Приложение 2. Питательные среды, тест-реактивы, растворы индикаторов

Приложение 2

Питательные среды, тест-реактивы, растворы индикаторов

1. Пептонная вода. К 1000 мл дистиллированной воды добавить 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Подогреть до растворения пептона, профильтровать, установить pH 7,2-7,4 и стерилизовать при 120°С 20 минут.

2. Мясопептонный бульон. К 1000 мл мясной воды добавить 10 г пептона, 5 г хлорида натрия. После растворения ингредиентов установить pH 7,2-7,4 и стерилизовать при 120°С 20 минут.

3. Мясопептонный агар. К 1000 мл мясопептонного бульона добавить 15 г мелко нарезанного агара в волокнах или порошке. После 10-15-минутного набухания агар-агара смесь кипятить при постоянном помешивании до полного его растворения. Полученную среду после установления pH 7,2-7,4 профильтровать в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный кипятком, разлить во флаконы и пробирки и стерилизовать при 120°С 20 минут.

4. Кровяной агар (5%). К 1000 мл питательного агара (pH 7,2-7,4), расплавленного и охлажденного до 50-55°С, прибавить 50 мл дефибринированной или цитратной крови животного (барана, кролика, крупного рогатого скота) или человека. Агар с кровью тщательно перемешать, избегая образования пены, и стерильно разлить в чашки.

5. Среда Эндо модифицированная. Среду готовят из сухого препарата по прописи на этикетке. В готовую охлажденную до 60-70°С среду добавить 1,25 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового из расчета на 100 мл среды для ингибиции грамположительных микроорганизмов. Разлить в чашки по 15-18 мл.

6. Дифференциально-диагностическая среда П-2 для выделения протеев. В 100 мл растопленного 2% питательного агара добавить 3 мл дрожжевого экстракта, 1 г маннита, 1 г мальтозы, 0,8 г желчных солей по Олькеницкому, 0,2 г цитрата аммоний-железа, 0,05 г тиосульфата натрия, 2,5 мл 0,01% раствора кристаллического фиолетового, 0,5 мл 1,6% щелочного раствора фенолового красного, pH 7,4-7,7. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, прибавить 10-12 тыс. ЕД полимиксина М, разлить в чашки. Среда должна иметь красно-коричневый цвет.

7. Дифференциально-элективная среда К-2 для выделения клебсиелл. К 100 мл дистиллированной воды добавить агар-агара 2 г, хлорида натрия 0,5 г, сульфата магния 0,02 г, сульфата калия 0,02 г, двузамещенного фосфата калия 0,2 г, однозамещенного фосфата калия 0,08 г, раффинозы 0,5 г (возможна замена 5 г сахарозы), pH 7,0-7,2. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин. После стерилизации прибавить 0,5 мл 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего, 2 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового, 0,2 мл 50% водного самостерилизующегося раствора мочевины, смешать. Смесь разлить в чашки Петри слоем 3-5 мм.

Раствор мочевины самостерилизующийся (50%) готовить следующим образом: 50 г мочевины растворить в 100 мл стерильной дистиллированной воды (в стерильной посуде), выдержать при комнатной температуре 2-3 суток для "самостерилизации". Последующее хранение при +4° - +6°С.

8. Ацетамидный агар для выделения псевдомонад. К 100 мл дистиллированной воды прибавить хлорида натрия 0,5 г, сульфата магния 0,02 г, фосфата аммония однозамещенного 0,1 г, фосфата калия двузамещенного 0,1 г, ацетамида 2 г, агара 2,0 г, pH 6,7. Стерилизовать при 0,5 атм 15 минут.

9. Аргининная среда для выделения псевдомонад. К 0,3 г аргинина монохлорида добавить хлорида магния 0,02 г, однозамещенного фосфата калия 0,08 г, тиосульфата натрия 0,1 г, агара 2 г, воды до 100 мл, pH 7,2-7,4. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, разлить в 6 чашек. После застывания поверхность среды залить тонким слоем другой среды: агара 2 г, трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) 0,8 г (или 8,0 мл 10% водного раствора ТТХ), воды до 100 мл. Инкубация 42-44 часа при 37°С.

10. Среда с бриллиантовым зеленым для выделения псевдомонад. К 100 мл расплавленного стерильного питательного агара прибавить 1 мл аптечного раствора бриллиантового зеленого, предварительно разведенного физиологическим раствором 1:10. Среду разлить в чашки.

11. Среда с цетилпиридиний хлоридом для выделения P. aeruginosa. К 100 мл дистиллированной воды прибавить пептона 2 г, калия сернокислого 0,7 г, магния хлористого 0,15 г, магния сернокислого 0,15 г, N-цетилпиридиния хлорида 0,2 г, агар-агара 1 г, pH 6,8-7,0, стерилизовать при 0,5 атм 15 мин.

12. Среды для выделения бактерий рода Acinetobacter.

А. Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной воды добавить фосфата натрий-аммония 0,15 г, фосфата калия однозамещенного 0,04 г, сульфата калия 0,02 г, хлорида магния 0,02 г. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин прибавить 1,2 мл этилового 96% спирта и разлить асептично по 10 мл в пробирки.

Б. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавить 1,5 г агара (порошкового 1,8 г) и 0,5 мл 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего.

13. Среды для теста на окисление-ферментацию (OF).

А. Среда Хью-Лейфсона. К 100 мл дистиллированной воды добавить 0,2 г пептона, 0,5 г хлорида натрия, 0,03 г , 0,3 г агар-агара, 1 г углевода (глюкоза, фруктоза), 0,3 мл 1% водного раствора бромтимолового синего. Среду кипятить до полного растворения ингредиентов, установить pH 7,1-7,2, разлить по 3-4 мл в пробирки, стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, остудить столбиком.

Б. Среда Хью-Лейфсона модифицированная. К 100 мл дистиллированной воды добавить 0,2 г пептона, 0,5 г хлорида натрия, 0,3 г , 0,4-0,6 г агар-агара, 1 г углевода (глюкоза, фруктоза), 0,5 мл 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего. После растворения ингредиентов в водяной бане установить pH 7,1-7,2, разлить в пробирки высотой 6-8 см. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, остудить столбиком. Учет теста на окисление-ферментацию см. в разделе 3.

14. Агар Симмонса для определения цитратного признака. К 100 мл дистиллированной воды прибавить 2 г агара, натрия аммония фосфорнокислого 0,15 г, калия фосфорнокислого одноосновного 0,1 г, магния сернокислого 0,02 г, натрия лимоннокислого 0,3 г, 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего 1 мл. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, разлить в стерильные пробирки по 5-7 мл, остудить в скошенном состоянии, оставляя столбик 2-2,5 см. Коммерческая сухая среда готовится согласно указаниям на этикетке препарата. Цитрат-положительные бактерии изменяют зеленый цвет среды на синий.

15. Среда для определения продукции индола. Выявляет индол при росте культуры на агаре Симмонса. К 100 г дистиллированной воды добавить триптофана 0,05 г, пептона 0,1 г, 0,5 г. Стерилизовать при 0,5 атм 12-15 мин. После инкубации посева на агаре Симмонса при 37°С в течение 18-20 час., в случае щелочения поверхности среды, сверху налить 1 мл среды для определения продукции индола, тщательно встряхнуть пробирку и инкубировать ее 2-4 часа при 37°С. Затем на поверхность среды наслоить 0,1-0,2 мл реактива Ковача. Учет реакции в течение первых 5 мин. Индол-положительные микроорганизмы дают малиновое окрашивание кольца.

Тест-реактив Ковача для определения индола: к 75 мл амилового или изоамилового спирта добавить пара-диметиламидобензальдегида 5 г, концентрированной соляной кислоты 25 мл.

16. Среда с мочевиной Кристенсена для определения уреазной активности. К 100 мл дистиллированной воды добавить пептона 0,1 г, натрия хлорида 0,5 г, калия дигидрофосфата 0,2 г, агара 2 г, глюкозы 0,1 г, фенолового красного (0,2% раствор) 0,6 мл, мочевины (20% раствор водный) 10 мл.

Пептон, соли и агар растворить при нагревании, установить pH 6,8-6,9, профильтровать, простерилизовать при 115°С 20 мин, добавить глюкозу и индикатор. Затем стерилизовать текучим паром 1 час и охладить до 50-55°С. Раствор мочевины асептично добавить к основе. Готовую среду разлить в стерильные пробирки и охладить в скошенном положении. При положительном результате среда из желтоватой становится красной в сроки от нескольких часов до 4 суток.

17. Среда с мочевиной Преуса для определения уреазной активности. К 100 мл бульона Хоттингера добавить агара 1,5 г, глюкозы 0,5 г, мочевины (50% самостерилизующегося водного раствора) 2 мл, бромтимолового синего 0,2% водного раствора 1,2 мл. Агар расплавить в бульоне, при подогревании профильтровать, установить pH 6,9-7,0. Стерилизовать при 120°С 20 мин. К стерильному питательному агару добавить глюкозу, мочевину, индикатор. Повторно простерилизовать текучим паром однократно 15 мин, после чего скосить. Цвет среды - оливковый, при положительном результате становится синим.

18. Среда Кларка для реакции с метиловым красным и выявления продукции ацетоина. К 100 мл дистиллированной воды добавить пептона 0,5 г, глюкозы 0,5 г, 0,5 г. После растворения ингредиентов среду стерилизовать при 0,5 атм 12-15 мин, хранить в холодильнике. Перед употреблением разлить асептично в пробирки по 1,0 мл. Посев должен быть массивным. Инкубация 24 часа и более при 37°С. Далее прибавить 0,1-0,2 мл реактива Кларка. Определение феномена Кларка (реакция с метиловым красным) возможна и на стекле. На предметное стекло наносят каплю реактива Кларка и каплю среды Кларка с посевом после инкубации. В обоих случаях покраснение среды указывает на прекращение микробного метаболизма в результате резко кислой реакции среды (положительная реакция); желтый цвет свидетельствует о продолжающемся метаболическом процессе и щелочении среды за счет расщепления пептона (отрицательная реакция).

После учета результатов феномена Кларка в той же пробирке можно определить и реакцию Фогеса-Проскауэра (наличие ацетоина): прибавить 0,2-0,3 мл реактива Баррита и 0,1 мл 40% водного раствора KOH. Появление на поверхности среды кольца окраски разной степени интенсивности - от розового до ярко-красного в течение от 5-10 мин до 2 час. указывает на продукцию ацетоина.

Тест-реактивы.

А. Для реакции с метиловым красным (реактив Кларка). Растворить 0,1 г метилового красного в 300 мл этилового спирта 96°, затем добавить 200 мл дистиллированной воды.

Б. Для реакции Фогеса-Проскауэра. 1. Реактив Баррита: 5 г альфа-нафтола растворить в 100 мл 96° этилового спирта. 2. 40% водный раствор гидроокиси калия (KOH).

19. Среды для определения декарбоксилаз лизина, аргинина, орнитина. К 40 мл мясной воды добавить 0,5 г пептона, 0,1 г глюкозы, 60 мл дистиллированной воды, 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего, 1,0 г L-аминокислоты или 2 г DL-аминокислоты, 0,3 г (0,5 мл) дрожжевого экстракта. В воде растворить белковую питательную основу и глюкозу. Установить pH 6,0-6,1. Затем разделить на 4 равные части. В каждую из трех порций внести одну из аминокислот, четвертая порция без аминокислоты является контрольной. Среды кипятить 5-10 мин, вновь установить pH 6,0-6,1, прибавить индикатор и разлить в пробирки по 2-3 мл. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. При расщеплении аминокислот цвет среды становится из желтого синим. Цвет контрольной среды остается желтым.

20. Среда для определения фенилаланиндезаминазы. К 100 мл дистиллированной воды добавить 1,2 г агара, 0,9 г дрожжевого экстракта, 0,1 г фенилаланина, 0,1 г и 0,5 г хлорида натрия. Ингредиенты смешать, среду кипятить 5 мин и разлить в пробирки. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 30 мин, сразу же после стерилизации скосить. На скошенную поверхность агара с выросшей культурой наслоить 4-5 капель 10% раствора хлорида железа. В случае образования фенилпирувиновой кислоты поверхность агара приобретает зеленый цвет.

21. Среды для определения оксидации рамнозы, сорбита, арабинозы. К 100 мл дистиллированной воды добавить пептона 0,5 г, 0,08 г, хлорида натрия 0,5 г, агара 1,2 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 0,5 мл, углеводов: рамнозы 2 г, арабинозы 2 г, сорбита 3 г. Среды готовить с каждым углеводом отдельно. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин разлить в чашки. Посев осуществлять макроколониями (10-12 колоний на чашке), инкубация при 37°С в течение 18-20 часов. Положительный результат (оксидация углевода) определяется пожелтением среды. Кроме рекомендуемых сред, для определения оксидации рамнозы, сорбита, арабинозы можно использовать среды Гисса.

22. Среда для определения оксидации мальтозы. К 100 мл дистиллированной воды добавить 0,2 г пептона, хлорида натрия 0,5 г, агара 2 г, мальтозы 2 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 1 мл. Стерилизация при 0,5 атм 15 мин. Среду разлить в 6 чашек. Посев макроколониями (10-12 колоний на чашке). Инкубация при 37°С 18-20 часов. Положительный результат - пожелтение среды.

23. Среда для определения оксидации ксилозы. К 100 мл дистиллированной воды добавить 0,2 г пептона, агара 1,5-2 г, хлорида натрия 0,5 г, ксилозы 2 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 1 мл, pH 7,2. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин; среду разлить в 6 чашек. Посев макроколониями (12-18 колоний на чашке). Положительный результат - пожелтение среды.

24. Среда для определения оксидации 10% лактозы. К 100 мл дистиллированной воды добавить пептона 0,2 г, хлорида натрия 0,5 г, лактозы 10 г, 0,03 г, агара 0,4-0,6 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 0,5 мл. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. Разлить асептично в пробирки столбиком высотой 6 см. Посев уколом. Положительный результат - пожелтение среды.

25. Среда ИнАд для определения оксидации инозита и ферментации адонита. Среда двухслойная. Нижний слой: к 100 мл дистиллированной воды прибавить хлорида натрия 0,5 г, фосфата калия однозамещенного 0,1 г, адонита 0,3 г, агара 1 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 0,2 мл, pH 7,2-7,4. Ингредиенты растворить в водяной бане в течение 15 мин, разлить по 3-4 мл в пробирки, стерилизовать при 0,5 атм 15 мин, остудить столбиком. Верхний слой: к 100 мл дистиллированной воды прибавить пептона 0,5 г, фосфата калия двузамещенного 0,03 г, хлорида натрия 0,5 г, инозита 0,5 г, агара 1,5 г, 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего 0,5 мл, стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин, разлить асептично поверх нижнего слоя в количестве 4-5 мл, скосить, оставив столбик высотой 0,5-1,0 см. Посев штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Положительный результат - пожелтение среды.

26. Среда для определения амилазы. К расплавленному питательному агару Дагестанского НИИ питательных сред, приготовленному по стандартной прописи, добавить от 0,2% до 1% растворенного крахмала. Разлить в пробирки по 4-5 мл, стерилизовать при 0,5 атм в течение 30 мин и скосить. Испытываемую культуру засеять штрихом на поверхность среды и инкубировать при 37°С в течение 18-24 час., после чего на поверхность косяка налить 2-3 мл раствора Люголя. Отсутствие синего окрашивания свидетельствуют о наличии амилазы.

27. Среда для определения желатиназной активности.

А. В 100 мл дистиллированной воды добавить 10 г желатины, оставить на 40-60 мин для набухания. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. Асептично разлить в пробирки по 5-6 мл. Посев уколом в теплую среду, инкубировать в термостате под углом в 45°. Положительный результат - разжижение желатины.

Б. Среда двухслойная. Нижний слой: 1,5% голодный агар разлить в чашки. Верхний слой: в 100 мл дистиллированной воды (или МПБ) добавить пептона 0,5 г, желатины 15 г, 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового 1,5 мл. Стерилизация при 0,5 атм в течение 15 мин. Верхний слой: разлить после застывания нижнего слоя, чашки оставить на сутки в холодильнике, не переворачивая. Посев макроколониями (10-12 колоний на чашке). Посев оставить при комнатной температуре под бумажной и стеклянной крышками. Учет производить через 24-48 часов. Положительный результат - разжижение желатины в месте посева в виде кратерообразного углубления.

28. Среда для определения нитрат-нитритредуктазы и выявления способности роста культуры при 42°С. К 80 мл дистиллированной воды добавить пептона 2 г, хлорида натрия 0,5 г, нитрата калия 0,2 г, агара 0,1 г, дрожжевого экстракта 20 мл. Дрожжевой экстракт и вода могут быть заменены мясопептонным бульоном. В этом случае содержание пептона следует уменьшить до 1 г. После растворения компонентов в водяной бане среду разлить в пробирки по 4-5 мл, стерилизовать при 0,5 атм, остудить столбиком. Положительный результат - наличие роста (помутнение) и образование пузырьков газообразного азота на поверхности среды.

29. Среда "ПП" для видовой дифференциации протеев. Среда двухслойная. Нижний слой: к 100 мл дистиллированной воды прибавить глюкозы 0,2 г, агара 0,6 г, фосфата калия однозамещенного 0,1 г, фосфата калия двузамещенного 0,04 г, хлорида натрия 0,5 г, пептона 0,1 г, 1% водного раствора нейтрального красного 1 мл. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. После стерилизации прибавить 1 мл 50% самостерилизующегося раствора мочевины, разлить асептично по 3-4 мл в пробирки и остудить столбиком. Верхний слой: к 200 мл дистиллированной воды прибавить агара 1,2-1,4 г (в зависимости от сорта агара минимальное количество, способное сохранить при застывании скошенное положение), дрожжевого экстракта 30 мл или ЭКД 1,2 г. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин, прибавить 0,4 г DL-триптофана, 0,06 г тиосульфата натрия и 0,2 г натрий-аммоний фосфорнокислого , растворенных в небольшом количестве воды и подогретых в водяной бане до 100°С. Разлить асептично поверх нижнего слоя по 6 мл, скосить столбиком высотой 1-1,5 см. Посев штрихом по скошенной поверхности и уколом до дна пробирки. Далее между стенкой пробирки и пробкой поместить полоску реактивной на индол бумаги. После культивирования посевов в течение 18-20 часов при 37°С учесть наличие уреазной активности, продукцию индола и газа на глюкозе. Далее в пробирку налить реактив для определения триптофандеаминазы и сероводорода.

Тест-реактив для определения триптофандеаминазы и продукции сероводорода: к 13 г хлорного железа добавить HCl 1,3 мл, дистиллированной воды до 100 мл. Реактив хранить в банке с притертой пробкой.

30. Среда для определения активности ДНК-азы. Среда готовится согласно методу, представленному в Приказе N 720 МЗ СССР от 31/VII-1978 г.

31. Полужидкий агар для определения подвижности. В 1000 мл дистиллированной воды добавить гидролизат Хоттингера до содержания в среде 120-150 мг аминного азота, 5 г натрий хлорида (NaCl), установить pH 7,2-7,4, добавить 3-4 г агара, расплавить его при подогревании и постоянном помешивании среды. Затем профильтровать через ватно-марлевый, меткалевый фильтры или через фильтровальное полотно "Бельтинг". Среду разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать при 120°С в течение 30 мин и охладить в виде столбика. Определение подвижности бактерий проводить при посеве уколом в столбик агара. Подвижные микробы растут в толще среды по ходу укола.

32. Среда Кинг-А для выявления пиоцианина. К 2 г пептона добавить агар-агара 1,5 г, глицерина 1 мл, сульфата калия 1 г, хлорида магния 0,14 г, воды дистиллированной до 100 мл, pH 7,2. Стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин, разлить в чашки. Положительный результат - окрашивание среды вокруг колоний в зеленый, синий, сине-зеленый и бурый цвета.

33. Среда FN для определения флюоресценции. К 100 мл дистиллированной воды добавить пептона 1 г, 0,15 г, 0,15 г, 0,2 г, 0,05 г, агар-агара 1,5 г, фенолового красного 0,002 г, pH - 7,2. Готовую среду разлить в пробирки по 4 мл, автоклавировать при 0,5 атм в течение 30 мин, скосить. Культуру засеять штрихом на поверхность скошенной среды, инкубировать 18-24 часа при 37°С. Флюоресценцию наблюдать в УФ-свете с помощью ультрафиолетового облучателя для обнаружения витаминов в растворе (модель 833).

34. Тест-реактивы для определения цитохромоксидазы.

А. 1% спиртовой раствор .

Б. 1% водный раствор диметил-парафенилендиамина (пара-аминодиметилфенилендиамина хлорида или оксалата). Растворы хранить в темных флаконах с притертыми пробками в холодильнике, первый - до 1 месяца, второй - до 1 недели. Перед употреблением к трем частям реактива "А" добавить 7 частей реактива "Б". Положительный результат - интенсивное посинение колонии или мазка из нее на фильтровальной бумаге в течение 20-40 с после добавления капли реактива. Позднюю реакцию, как и посинение самой агаровой среды, не учитывать. Реактив может быть заменен готовой бумажной индикаторной системой.

35. Реактивы для окраски бактерий по Граму. Использовать реактивы и проводить окраску по Граму следует в соответствии с ГОСТ 18963-73 или "Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями", М., 1984.

36. Индикаторы: 1,6% щелочные растворы бромтимолового синего и фенолового красного. В 16 мл 0,2% раствора едкого натра (NaOH) растворить 0,5 г краски и добавить 15 мл дистиллированной воды.