Методические указания МУК 4.1.2331-08 "Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 15 февраля 2008 г.)

Методические указания МУК 4.1.2331-08
"Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 15 февраля 2008 г.)

Дата введения: 10 апреля 2008 г.
Введены впервые в качестве дополнения

1. Вводная часть

Действующее вещество: клотианидин.

Структурная формула:

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).

Мол. масса: 249.7.

Брутто формула: .

Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха. Температура плавления 176.8°С. Давление пара - мПа (25°С). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода (25°С). рКа = 11.09 (20°С).

Растворимость в воде (20°С) - 0.304 (pH 4), 0.34 (pH 10) .

Растворимость в гептане <0.00104, в ксилоле 0.028, дихлорметане 1.32, метаноле 6.26, октаноле 0.938, ацетоне 15.2, этилацетате 2.03 г/л (25°С).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс (4 ч) > 6.1 мг/л. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, не опасен при использовании в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.

Область применения: инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

Гигиенические нормативы для клотианидина в России не установлены.

2. Методика определения клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клотианидина в воде водоемов в диапазоне концентраций 0.001-0.01 мг/кг, в почве - 0.05-0.5 мг/кг, в клубнях картофеля - 0.01-0.1 мг/кг и в ботве картофеля - 0.02-0.2 мг/кг.

Методика основана на определении клотианидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ацетоном (ботва и клубни картофеля) или водно-ацетоновой смесью (почва) с последующей очисткой методом твердофазной экстракции.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности), , %	Стандартное отклонение повторяемости, , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Вода	0.001-0.01	100	4.2	11.8	16.5
Почва	0.05-0.1	50	5.0	14.0	19.6
Почва	0.1-0.5	25	4.8	13.4	18.7
Ботва	0.02-0.1	50	5.4	15.1	21.1
Ботва	0.1-0.2	25	5.0	14.0	19.6
Клубни	0.01-0.1	50	5.9	16.5	23.1

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения клотианидина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Вода	0.001	0.001-0.01	87.4	4.8	4.4
Почва	0.05	0.05-0.5	96.5	5.2	4.7
Ботва	0.02	0.02-0.2	81.1	5.6	5.1
Клубни	0.01	0.01-0.1	85.7	6.3	5.7

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения клотианидина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, о.с.ч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "Криохром", сорт 1 или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная или деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Клотианидин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Кислота трифторуксусная, ч, ТУ 6-09-3877-80, свежеперегнанная; 0.05% водный раствор.

Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.

Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-76 с изм. N 1, 2, 3.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05М% трифторуксусной кислоты (30:70 или 20:80, по объему).

Патроны для твердофазной экстракции Диапак С16 ("БиоХимМак СТ").

Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0.040-0.063 mm), Merck.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или "Breeze" фирмы "Waters" или аналогичный.

Аналитические колонки ACQUITY UPLC BEH С18 (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) и ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100х2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) или Spherisorb ODS2 (2,1х150) мм, 3 мкм (Waters).

Баня ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008 или аналогичная.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, Buchi R-205 или аналогичный.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Испаритель одноканальный "ПЭ-2300" для концентрирования экстрактов в токе азота.

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2, ТУ 5.375-4261-76.

Бидистиллятор.

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами).

Шприц медицинский с разъемом Льюера, ГОСТ 22090.

РН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 , ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 22292-74.

Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 и от 1 до 5 .

Сито с диаметром ячеек 1 мм.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остаточных количеств пестицидов хранят в морозильной камере при температуре -18°С.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объема 1,0 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1-0.2 /мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0.05% раствора трифторуксусной кислоты 0.5 свежеперегнанной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 , доводят объем до метки бидистиллированной или деионизованной водой и перемешивают.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску клотианидина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 , растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0.5 ). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 0.5, 0.75 и 1.0 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрила и 0.05% трифторуксусной кислоты (20:80, по объему). При изучении полноты извлечения клотианидина используют ацетонитрильные растворы вещества.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилсиликагелем - Диапак С16, осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 2 мл метанола и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патрона для дополнительной очистки экстрактов клубней и ботвы, заполненного Силикагелем 60 (0.5 г), осуществляют пропусканием 2 мл этилацетата.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение клотианидина в пробах воды

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный гексадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С и сухой остаток растворяют в 0.25 подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение клотианидина в пробах почвы

Образец почвы массой 10 г, предварительно просеянной через сито, помещают в коническую колбу емкостью 100 с притертой пробкой, прибавляют 10 воды и 40 ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют клотианидин в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр "красная лента"), осадок на фильтре промывают 5 ацетона. Экстракцию повторяют, используя в качестве экстрагента 50 смеси ацетон - вода (4:1). Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40°С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40°С) и сухой остаток растворяют в 5 подвижной фазы. 10 вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение клотианидина в пробах клубней и ботвы картофеля

Навеску измельченных клубней или нарезанной ботвы картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 . Прибавляют 50 ацетона и экстрагируют клотианидин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют с 50 ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин, суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°С до полного удаления ацетона. Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С16. Водный остаток пропускают через откондиционированный по п. 2.5.6 патрон, ополаскивают колбу 2 воды и тоже пропускают через патрон. Объединенный фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 этилацетата и выдерживают колбу в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Экстракт для дополнительной очистки вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 этилацетата. Фильтрат и промывку отбрасывают. Клотианидин элюируют 1 ацетона. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Сухой остаток при анализе клубней растворяют в 2 , а ботвы - в 4 подвижной фазы и 10 вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 - ACQUITY UPLC BEH С18 (100х2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды. Колонка 2 - ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100х2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб почвы, клубней и ботвы картофеля. Температура колонки . Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.05% трифторуксусная кислота в соотношении 30:70 и скорости потока 0,1 (колонка 1) и 20:80 и скорости потока 0.15 (колонка 2). Рабочая длина волны 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания клотианидина мин (колонка 1) и мин (колонка 2).

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф "Breeze" фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 270 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (150х2.1) мм, 3 мкм (Waters) для анализа воды, почвы, клубней и ботвы картофеля. Подвижная фаза ацетонитрил - 0.05% трифторуксусная кислота в соотношении 20:80. Скорость потока элюента 0.2 Дозируемый объем 20 .

Время удерживания клотианидина мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание клотианидина в образцах воды, почвы, клубней и ботвы картофеля (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где - площадь пика клотианидина в стандартном растворе, ;

- площадь пика клотианидина в анализируемой пробе, ;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора клотианидина, .

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина 1 , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.005 мг/кг*, где * - 0.005 мг/кг - предел обнаружения).

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

,

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

,

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где , X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, (3)

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко