Приложение. Критерии эффективности методики идентификации ГИМЖ

N

Характеристика

Описание характеристики

Критерий

Методы оценки критерия

1

Специфичность ПЦР

Способность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую ДНК

ПЦР-тест-система должна выявлять целевую ДНК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов в 100% проводимых исследований

Для оценки специфичности используются контрольные панели образцов. В состав панели должны входить образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК

2

Чувствительность ПЦР

Наименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР-методики в зависимости от свойств используемых праймеров и зондов

Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой ДНК в одной ПЦР-реакции

Проводятся исследования ряда десятикратных разведений целевой ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяется максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах)

3

Эффективность ПЦР

Прирост матрицы на каждом цикле амплификации

Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%.

Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК-матрицы (slope): не ниже 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1-3,6)

Для оценки эффективности ПЦР проводится амплификация с рядом

десятикратных разведений целевой ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое.

По результатам амплификации строится график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК-матрицы. Определяется наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: Е = [10 (-1 / slope)] - 1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100% (slope = -3,32)