Приложение 2. Временная инструкция по лабораторной диагностике синдрома острого респираторного заболевания (SARS) (атипичной пневмонии)

Приложение 2

Временная инструкция
по лабораторной диагностике синдрома острого респираторного
заболевания (SARS) (атипичной пневмонии)

ГАРАНТ:

См. Временные методические рекомендации "Лабораторная диагностика "Атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 3 мая 2003 г.

См. также указание Минздрава РФ от 25 августа 2003 г. N 1013-у "Об организации исследований по диагностике тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и других инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в центрах госсанэпиднадзора"

1. Введение

1.1. Настоящая инструкция определяет временный порядок и правила проведения лабораторных исследований по специфической диагностике "атипичной пневмонии", предположительно вызванной коронавирусом SARS.

1.2. Инструкция разработана в помощь специалистам центров госанэпиднадзора и лабораторий генодиагностики, принимающим участие в проведении санитарно-противоэпидемических и лабораторно-диагностических мероприятий при "атипичной пневмонии".

1.3. Настоящей инструкцией следует руководствоваться при осуществлении на территории Российской Федерации государственного санитарно-эпидемиологического надзора до периода завершения разработки и окончательной верификации диагностических препаратов к вирусу SARS.

1.4. "Атипичная пневмония" - новое вирусное инфекционное заболевание с преимущественно воздушно-капельным механизмом заражения, характеризуемое тяжелым течением и поражением преимущественно нижних отделов органов дыхания. Инкубационный период заболеваний составляет 2-14 суток, в среднем 7-10 суток.

1.5. Возбудителем "атипичной пневмонии" является вирус SARS, относящийся к семейству Coronaviridae. В некоторых случаях вместе с вирусом SARS обнаруживается также человеческий метапневмовирус, относящейся к семейству Pneumoviridae. Значение метапневмовируса в патогенезе "атипичной пневмонии" до настоящего времени окончательно не выяснено.

1.6. Высокая патогенность вируса и доказанная возможность заражения медицинского персонала при обслуживании больных "атипичной пневмонией" требуют тщательного соблюдения мер биобезопасности при обращении со всеми материалами и образцами, предположительно содержащими вирус SARS.

В настоящее время специалистами ВОЗ при работе с этим возбудителем рекомендован уровень BSL-3 (Вторая группа патогенности по классификации патогенных агентов, принятой в Российской Федерации). Запрещается проведение вирусологических исследований по выделению возбудителя в лабораториях, не оснащенных системами безопасности и не имеющих соответствующей лицензии.

2. Отбор проб и транспортировка биологического
материала от людей

2.1. Организация отбора проб и транспортировка биологического материала от больных (трупов) при регистрации спорадических случаев и вспышек "атипичной пневмонии" осуществляется квалифицированным персоналом в соответствии с требованиями СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности" и СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности".

2.2. Отбор проб от больных и подозрительных на заражение вирусом SARS осуществляет медицинский персонал, с соблюдением правил противоэпидемического режима.

2.3. Для исследования следует использовать следующие пробы.

- кровь больных (с 1 дня температуры по 10 сутки заболевания).

- смывы носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярные смывы (в т.ч. после лаважа бронхов);

- сыворотка крови лиц, подозрительных на заражение (на 1 и 21-28 сутки);

- секционный материал, легкие, сегментарные бронхи, кровь, печень, селезенка.

2.4. Отобранный с соблюдением правил асептики материал помещают в стерильные пробирки с плотно закрывающимися (завинчивающимися) пробками, этикетируют (с указанием фамилии, имени, отчества больного, вида материала и даты отбора) и помещают вместе с направлением в первичную герметичную емкость для транспортировки.

2.5. Кровь больных, смывы и секционный материал для вирусологического исследования транспортируют в специализированную лабораторию в течение не более 24 часов при температуре - 20°С (термосы с хладоагентом или сухим льдом). Консервант в эти пробы не добавляется.

Парные сыворотки крови инактивируют на водяной бане при температуре 56°С в течение 45 мин с добавлением консерванта (мертиолята натрия 1:10000), после чего транспортируют при температуре 4°С.

2.6. Пробы, предназначенные для передачи в вирусологическую лабораторию и содержащие неинактивированный возбудитель, помещают во вторичную герметичную тару, имеющую определенную СП 1.2.036-95 маркировку.

3. Лабораторная диагностика синдрома острого
респираторного заболевания
("атипичной пневмонии")

3.1. Лабораторная диагностика "атипичной пневмонии" проводится вирусологическими, серологическим и молекулярно-биологическими методами.

3.2. Временно, в связи с недостаточностью экспериментальных данных, объем диагностических мероприятий устанавливается в зависимости от уровня и оснащенности учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы:

Уровень	Привлекаемые учреждения	Основные задачи в организации и проведении диагностики атипичной пневмонии
Муниципальный	Центры Госсанэпиднадзора в районах, городах	1.Эпидемиологический мониторинг заболеваемости, надзор за конгингентами повышенного риска. 2. Контроль противоэпидемического режима, в т.ч. при подготовке и передаче проб для последующей лабораторной диагностики.
Региональный	Центры Госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации Центры генодиагностики в научно-исследовательских противочумных институтах, противочумные станции	1. Организация и контроль противоэпидемических мероприятий в зоне ответственности. 2. Контроль противоэпидемического режима в диагностических лабораториях центров генодиагностики. 1. Молекулярно-биологический анализ методом ПЦР* 2. Серологические исследования сывороток от контактных лиц.
Федеральный	Научно-исследовательские институты РАМН, Центр специальной лабораторной диагностики НИИ микробиологии Минобороны России, ГНЦВБ "Вектор"	1. Вирусологические исследования 2. Подтверждающие исследования с положительными на SARS пробами.

-----------------------------------

Примечание:

* при наличии отдельного помещения для пробоподготовки (пре-ПЦР), оборудованного боксирующим устройством

3.3. Выявление РНК вируса SARS методом ОТ-ПЦР

В связи с существенными трудностями в культивировании и выделении коронавирусов, методы генодиагностики являются в настоящее время ведущими в подтверждении связи заболевания "атипичной пневмонией" с вирусом SARS. Принцип метода состоит в направленной амплификации фрагмента консервативного гена РНК-зависимой РНК-полимеразы возбудителя, геномную нуклеиновую кислоту которого можно выявить в сыворотке крови больных с начала лихорадочного периода до 10-14 суток заболевания.

Сотрудничающими с ВОЗ центрами предложен ряд праймеров, которые могут быть использованы для первичной оценки наличия вируса SARS в пробе.

Праймеры СВС(США)

Внешние: прямой 5' GGGTТGGGACTATCTAAGTGTGA

обратный 5' ТААСАСАСАААСАССАТСАТСА

размер ампликона - 452 п.о.

ИЛИ: прямой 5' GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA

обратный 5' ССАТСАТСАGАТАGААТСАТСАТА

размер ампликона - 440 п.о.

Праймеры не верифицированы в Российской Федерации как диагностические препараты для диагностики "атипичной пневмонии" в связи с временным отсутствием вирусной РНК или ее опубликованной последовательности.

Праймеры Института тропической медицины (ФРГ)

прямой 5' ссtсtcttgttсttgсtсgcа

обратный 5' аtаgtgаgссgссасасаtg

размер ампликона - 150 п.о.

РНК из проб клинического материала выделяют с помощью любого коммерческого набора для выделения РНК/ДНК, обеспечивающего инактивацию возбудителя, в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. В качестве отрицательных контролей используют деионизированную воду.

Полученный в ОТ-ПЦР положительный результат не является безусловным доказательством наличия вируса SARS, а проба от данного больного подлежит направлению в специализированный центр для проведения подтверждающего анализа.