Методические рекомендации "Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций" (утв. Минздравом РСФСР 3 июня 1986 г.) (документ не действует)

Методические рекомендации
"Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций"
(утв. Минздравом РСФСР 3 июня 1986 г.)

ГАРАНТ:

Приказом Роспотребнадзора от 4 декабря 2020 г. N 797 настоящий документ признан не действующим на территории РФ с 4 декабря 2020 г.

Введение

Внутрибольничные гнойно-септические заболевания представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения. Они снижают эффективность лечения в стационарах, увеличивают сроки госпитализации, повышают летальность, наносят значительный экономический ущерб. Наиболее восприимчивыми к внутрибольничным инфекциям являются больные хирургических и урологических стационаров, а также родовспомогательных учреждений.

Проведенными исследованиями была выявлена широкая циркуляция грамотрицательных бактерий в окружающей среде лечебных учреждений и их роль в формировании эпидемического процесса при внутрибольничных инфекциях. В настоящее время наиболее часто выделяются микроорганизмы родов Pseudomonas и Acinetobacter, а в родовспомогательных учреждениях - Klebsiella. Помимо этого, определенное значение имеют и другие потенциально патогенные бактерии - Proteus, Serratia, Enterobacter, Citrobacter и др. Указанные микроорганизмы обусловливают как спорадические случаи заболевания, так и вспышки внутрибольничных инфекций. В связи с этим выделение и идентификация грамотрицательных потенциально патогенных бактерий в объектах окружающей среды стационаров и в патологическом материале приобретают все большую значимость и являются необходимыми для правильной этиологической расшифровки внутрибольничных инфекций, назначения больным адекватной антибактериальной терапии и своевременного проведения профилактических мероприятий в лечебных стационарах.

1. Общие положения

Бактериологический контроль за объектами окружающей среды в лечебных стационарах осуществляется санитарно-эпидемиологическими станциями при плановых обследованиях в порядке текущего санитарного надзора. Кратность бактериологического контроля со стороны СЭС - не реже 1 раза в квартал. Бактериологические лаборатории лечебных учреждений контролируют соблюдение противоэпидемического режима не реже 1 раза в месяц. Забор проб патологического материала у больного проводят по указанию лечащего врача. По эпидемическим показаниям - при возникновении гнойно-септических заболеваний (внутрибольничных инфекций) - бактериологический контроль проводят внепланово.

Объектами исследования являются:

- воздушная среда;

- предметы обихода;

- аппаратура;

- кожа рук обслуживающего персонала;

- патологический материал.

2. Отбор проб на исследование и выделение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий

Исследование воздушной среды

Бактериологическому контролю подлежит воздух следующих объектов: операционных, перевязочных, палат, отделений реанимации и интенсивной терапии.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью прибора ПАБ-1 (пробоотборник аэрозольный бактериологический), выпускаемого Ленинградским заводом "Красногвардеец". Принцип действия этого прибора основывается на зарядке частиц бактериального аэрозоля при помощи коронного разряда и последующего осаждения их методом электропреципитации на специальные пластины - поддоны с плотной или жидкой питательной средой. Поддоны предварительно следует стерилизовать в сухожаровом шкафу при температуре 180°С в течение 2 часов. Плотную питательную среду разливают по 20-25 мм на поддоны асептично и равномерно, не касаясь их верхней кромки. В случае неиспользования поддонов с питательной средой они должны храниться не более 7-10 дней при +4°С и перед посевом подсушиваться.

При отборе проб в жидкие питательные среды следует строго соблюдать горизонтальное положение прибора. Объем исследуемого воздуха должен составлять от 500 до 1000 л при скорости отбора проб 125 л в минуту. Отбор воздуха в помещениях стационара производят на уровне дыхания лежащего больного.

При отсутствии прибора ПАБ-1 исследования воздуха на грамотрицательную микрофлору проводят методом седиментации. Чашки Петри с элективными средами без крышек помещают на горизонтальные поверхности (стол, подоконник, тумбочка и др.) и выдерживают 2-4 часа. В месте забора используют не менее 2 чашек с одной и той же питательной средой.

Не рекомендуется для выделения из воздуха грамотрицательных потенциально патогенных бактерий использовать щелевой прибор Кротова из-за его недостаточной эффективности в этих случаях. В порядке исключения при отборе проб прибором Кротова количество исследуемого воздуха должно составлять не менее 250-500 л при скорости протягивания воздуха 25 л в минуту.

Посев воздуха проводится на модифицированную среду Эндо* или в жидкие среды накопления: мясопептонный бульон, 1% пептонную воду с последующим подращиванием в термостате в течение 16-18 часов при 37°С. Далее осуществляется пересев из жидких питательных сред накопления на модифицированную среду Эндо, которую выдерживают в термостате 18-24 часа при 37°С. Выросшие на среде Эндо колонии различают по их внешнему виду (размер, окраска, характер поверхности и краев). Для дальнейшего исследования выделенных микроорганизмов отбирают не менее двух колоний одного вида.

Отбор проб (смывы) с предметов обихода, аппаратуры, кожи рук обслуживающего персонала

Бактериологическому контролю подлежат следующие объекты:

- в операционных и перевязочных: операционный, перевязочный стол, стол медицинской сестры, щетки для мытья рук (чистые), поверхность раковин, таз для мытья рук, кран раковины, перчатки, кожа рук персонала;

- наркозная аппаратура: внутренняя поверхность наркозной маски, внутренняя поверхность тройника наркозного аппарата, наружная поверхность ларингоскопа, внутренняя поверхность гофрированных шлангов, внутренняя поверхность деталей клапанов вдоха и выдоха, поверхность адсорбирующего вещества (адсорбент), внутренняя поверхность увлажнителя, внутренняя поверхность воздуховодов, внутренняя поверхность интубационной трубки, наружная поверхность интубационной трубки;

- в палатах для больных: кровати, прикроватные тумбочки, дверные ручки.

Кроме вышеперечисленных предметов, подлежащих бактериологическому контролю, в случае необходимости могут быть подвергнуты исследованию выборочно и другие объекты. По эпидпоказаниям дополнительно проводят отбор проб с предметов, находящихся в употреблении ("грязных").

Отбор проб осуществляется методом смывов.

Смывы с поверхностей предметов обихода, аппаратуры, кожи рук обслуживающего персонала при качественной оценке результатов производят стерильным ватным тампоном на стеклянных или деревянных стержнях, вмонтированных в пробирки с 5 мл стерильной 1% пептонной водой (накопительная среда) выше ее уровня. Тампон увлажняют питательной средой, делают смыв с объекта и снова помещают в пробирку, погружая его в пептонную воду. После отбора пробы с наркозной аппаратуры тампон помещают в пробирку с 5 мл стерильного мясопептонного бульона.

Посевы с объектов в среде накопления инкубируют при 37°С в течение 16-18 часов (для наркозной аппаратуры - 10-12 суток) и осуществляют пересев на модифицированную среду Эндо.

При количественной оценке результатов смывы производят тем же способом, что и при качественном методе исследования, применяя 0,1% пептонную воду. Смывы отбирают с поверхности площадью 100 , при контроле более мелких предметов - с поверхности всего предмета. После отбора проб смывы в пробирках встряхивают на Шуттель-аппарате в течение 10-15 мин или ручным способом. Затем осуществляют посев шпателем 0,3-0,5 мл смыва на модифицированную среду Эндо, которую выдерживают в термостате 24 часа при 37°С. Выросшие на среде Эндо колонии различают по их внешнему виду (размер, окраска, характер поверхности и краев). Для дальнейшего исследования выделенных микроорганизмов отбирают не менее двух колоний одного вида.

Бактериологические исследования проводят не позднее чем через 2-4 часа с момента отбора проб. До исследования пробы хранят при температуре +4 - +8°С. Каждая проба, отобранная с объекта окружающей среды стационара, должна иметь направление, включающее следующие пункты: 1) название отделения, 2) место взятия, 3) дата и время взятия, 4) вид материала, направляемого на исследование, 5) фамилия и должность отбирающего.

Отбор патологического материала

Материалом для бактериологического исследования являются гной, экссудаты, пунктаты, выпот, биоптаты, ткани, мазки из ран, фекалии, моча, рвотные массы и т.д.

Наиболее правильный способ взятия жидких материалов - объемно с помощью шприца. Отбор материала тампоном производят только при невозможности осуществления объемного метода; при этом параллельно готовят мазок-отпечаток для бактериоскопического исследования. При аспирации закрытых полостей кожу в месте прокола дезинфицируют антисептиками в течение 1-2 мин. Свищи и фистулы первоначально очищают от отделяемого и забор материала производят из глубины. Жидкий материал из открытых ран при хирургическом вмешательстве отбирают объемно шприцем. Отделяемое из дренажей также берут шприцем или используют концы удаленных дренажных трубок.

Биоптаты ран получают путем иссечения участка ткани (весом 0,2-1 г) из глубоких слоев раны после тщательной ее обработки физиологическим раствором и 70% этиловым спиртом для удаления поверхностно вегетирующей микрофлоры, а также антисептических и антибактериальных препаратов.

При бактериологическом анализе испражнений исследованию подлежат только утренние фекалии. Предварительное применение очистительных клизм и прием слабительных средств противопоказаны. Во избежание искажения истинного содержания микробов материал должен быть доставлен в лабораторию возможно быстрее после дефекации. Фекалии отбирают в специальную стерильную посуду (бактериологические чашки, флаконы с широким горлом). Первые порции кала (из ампула ректи), содержащие, как правило, более высокое, чем в других отделах кишечника, количество микроорганизмов, исследованию не подлежат.

Для исследования мочи следует брать среднюю порцию утренней мочи после тщательного туалета наружных мочеполовых органов. Мочу собирают в стерильную пробирку в количестве 3-5 мл и немедленно доставляют в лабораторию.

Отбор проб рвотных масс производится в соответствии с существующими инструкциями по исследованию пищевых токсикоинфекций и интоксикаций. Патологический материал доставляют в лабораторию не позднее чем через 1-1,5 часа с момента взятия. Если немедленная доставка невозможна, образцы хранят в холодильнике при температуре +4 - +6°С. Каждый образец патологического материала должен быть снабжен этикеткой, на которой указывается: 1) отделение, в котором находится больной, 2) фамилия, имя, отчество больного, 3) возраст больного, 4) номер истории болезни, 5) основной диагноз и диагноз осложнения, 6) проводимая химио- и антибиотикотерапия, 7) место взятия материалов, 8) вид материала, 9) дата и время взятия пробы, 10) фамилия лечащего врача.

Посев патологического материала производят на любую из трех плотных питательных сред: модифицированную среду Эндо, 5% кровяной агар, питательный агар Дагестанского НИИ питательных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37°С в течение 18-24 часов. Выросшие на этих средах колонии различают по их внешнему виду (размер, окраска, характер поверхности и краев). Для дальнейшего исследования выделенных микроорганизмов отбирают не менее трех колоний одного вида.

3. Идентификация грамотрицательных потенциально патогенных микроорганизмов

Грамотрицательная потенциально патогенная микрофлора, являющаяся причиной внутрибольничных инфекций, разделяется на две большие группы. Первая группа микроорганизмов ферментирует углеводы и относится к семейству Enterobacteriaceae, вторая - лишена этой способности и принадлежит к группе неферментирующих бактерий. Из семейства Enterobacteriaceae существенное значение в этиологии гнойно-септических заболеваний имеют бактерии родов Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Escherichia, Proteus, Providencia. Они являются грамотрицательными мелкими палочками, обладающими подвижностью или неподвижными, капсульными или бескапсульными, неспорообразующими аэробами или факультативными анаэробами, оксидазанегативными, образующими кислоту при ферментации глюкозы, восстанавливающими нитраты и нитриты.

Группу неферментирующих бактерий при госпитальных инфекциях обычно представляют микроорганизмы родов: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium. Это грамотрицательные мелкие палочки или коккобациллы, обладающие подвижностью, или неподвижные, неспорообразующие аэробы, цитохромоксидазанегативные или цитохромоксидазаположительные, не ферментирующие глюкозу, имеющие нередко пигмент.

Идентификация указанных микроорганизмов начинается с изучения их морфологии в мазках, приготовленных из колоний на плотных питательных средах и окрашенных по Граму. При обнаружении грамотрицательных мелких палочек, а также коккобактерий их отсевают на скошенный мясопептонный агар с целью накопления посевного материала и одновременно в среду OF (среда Хью-Лейфсона). Посевы выдерживают в термостате в течение 18-24 часов при 37°С. Затем учитывают результаты посева на среде OF (рис. 1).

Грамотрицательные бактерии, оксидирующие и ферментирующие глюкозу, изменяют первоначальный зеленый цвет среды OF на желтый. В таком случае результат учитывают как +/+ и данные микроорганизмы относят к семейству Enterobacteriaceae с последующей идентификацией.

Грамотрицательные микроорганизмы, оксидирующие, но не ферментирующие глюкозу (+/-) или не оксидирующие и не ферментирующие ее (-/-), относят к группе неферментирующих бактерий с последующей идентификацией.

Идентификация грамотрицательных потенциально патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

Идентификацию грамотрицательных потенциально патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae проводят в два этапа. Первым этапом определяют родовую принадлежность бактерий по минимальному набору тестов. Культуру с поверхности скошенного агара исследуют на наличие цитохромоксидазы. Далее цитохромоксидазаотрицательные колонии засевают в короткий пестрый ряд из 7 тестов. Определяют подвижность, утилизацию цитрата, продукцию индола, реакцию с метиловым красным, ферментацию рамнозы, дезаминирование фенилаланина и декарбоксилирование орнитина.

Дифференциация энтеробактерий с помощью этих тестов проводится по табл. 1. Ключевыми признаками являются: для рода Escherichia - подвижность (+/-), цитратный признак (-), метиловый красный (+); для рода Klebsiella - подвижность (-), цитратный признак (+), орнитиндекарбоксилаза (-), метиловый красный (-); для рода Enterobacter - подвижность (+), цитратный признак (+), орнитиндекарбоксилаза (+), метиловый красный (-); для рода Citrobacter - подвижность (+), цитратный признак (+), метиловый красный (+); для родов Proteus-Providencia - подвижность (+), фенилаланиндезаминаза (+); для рода Serratia - подвижность (+), цитратный признак (+), ферментация рамнозы (-).

Таблица 1

Родовая дифференциация потенциально патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

Микроорганизмы	Тесты
Микроорганизмы	Подвижность	Цитратный признак	Индол	Метиловый красный	Орнитиндекарбоксилаза	Фенилаланин (или триптофан) дезаминаза	Ферментация рамнозы
Escherichia		-		+		-	+
Klebsiella	-	+	-	-	-	-	+
Enterobacter	+	+	-	-	+	-	+
Citrobacter	+	+		+		-	+
Proteus-Providencia	+			+		+	-
Serratia	+	+	-		+	-	-

Второй этап идентификации потенциально патогенных энтеробактерий (проводится по эпидемическим показаниям) - определение их видовой принадлежности по 11 тестам (табл. 2). Ключевыми признаками в таких случаях являются: для Citrobacter freundii - индол (-); для Citrobacter diversus орнитиндекарбоксилаза (+), (-), индол (+); для Klebsiella pneumonia - ацетоин (-); для Enterobacter aerogenes - орнитиндекарбоксилаза (+), лизиндекарбоксилаза (+), аргининдегидролаза (-), ферментация инозита (+); для Enterobacter cloacae - орнитиндекарбоксилаза (+), аргининдегидролаза (+); для Enterobacter agglomerans - орнитиндекарбоксилаза (-), аргининдегидролаза (-); для Serratia liquefaciens - орнитиндекарбоксилаза (+), ферментация сорбита (+), арабинозы (+); для Serratia marcescens - орнитиндекарбоксилаза (+), ферментация сорбита (-), арабинозы (-), желатиназная активность (+); для Serratia rubidaea - орнитиндекарбоксилаза (-); для Proteus mirabilis - уреаза (+), (+), индол (-), мальтоза (+); для Proteus vulgaris - уреаза (+); (+), индол (+), мальтоза (+); для Morganella morganii - уреаза (+), (-), индол (+); для Providencia alcalifaciens - уреаза (-), адонит (+), инозит (-); для Providencia stuartii - уреаза (-), адонит (-), инозит (+). Определение этих признаков осуществляется с помощью дифференциально-диагностических питательных сред, представленных в Приложении 2.

Таблица 2

Видовая дифференциация потенциально патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

Микроорганизмы

Орнитиндекарбоксилаза

Лизиндекарбоксилаза

Аргининдегидролаза

Ферментация сорбита

Ферментация арабинозы

Ферментация инозита

Индол

Уреаза

Желатиназная активность

Ацетоин

Ферментация мальтозы

Адонит

Citrobacter freundii

Citrobacter diversus

Klebsiella pneumonia

Enterobacter aerogenes

Enterobacter cloacae

(+)

Enterobacter agglomerans

Hafnia alvei

+ (22°)

Serratia liquefaciens

+ без газа

Serratia marcescens

Serratia rubidaea

Proteus mirabilis

Proteus vulgaris

Providencia alcalifaciens

Providencia stuartii

Morganella morganii

Примечание: - преобладание положительного результата;

- преобладание отрицательного результата;

(+) - малая вероятность положительного результата;

в - вариабельность признака.

Идентификация неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ)

Идентификация НГОБ проводится по двухэтапной схеме (рис. 2).

Первый этап - определение родовой принадлежности НГОБ (табл. 3) - включает три теста: определение подвижности, окисление 1% глюкозы в среде Хью-Лейфсона (OF) и наличие фермента оксидазы. По результатам этих трех тестов проводят ориентировочную идентификацию следующих НГОБ: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Flavobacterium meningosepticum.

Таблица 3

Ориентировочная идентификация неферментирующих грамотрицательных бактерий

Микроорганизмы	Подвижность	Оксидаза	Окисление-ферментация глюкозы на среде OF
Pseudomonas spp	+	+ (-)	+/-; -/-*
Acinetobacter spp	-	-	+/-; -/-*
Moraxella spp	-	+	-/-
Alcaligenes spp	+	+	-/-*
Flavobacterium meningosepticum	-	+	+/-

Примечание: 1) в числителе - окисление; в знаменателе - ферментация.

2) "*" - подщелачивание среды OF в аэробных условиях.

3) "(-)" - редко встречаемый признак.

Причем разделение родов Pseudomonas и Alcaligenes возможно в том случае, если исследуемый штамм окисляет глюкоза на среде OF (см. табл. 3).

Второй этап - определение видовой, а в отдельных случаях подтверждение родовой принадлежности НГОБ (табл. 4). Выбор тестов, которые необходимо поставить на втором этапе, зависит от результатов трех тестов первого этапа.

Таблица 4

Дифференциально-диагностические тесты для идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий

Микроорганизмы

Тесты

Подвижность

Оксидаза

OF с глюкозой (окисление)

Флюоресценция в УФ-свете либо аргининдегидролаза

Желатиназа

Рост при 42°С

Амилаза

ДНК-аза

Лизиндекарбоксилаза

Фенилаланиндезаминаза

OF с фруктозой

Окисление 10% лактозы

Чувствительность к пенициллину

Индол

P. aeruginosa

P. fluorescens

P. putida

P. cepacia

P. stutzeri

P. putrefaciens

P. maltophilia

P. diminuta

P. alcaligenes

P. pseudoalcaligenes

+ сл

Alcaligenes spp.

Moraxella spp.

Acinetobacter calcoaceticus var. anitratum

Acinetobacter calcoaceticus var. lwoffi

Flavobacterium meningosepticum

Примечание: * - подщелачивание среды OF.

Оценку результатов первого этапа проводят в следующем порядке: определение подвижности, наличия фермента оксидазы, окисления 1% глюкозы на среде Хью-Лейфсона (среда OF). Как видно из рис. 2, возможны семь вариантов исходов этих трех тестов.

1. Неподвижные микроорганизмы, не обладающие оксидазной активностью и не окисляющие глюкозу на среде OF (на схеме: подвижность -, оксидаза -, OF -), относят к Acinetobacter calcoaceticus v. lwoffi. В качестве подтверждающего используют тест с 10% лактозой. A. lwoffi не окисляют 10% лактозу.

2. Неподвижные НГОБ, не обладающие оксидазной активностью, но окисляющие глюкозу на среде OF (на схеме: подвижность -, оксидаза -, OF +), принадлежат к Acinetobacter calcoaceticus v. anitratus.

Для подтверждения используют тест окисления 10% лактозы, который у этих микроорганизмов положительный. Для идентификации Acinetobacter большое значение имеет микроскопия мазка, поскольку среди неферментирующих грамотрицательных бактерий только Acinetobacter могут иметь клетки в виде кокков или коккобацилл.

3. Штаммы, обладающие следующими свойствами: подвижность (-), оксидаза (+), OF (-), относят к роду Moraxella. Подтверждающим тестом для этих микроорганизмов служит чувствительность к пенициллину (+).

4. Неподвижные оксидазоположительные штаммы, окисляющие глюкозу на среде OF, относят к Flavobacterium meningosepticum. В качестве подтверждающего теста служит положительная реакция на индол и наличие желтого пигмента.

5. Подвижные оксидазоположительные микроорганизмы, окисляющие глюкозу на среде OF (+), могут принадлежать к одному из шести видов рода Pseudomonas: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. slutzeri, P. putrifaciens. Для их дифференциации одновременно ставят шесть тестов: флюоресценция в УФ-свете, либо определение наличия аргининдегидролазы, определение наличия желатиназы, амилазы, лизиндекарбоксилазы, рост при 42°С, образование . Учет результатов начинают с определения аргининдегидролазы либо флюоресценции в УФ-свете. Штаммы, обладающие аргининдегидролазой либо флюоресцирующие в УФ-свете и дающие рост при 42°С, относят к P. aeruginosa. Если исследуемый штамм при наличии аргининдегидролазы или флюоресценции в УФ-свете не растет при 42°С, проводят дифференциацию между P. putida и P. fluorescens по желатиназной активности. Не разжижающие желатину штаммы относят к P. putida, а разжижающие - к P. fluorescens. Если у исследуемого штамма отсутствует аргининдегидролаза, либо флюоресценция в УФ-свете, оценивают способность образовывать сероводород, амилазу и лизиндекарбоксилазу. Если аргининдегидролаза или флюоресценция (-), а (+), штамм относят к P. putrefaciens; штамм, обладающий ферментом амилазой - к P. stutzeri; штамм, декарбоксилирующий лизин, расценивают как P. cepacia Среди культур P. putrefaciens встречаются штаммы, окисляющие глюкозу и не окисляющие ее, а среди культур P. cepacia - оксидазоположительные и оксидазоотрицательные.

6. Подвижные, оксидазоположительные, не окисляющие глюкозу на среде OF, не ферментирующие грамотрицательные бактерии, могут принадлежать к роду Alcaligenes или к одному из видов рода Preudomonas: P. alcaligenes, P. putrefaciens, P. pseudoalcaligenes, P. diminuta. Обычно эти микроорганизмы подщелачивают среду OF в аэробных условиях. Для их дифференциации одновременно ставят четыре теста и определяют окисление фруктозы на среде OF, наличие ДНК-азы, фенилаланиндезаминазы и образование сероводорода. Окисление фруктозы указывает на P. pseudoalcaligenes, образование сероводорода является четким дифференциальным признаком для P. putrefaciens. Наличие фермента ДНК-азы определяет вид P. diminuta. Проведение точной дифференциации между родом Alcaligenes и видом P. alcaligenes возможно лишь по окраске жгутиков, что неприемлемо для практических лабораторий. Поэтому для ориентировочной дифференциации используют тест, определяющий фенилаланиндезаминазу. Этот фермент присутствует в 72% случаев у P. alcaligenes и отсутствует у бактерий рода Alcaligenes.

7. Подвижные оксидазоотрицательные штаммы, окисляющие глюкозу на среде OF, принадлежат либо к P. maltofilia, либо к виду P. cepacia. Для дифференциации этих двух видов используют тест, выявляющий наличие фермента ДНК-азы: P. maltofilia обладает ферментом ДНК-азой, а P. cepatia - нет. Среди штаммов P. maltofilia встречаются штаммы как окисляющие, так и не окисляющие глюкозу.

4. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Метод дисков

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам методом дисков определяется в соответствии с "Методическими указаниями по определению антибиотикочувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом их диффузии в агар с использованием дисков", утв. МЗ СССР.

Метод реплик

Чистые культуры идентифицированных микроорганизмов засевают короткими штрихами на секторы чашки с мясопептонным агаром (из расчета 12 штрихов на 1/6 чашки), подращивают 5-6 часов и перепечатывают бархатным или металлическим репликатором на среды с антибиотиками: ампициллином, карбенициллином, рифампицином, кефзолом, цефализином (100 мкг/мл среды), левомицетином, канамицином, налидиксовой кислотой (50 мкг/мл среды), стрептомицином (20 мкг/мл среды), тетрациклином (30 мкг/мл среды), гентамицином (5 мкг/мл среды), а также с одним из сульфаниламидов на минимальном солевом агаре (50-100 мкг/мл среды). Учет результатов проводится через сутки инкубации при 37°С и позволяет определить антибиотикограмму, служащую одновременно маркером штамма. При этом устойчивость к налидиксовой кислоте служит важной генетической меткой при сравнении идентифицированных культур, а к гентамицину может считаться достаточно надежным признаком, характерным для госпитальных штаммов.

5. Целенаправленные исследования объектов окружающей среды и патологического материала по эпидпоказаниям

Исследуемый материал от контактных лиц по эпидпоказаниям отбирается по усмотрению эпидемиолога.

Определение E. coli

Отбор проб производят согласно разделу 2. Выделение E. coli осуществляется в соответствии с Приказом N 720 МЗ СССР, 31.07.78.

Определение бактерий рода Klebsiella

Отбор проб производят согласно разделу 2. Посев исследуемого материала осуществляют на плотную питательную среду К-2 и инкубируют ее при 37°С 18-24 часа. Колонии клебсиелл в этой среде крупные, блестящие, как правило, слизистые. Окраска их различна - от желтой или зелено-желтой до голубой. Для идентификации со среды снимают по 1-2 колонии и засевают их в полужидкий агар для определения подвижности, а также в среду для определения орнитиндекарбоксилазной активности. Признаками, характерными для рода Klebsiella, являются неподвижность культуры и неспособность декарбоксилировать орнитин.

Определение бактерий родов Proteus и Providencia

Отбор проб производят согласно разделу 2. Посев материалов осуществляют на среду П-2, инкубируют при 37°С в течение 18-24 часов. Обязательным условием посева на среде П-2 является получение по возможности разреженного роста и изолированных колоний для обеспечения точности видовой идентификации культуры. На этой среде колонии P. mirabilis - малиновые с черным центром, P. vulgaris - желтые с черным или темно-коричневым центром, M. morganii, Providencia - малиновые без центра, P. rettgeri - желтые без центра. Определение P. mirabilis и P. vulgaris в 96-98% случаев совпадает с последующей идентификацией и в дальнейшем в подтверждении не нуждается. Колонии без черного центра или сомнительные должны быть идентифицированы. Для их дифференциации используются среды "ПП" и "ИнАд". Посев в среду "ПП" проводят штрихом по скошенной поверхности и уколом до дна пробирки, инкубируют 18-20 часов при 37°С. Уреазную активность учитывают по нижнему слою среды: положительный результат - оранжево-желтая окраска, что четко разграничивает род Proteus от рода Providencia. Продукция газа в нижнем слое - признак, отличающий P. alcalifaciens от P. stuartii. Наличие индола, определяемого полоской реактивной бумаги, позволяет идентифицировать P. mirabilis от P. vulgaris и других видов протеев и провиденций. Триптофандеаминаза, выявляемая с помощью реактива с хлорным железом, подтверждает принадлежность выделенной культуры к родам Proteus, Providencia, Morganella. В последнем случае положительной реакцией является окрашивание реактива и подлежащего слоя среды в вишнево-красный, оранжево-красный или оранжевый цвета (наступает в течение первых минут), отрицательной - окрашивание реактивов в желтый цвет и подлежащего слоя среды - в светло-бурый. на среде "ПП" образуется в виде черных точек в толще столбика, через 2-3 часа после добавления реактива увеличивающихся до сплошной черной полосы, что отличает P. mirabilis и P. vulgaris от других представителей этой группы микроорганизмов.

Посевы в среду "ИнАд" инкубируют при 37°С в течение 18-20 часов. Среда "ИнАд" позволяет определять ферментацию инозита и адонита. При положительном результате цвет среды с темно-зеленого меняется на желтый, что позволяет дифференцировать P. alcalifaciens (адонитположительная) от P. stuartii (инозитположительные), а P. rettgeri (инозит- и адонитположительные колонии) от других видов протеев (см. табл. 2).

Определение P. aeruginosa

Определение синегнойной палочки схематически приведено на рис. 3. Отбор проб производят согласно разделу 2. Посев исследуемого материала осуществляют на одну из плотных селективных сред: ацетамидный агар, аргининную среду, среду с бриллиантовым зеленым, цетилпиридиний хлоридом (ЦПХ), цетримидную. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов и затем учитывают морфологические особенности колоний P. aeruginosa. На среде ЦПХ колонии P. aeruginosa средних размеров, отдельные колонии крупные, плоские, с матовой поверхностью. Пигментные штаммы и среда вокруг них окрашены в зелено-желтый, синевато-красный цвет.

На цетримидной среде колонии средних размеров, с неровными краями, шероховатые, с зелено-бурым, диффундирующим в среду пигментом, апигментные штаммы образуют матовые колонии.

На аргининной среде колонии P. aeruginosa плоские, среднего размера, красного цвета за счет образования формазана в присутствии ТТХ.

На ацетамидном агаре колонии мелкие, с ровным краем, матовые, чаще с ярким серебряным блеском. Пигментные штаммы образуют зеленовато-синеватый пигмент, диффундирующий в толщу среды.

На среде с бриллиантовым зеленым колонии средних размеров с ровным краем, иногда фестончатые; пигментные штаммы растут в виде зеленоватых колоний, апигментные - бесцветные.

Культуры P. aeruginosa обладают специфическим ароматическим запахом земляничного мыла, жасмина, фиалки, цветов липы и др. Для идентификации P. aeruginosa с плотных селективных питательных сред снимают 1-2 пигментных и 3-4 апигментных колонии на среду Кинг А. Посев на эту среду производят бляшками и выдерживают в термостате при 37°С 20-24 часа. При отсутствии пигмента посевы оставляют при комнатной температуре еще на 24 часа. Учитывают типичной формы колонии: уплощенные, с шероховатой поверхностью, неровными краями и кружевным венчиком, образующимся в результате ограниченного роения культуры. При косом освещении улавливается серебристый блеск. Пигмент чаще всего имеет буроватую окраску с варьированием оттенков, в зависимости от преобладания того или иного пигмента - от сине-зеленого до коричнево-красного. Пигмент образуется вокруг колоний и диффундирует в толщу среды. При наличии пигмента и характерной морфологии на среде Кинг А идентификация P. aeruginosa на этом заканчивается. Апигментные штаммы подвергают дальнейшим исследованиям: колонии микроскопируют, определяют цитохромоксидазу, делают посев в среду OF и нитратную среду. Для этой цели со среды Кинг А снимают 2-3 колонии и окрашивают по Граму. P. aeruginosa - грамотрицательные палочки, подвижные, не образуют спор. Одновременно на среде Кинг А проверяют цитохромоксидазную активность колоний путем нанесения раствора каплями на макроколонии, при этом колонии P. aeruginosa в течение 15-30 секунд становятся темно-синими. Учет производят не позднее чем через 3 мин, по истечении которых все колонии с нанесенным реактивом синеют. Цитохромоксидазную активность можно проверить путем нанесения культуры на фильтровальную бумагу, пропитанную свежеприготовленным раствором, или при помощи СИБов.

Посев культур в нитратную среду производят уколом до дна пробирки, выдерживают при 42°С в течение 20-24 часов, при положительном ответе отмечают рост культуры в виде помутнения среды и образования на поверхности среды пузырьков газа. При применении нитратного бульона газ учитывается в поплавках.

Отличие P. aeruginosa от других видов псевдомонад - возбудителей внутрибольничных инфекций осуществляют дифференциально-диагностическими тестами, приведенными в табл. 4.

Определение бактерий рода Acinetobacter

Отбор проб патологического материала для качественной оценки результатов производят в 10 мл стерильной жидкой накопительной среды ЭАС-1. Смывы с предметов, аппаратуры, рук персонала осуществляют непосредственно средой ЭАС-1 (10 мл). Затем посевы на среде ЭАС-1 выдерживают при 30°С в течение 48 часов. При положительном результате на поверхности среды образуется бесцветная пленка. С поверхности пленки материал пересевают на 2-4 сектора среды ЭАС-2 и инкубируют при 30°С в течение 24 часов. Отбор проб при количественной оценке результатов проводят согласно разделу 2.

Посев осуществляют на среду ЭАС-2 и также выдерживают при 30°С в течение 24 часов, при отсутствии роста посевы оставляют еще на 24 часа при этой же температуре. На среде ЭАС-2 колонии A. calcoaceticus v. anitratus оранжевые, иногда желтые, средних размеров, выпуклые, с ровными краями. Колонии A. lwoffi, как правило, бледно-зеленые, мелкие, выпуклые, с ровными краями. Для идентификации снимают 2-3 колонии и проводят по тестам в соответствии с идентификацией неферментирующих грамотрицательных бактерий.

6. Серологическая идентификация выделенных культур

Определение сероваров бактерий рода Citrobacter

Определение сероваров возможно у C. freundii при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигено-диагностической схемой этих бактерий.

Первоначально эту культуру испытывают поливалентными O-сыворотками, CiOB, CiOF, CiOD, CiOG, каждая из которых включает антитела к ряду O-групп ("Наставление по применению O-сывороток для идентификации бактерий Цитробактер").

При работе с поливалентными сыворотками целесообразно начинать с сывороток CiOA, CiOB, CiOF в связи с большей частотой распространения в стране представителей соответствующих групп. При положительном результате реакции агглютинации с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культур с сыворотками к O-антигенам, входящим в состав поливалентной смеси. При наличии положительной реакции агглютинации с одной из указанных сывороток устанавливают серологическую группу O-штамма. При агглютинации культуры одновременно с двумя или тремя поливалентными O-сыворотками, содержащими общие антитела, культуру дополнительно испытывают с соответствующими факторными сыворотками и на основании полученных данных определяют антигенное строение штамма. После установления O-группы определяют H-антиген с использованием поливалентных и моновалентных H-сывороток. Для определения O- и H-антигена в реакции агглютинации на стекле используют 18-20-часовую культуру на СПА; реакцию проводят общепринятым способом.

Определение сероваров бактерий рода Proteus

Определение сероваров P. vulgaris и P. mirabilis возможно при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигено-диагностической схемой этих бактерий в соответствии с "Наставлениями по применению агглютинирующих диагностических протейных O- и H-сывороток". Для реакции агглютинации применяют суточную культуру на СПА, которую испытывают в начале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными O-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления O-группы определяют H-антиген, применяя вначале поливалентную, а затем моновалентные H-сыворотки.

Определение сероваров K. pneumoniae

Установление сероваров клебсиелл проводят путем определения капсульного антигена в реакции агглютинации на стекле при помощи капсульных K-сывороток. Для получения культуры в капсульной форме исследуемый штамм пассируют через углеводосодержащие среды (0,2% глюкозный бульон и агаровая среда Ворфеля-Фергюсона). Культуру засевают в 0,2% глюкозный бульон и инкубируют в течение 4 часов при 37°С, после чего пересевают на среду Ворфеля-Фергюсона и инкубируют при той же температуре 18-20 часов.

Для реакции агглютинации петлю агаровой культуры со среды Ворфеля-Фергюсона растирают на предметном стекле рядом с каплей соответствующей клебсиеллезной сыворотки, после чего их тщательно смешивают. Капсульная агглютинация наступает обычно очень быстро и имеет вид крупных хлопьев, тяжей или с трудом разделяемого диска. В сомнительных случаях реакция может наблюдаться в нескольких сыворотках при нахождении культуры в OK- или PK-формах; результат подтверждают в развернутой (пробирочной) реакции агглютинации в разведениях сыворотки 1:2, 1:4. (Проведение реакции агглютинации и отбор культур в K-форме осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению клебсиеллезных диагностических агглютинирующих сывороток".)

7. Ориентировочные критерии эпидемического неблагополучия в стационаре (отделении)

Для оценки эпидемической ситуации необходимо использовать следующие показатели.

1). Широкий набор маркеров устойчивости у штаммов, колонизующих больных и вызывающих гнойно-септические заболевания: наличие устойчивости к гентамицину, цефалоспоринам.

2). Широкое распространение среди больных в палате, отделении одного и того же штамма грамотрицательных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью; обнаружение того же штамма в окружающей среде стационара.

3). Спорадическая заболеваемость в стационаре, связанная с обнаруженными штаммами.

Таким образом, обнаружение у 6-10 исследованных пациентов одного и того же штамма грамотрицательных бактерий, определение у штамма 6-8 маркеров устойчивости, широкое распространение этого штамма в объектах окружающей среды стационара, этиологически обусловленная спорадическая заболеваемость в стационаре свидетельствуют о необходимости проведения санитарно-гигиенических и дезинфекционных мероприятий в лечебном стационаре.

______________________________

* Питательные среды, тест-реактивы, растворы индикаторов указаны в Приложении 2.

Заместитель министра

К.И. Акулов

Согласовано

Зам. начальника Главного управления
научно-исследовательских институтов
и координации научных исследований

В.М. Христюк

2 июня 1986 г.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Приложение 1. Аппаратура, лабораторное оборудование

Приложение 2. Питательные среды, тест-реактивы, растворы индикаторов

ГАРАНТ:

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас