3007-12 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней", утвержденных Роспотребнадзором 28.03.2012, МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории", утвержденных Роспотребнадзором 23.12.2005.

Забор материала для лабораторного подтверждения Крымской геморрагической лихорадки производится

- для обнаружения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса ККГЛ полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией и антигена вируса ККГЛ до 5-7 дня болезни;

- для определения уровня антител и нарастания уровня антител: первый забор - до 7 дня болезни, второй забор - на 10-14 сутки болезни и при необходимости позже.

Общие требования к забору проб биологического материала.

Для предохранения от инфицирования при заборе проб биоматериала и доставке их в лабораторию медицинский работник должен соблюдать следующие требования:

- не загрязнять наружную поверхность посуды при заборе и доставке проб;

- не загрязнять сопроводительные документы (направления);

- свести к минимуму непосредственный контакт пробы биоматериала с руками медицинского работника, забирающего и доставляющего пробы в лабораторию;

- использовать стерильные одноразовые или разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке контейнеры (емкости) для забора, хранения и доставки проб;

- транспортировать пробы в переносках или укладках с раздельными гнездами;

- соблюдать асептические условия в процессе выполнения инвазивных мероприятий для предотвращения инфицирования пациента;

- забирать пробы в стерильную посуду, незагрязненную биоматериалом, не имеющую дефектов.

Отбор проб от больных и подозрительных на заражение вирусом ККГЛ осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима. Необходимо использование защитного костюма I типа.

Каждую пробирку маркируют и оформляют направление с указанием фамилии, имени, отчества больного, возраста, даты начала заболевания, вида материала и времени и даты его забора и помещают вместе с направлением в первичную герметичную емкость для транспортировки.

На каждую отправляемую в лабораторию пробу от больного КГЛ или с подозрением на эту инфекцию заполняют направление N 1. На пробы секционного материала (умершего от КГЛ или с подозрением на эту инфекцию) заполняют направление N 2.

Направляемую пробу (пробы) сопровождают письмом на имя руководителя учреждения, в котором указывают вид направляемого материала, количество образцов и цель исследования; письмо подписывает руководитель направившего учреждения.

Забор крови на обнаружение РНК вируса КГЛ методом ПЦР производится натощак из локтевой вены в объеме 4,5 мл одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц или специальную вакуумную систему типа "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuettr" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА).

Взятую в шприц кровь аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используется 3,8% раствор цитрата Na или 6% раствор ЭДТА. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Соотношение крови и антикоагулянта составляет при использовании 6% раствора ЭДТА 1:20 и при 3,8% раствора цитрата Na - 1: 9), т.е. на 4,5 мл крови используется 0,5 мл антикоагулянта.

Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (8-10 раз) для перемешивания с антикоагулянтом.

Образцы цельной крови до транспортировки в лабораторию могут храниться при температуре 2-8°С - в течение 6 часов с момента взятия материала.

Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

Образцы (кровь, биоптаты и др.) должны быть доставлены в лабораторию для проведения ПЦР в день взятия материала.

Забор крови для серологической диагностики отбирают из локтевой вены в стерильную пробирку в количестве 5-10 мл, соблюдая правила асептики. Для предотвращения гемолиза, сыворотку следует отделить от сгустка. Для этого пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре в наклонном положении до образования сгустка, сгусток крови обводят стеклянной палочкой и помещают в холодильник при температуре +4°С на 10 часов. Полученную сыворотку отсасывают пипеткой с резиновой грушей в пластиковую одноразовую пробирку, герметично закрывают и направляют в лабораторию для исследования на наличие специфических антител и переносят в пластиковую пробирку с плотно закрывающейся (завинчивающейся) пробкой. Пробирка этикетируется. Этикетка делается из лейкопластыря и наклеивается на пробирку. На этикетке указываются фамилия, имя, отчество больного, вид материала, дата взятия.

Допустимо сыворотку крови хранить в стерильных пробирках при температуре +4°С в течение 5 дней.

В случае летального исхода при наличии анамнеза, клинических данных и результатов лабораторных исследований, подтверждающих КГЛ, труп с учетом высокого риска заражения персонала вскрытию не подлежит.

При наличии анамнестических и клинических признаков КГЛ без подтверждения диагноза лабораторными исследованиями труп подлежит патолого-анатомическому вскрытию с применением средств индивидуальной защиты (противочумный костюм I типа, дополненный фартуком, второй парой резиновых перчаток и нарукавниками) и соблюдением мер личной безопасности в соответствии с требованиями действующих методических указаний по организации и проведению первичных мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевание карантинными инфекциями, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками, малярией и инфекционными болезнями неясной этиологии, имеющими международное значение. Забор секционного материала при вскрытии умерших от КГЛ, а также лиц с подозрением на данную инфекцию (умерших от лихорадки неясного генеза в эндемичных по КГЛ территориях) проводит патологоанатом или судмедэксперт в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям с соблюдением регламентированных требований биологической безопасности при работе с патогенными биологическими агентами I-II групп. Секционный материал отбирают для исследования методом ПЦР, в случае необходимости - для вирусологического исследования.

Отбор секционного материала производится из глубины внутренних органов (сердце, печень, легкие, селезенка, почки, головной мозг) стерильно вырезают кусочки ткани размерами 2-3 см Стерильной пастеровской пипеткой с резиновой грушей забирают 8-10 мл крови из сердца. Следует отбирать материал из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Отбор секционного материала необходимо производить как можно быстрее после смерти больного (не более 20 часов нахождения при комнатной температуре).

Для проведения исследования на обнаружение в секционном материале РНК вируса КГЛ методом ПЦР готовят микробиоптат (пунктат)/микроаутоптат, который помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой и опускают в емкость для транспортировки.

Транспортировка материала

Перед транспортировкой в лаборатории материал, помещенный в первичную герметично закрывающуюся тару, помещают во вторичную тару, представляющую собой металлический или пластиковый пенал.

Транспортировка материала осуществляется обязательно в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Запрещается:

Использовать гепарин в качестве антикоагулянта.

Проводить забор крови для ПЦР в многоразовые стеклянные пробирки.

Замораживать образцы цельной крови.

Центрифугировать.

Производить встряхивание пробирок с кровью, сывороткой.

Пипетировать ртом.

Использовать стеклянные пробирки с ватно-марлевой пробкой для транспортировки материала.

Формы
направления в лабораторию на исследования для установления диагноза КГЛ
(утверждены методическими указаниями от 28.03.2012 МУК 4.2.3007-12 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней")

На каждую отправляемую в лабораторию пробу от больного КГЛ или с подозрением на эту инфекцию заполняют направление N 1.

На пробы секционного материала от умершего с подозрением на КГЛ заполняют направление N 2.

Направляемую пробу (пробы) сопровождают письмом на имя руководителя учреждения, в котором указывают вид направляемого материала, количество образцов и цель исследования; письмо подписывает руководитель направившего учреждения.

Направление N 1

(обязательное)

Направление
крови, сыворотки крови для выявления РНК вируса ККГЛ; антител IgM, IgG; выделения вируса ККГЛ вирусологическим, иммуноферментным или молекулярно-генетическим методами
(нужное подчеркнуть)

В лабораторию ______________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Направляется кровь, сыворотка крови (нужное подчеркнуть) для выделения вируса ККГЛ, для исследования на антитела к вирусу ККГЛ, для детекции РНК вируса ККГЛ (нужное подчеркнуть)

Ф.И.О. _____________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Возраст ____________________________________________________________

Домашний адрес _____________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Место работы (учебы) _______________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Дата заболевания ___________________________________________________

Дата, время взятия крови ___________________________________________

_________________________________________________________________________

Диагноз ____________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Наименование направившего учреждения _______________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Ф.И.О. врача, контактный телефон ___________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Дата отправления материала _________________________________________

Дата и время доставки материала в лабораторию ______________________

Направление N 2

(обязательное)

Направление
на исследование секционного материала

В лабораторию ______________________________________________________

_________________________________________________________________________

(наименование учреждения)

Фамилия ______________________________ Имя _________________________

Отчество ______________________________ Возраст ____________________

Место

жительства _________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

(область, город, район, населенный пункт)

Место работы (учебы) _______________________________________________

_________________________________________________________________________

Номер истории болезни _____________________ Дата заболевания _______

Дата смерти ________________________________________________________

Клинический диагноз ________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Патолого-анатомический диагноз ______________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Вид материала ______________________________________________________

_________________________________________________________________________

Дата и время отбора материала ______________________________________

Дата и время отправки материала ____________________________________

Дополнительные сведения ____________________________________________

_________________________________________________________________________

Ф.И.О. патологоанатома (судмедэксперта),

направившего материал для исследования _____________________________

Ф.И.О. эпидемиолога (инфекциониста),

присутствовавших при вскрытии ______________________________________

                             _______________________________________

Ф.И.О. лица, доставившего

материал в лабораторию _____________________________________________

Дата и время доставки

материала в лабораторию ____________________________________________