Приложение Б (справочное). Определение количества клеток бактерий в грунте методом десятикратных граничных разведений

Приложение Б
(справочное)

Определение количества клеток бактерий в грунте методом десятикратных граничных разведений

Б.1 Определение количества сульфатредуцирующих бактерий

Стерильную питательную среду Постгейта В, приготовленную по приложению В, разливают стерильной градуированной пипеткой по 18 см ³ в стерильные сухие бактериологические пробирки. Объем бактериологических пробирок 20 ( 2) см ³. Объем среды - до заполнения пробирки 1-2 см ³. На каждой пробирке пишут порядковый номер, отвечающий номеру разведения, начиная с цифры 2. Первое разведение получают в колбе с 10 навеской грунта и 90 см ³ стерильной водопроводной воды (1:10). Потом переносят стерильной пипеткой 2 см ³ грунтовой суспензии из колбы в первую пробирку с 18 см ³ среды. Получают второе разведение - 1:100. Суспензию из этого разведения тщательно перемешивают, закрыв пробирку стерильной резиновой пробкой. Далее другой стерильной пипеткой отбирают 2 см ³ полученного разведения и переносят в следующую пробирку, получая третье разведение - 1:1000. Аналогичным способом далее готовят последующие разведения. Степень разведения определяют, исходя из количества бактерий в пробе грунта и, соответственно, число разведений тем больше, чем больше бактерий в исследуемом грунте. Во все пробирки после получения разведений добавляют стерильную питательную среду для вытеснения воздуха из пробирки и герметично закрывают стерильными резиновыми пробками. Пробирки устанавливают в штатив, который помещают в термостат при температуре (28  2) °С и инкубируют не менее 20 суток. Параллельно с посеянными пробирками в термостат ставят пробирки со стерильной питательной средой (контроль среды).

Б.2 Определение количества автотрофных ацидофобных тионовых бактерий

Стерильную питательную среду Бейеринка согласно приложению В разливают стерильной пипеткой по 13,5 см ³ в стерильные сухие бактериологические пробирки. Затем переносят стерильной пипеткой 1,5 см ³ почвенной суспензии в первую пробирку с 15 см ³ питательной среды. Получают второе разведение - 1:100. Полученную суспензию тщательно перемешивают с помощью другой стерильной пипетки, набирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию. Эту процедуру повторяют трижды, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой набирают 1,5 см ³ полученного разведения и переносят его в другую пробирку, получая третье разведение - 1:1000. Степень разведения обуславливается возможным количеством бактерий в пробе грунта. Контролем среды является пробирка со стерильной средой Бейеринка. Пробирки нумеруют, помещают в термостат при температуре (28  2) °С и выдерживают не более чем 7 суток.

Б.3 Обработка результатов

После инкубации пробирок в термостате наличие роста сульфатредуцирующих бактерий определяют визуально по почернению среды и наличию черного осадка вследствие образования сульфида железа.

Порядковый номер пробирки, в которой еще наблюдается рост бактерий, отвечает порядку численности бактерий в 1 см ³ грунтовой суспензии.

Количество бактерий А (клеток/г АСГ ^-1) в 1 г грунта определяют по формуле

,

(Б.1)

где К _вл. - коэффициент влажности;

Т _бак. - количество бактерий в 1 см ³ исходной грунтовой суспензии.

Коэффициент влажности (К _вл., %) рассчитывают по формуле

,

(Б.2)

где Р - относительная влажность грунта, %.

Относительную влажность грунта определяют по ГОСТ 28268.

Б.4 Оформление результатов

Результаты посева и расчетов заносят в протокол, в котором указывают:

- место отбора образцов почв;

- глубина укладки подземного сооружения;

- погодные условия при отборе образцов почв;

- дата проведения отбора проб и проведения определений;

- визуальные наблюдения (окраска, запах);

- количество бактерий (А) в 1 г почв (исследуемого и контрольного);

- коэффициент влажности почв (К _вл);

- обозначение настоящего стандарта;

- фамилия, инициалы лица, проводившего определения.