Методические указания МУК 4.1.2299-07 "Определение остаточных количеств Бифентрина в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах методом газожидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2007 г.)

Методические указания МУК 4.1.2299-07
"Определение остаточных количеств Бифентрина в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2007 г.)

Дата введения: 25 декабря 2007 г.
Введены впервые

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Бифентрина в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах в диапазоне 0,01-0,1 мг/кг.

Фирма производитель: ФМС Европа НВ.

Торговое название: Семафор.

Название действующего вещества по ИСО: Бифентрин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-метил-3-илметил(Z)-(1RS, 3RS)-3-(2-хлор-3,3,3-трифторпроп-1-енил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 422,9.

Изомерный состав: цис-изомер - 97% (минимум), транс-изомер - 3% (максимум).

Химически чистое соединение представляет собой белый кристаллический порошок.

Физическое состояние технического продукта - вязкая, затвердевающая маслянистая жидкость.

Давление насыщенного пара 0,024 мПа при 25°C.

Температура плавления: 51-66°C (технического продукта), 68-70°C (чистого химического вещества).

Плотность при 25°C: 1,210 г/см3.

Коэффициент перераспределения октанол/вода: .

Плохо растворим в гептане, метаноле, воде, относительно хорошо растворим в н-гексане и хорошо в ацетоне, хлороформе, дихлорметане, диэтиловом эфире и толуоле.

Стабилен в водной среде при pH от 5,0 до 9,0. Он долго сохраняется на обработанных поверхностях в отсутствие света и относительно фотостабилен.

Период полураспада в почве от 2 до 4 месяцев (в зависимости от типа почвы).

Краткая токсикологическая характеристика. Бифентрин относится к опасным веществам по острой пероральной токсичности ( крысы - 54,5 мг/кг), малоопасным по дермальной ( кролики - >2000 мг/кг) токсичности и умеренно опасным по ингаляционной токсичности ( крысы >4940 ). Отрицательные побочные эффекты не обнаружены.

В России установлены следующие гигиенические нормативы

ДСД - 0,005 мг/кг/сут.

ВМДУ (мг/кг): кукуруза (зерно), подсолнечник (семена) - содержание вещества не допускается в данных продуктах (на уровне чувствительности метода контроля).

МДУ в растительных маслах не установлен.

Бифентрин - инсектицид и акарицид контактного и кишечного действия из группы синтетических пиретроидов, эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки), а также некоторых видов клещей.

Зарегистрирован в России и странах СНГ под торговым названием Семафор, ТПС, 200 г/л, для применения на подсолнечнике, кукурузе и сахарной свекле против проволочников с нормой расхода от 2-2,5 кг/га.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в Таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности) , % P = 0,95	Стандартное Отклонение повторяемости, , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Зерно кукурузы	0,01-0,1	50	5	14	18
Семена подсолнечника	0,01-0,1	50	6	17	20
Растительные масла	0,01-0,1	50	6	17	20

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в Таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Зерно кукурузы	0,01	0,01-0,1	86,8	2,73	2,27
Семена подсолнечника	0,01	0,01-0,1	83,0	3,81	3,33
Растительные масла	0,01	0,01-0,1	79,8	4,11	3,85

2. Метод измерений

Метод основан на определении Бифентрина методом капиллярной газожидкостной хроматографии с электронозахватного детектора после экстракции веществ органическим растворителем, очистки экстрактов путем перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и дополнительной очистки на колонках с Флоризилом.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Весы аналитические 11140, фирма "OHAUS".

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности г V600, "ACCULAB".

Колбы мерные вместимостью 10, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74;

Микрошприц Гамильтон, вместимостью 10 ;

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 , ГОСТ 20292-74.

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с детектором по захвату электронов с пределом детектирования по Линдану и приспособлениями для капиллярной колонки.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 , ГОСТ 1770.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт Бифентрина с содержанием 99,6% д.в. (фирма ФМСи);

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83;

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72;

Н-гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78;

Гелий очищенный марки "А", ТУ-51-940-80.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60-80 меш, фирма "Мерк".

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Стандартный раствор Бифентрина в ацетоне с концентрацией 1,0 (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы "SKLO UNION".

Банки с крышками для экстракции на 250 , полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 , ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Концентраторы грушевидные на 100 и 250 , НШ 29 КГУ - 100 (250) ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-1, метилсиликон, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Стаканы химические емкостью 50, 100 и 250 , ГОСТ 25336-82 Е.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 6-09-2678-77.

Центрифуга MPW-350e с набором полипропиленовых банок емкостью 200 мл.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К подготовке проб допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

7.1.1. Подготовка хроматографической колонки, заполненной Флоризилом, для очистки проб

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. Колонку промывают последовательно 10 этилацетата (остаток растворителя в колонке отжимают) и 10 гексана, смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.

7.1.2. Проверка хроматографического поведения Бифентрина на колонках с Флоризилом

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Бифентрина на колонке. В стакан емкостью 50 помещают 1 стандартного раствора Бифентрина в ацетоне с концентрацией 0,1 , добавляют 4 гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Промывают колонку 20 гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 25 смеси гексан:этилацетат - 9:1, отбирая последовательно по 5 элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 ацетона и вводят в хроматограф 1 . По результатам обнаружения Бифентрина в каждой фракции определяют объем смеси гексан:этилацетат - 9:1, необходимый для полного вымывания Бифентрина.

7.2. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 100 мг Бифентрина в мерной колбе на 100 см3, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1,0 мг/см3).

Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 3 месяцев.

Методом последовательного разбавления из раствора N 1 готовят стандартные растворы Бифентрина в ацетоне с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см3 для построения калибровочного графика и количественной оценки проб, которые могут храниться в холодильнике не более 1 месяца.

7.3. Построение градуировочного графика

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Бифентрина в растворе , устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 .

В испаритель хроматографа вводят по 1 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Бифентрина в растворе в (рисунок 1).

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79 г. а также в соответствии с ГОСТ 1129-93 "Масло подсолнечное. ТУ"; ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное. ТУ"; ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и отбора проб"; ГОСТ 13634-90 "Кукуруза".

9. Проведение определения

9.1. Семена подсолнечника и зерно кукурузы

9.1.1. Экстракция

Навеску измельченных семян 10 г помещают в полипропиленовую банку объемом 250 , добавляют 40 ацетона и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. По окончании экстракции экстракт центрифугируют 4 минуты при 4000 об./мин и супернатант сливают в колбу емкостью 250 через воронку с бумажным фильтром. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 ацетона, помещая смесь в ультразвуковую ванну соответственно на 5 минут. Экстракты объединяют.

Из объединенного экстракта отмеряют точно 50 , переносят в концентратор и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35°C до маслянистого остатка. В концентратор добавляют 30 гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку. Обмывают концентратор еще 20 гексана и гексановые фракции объединяют в делительной воронке.

Приливают в воронку 50 ацетонитрила, встряхивают ее в течение одной минуты. После разделения слоёв нижний ацетонитрильный слой сливают в концентратор емкостью 250 , а верхний гексановый слой возвращают в делительную воронку. Повторяют экстракцию еще 2 раза, используя для этого каждый раз по 30 ацетонитрила. Экстракты объединяют, а гексановую фракцию отбрасывают.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Объединённый экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35°C досуха.

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 ацетона, ополаскивают стенки концентратора, добавляют 100 воды и переносят водную фазу в делительную воронку.

Добавляют 30 гексана и интенсивно встряхивают смесь в течение 1-2 мин. После разделения слоёв нижний водный слой сливают в стакан, а верхний гексановый собирают в чистый концентратор емкостью 250 , пропуская через слой безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще два раза с тем же объемом гексана. Объединенный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30°C.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с Флоризилом

Сухой остаток в концентраторе, полученный по разделу 9.1.2., растворяют в 5 гексана, омывая стенки концентратора, и наносят на заранее подготовленную, как указано в разделе 7.1.1., колонку с Флоризилом, элюат отбрасывают. Колонку промывают 20 гексана, элюат отбрасывают. Пропускают через колонку 15 смеси гексан:этилацетат в соотношении 9:1, элюат собирают в концентратор емкостью 100 . Содержимое концентратора выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30°C.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 ацетона и 1 вводят в хроматограф.

9.2. Масло кукурузы и подсолнечника

Навеску масла 10 г растворяют в 50 гексана и переносят в делительную воронку. Добавляют в делительную воронку 40 ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 2 минут. После полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор 250 . Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 40 ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 2 минуты. Экстракты объединяют.

Далее проводят очистку экстракта, как указано в разделе 9.1.2. и 9.1.3.

9.3. Условия хроматографирования

Высокоэффективный газовый хроматограф "Кристалл 2000м" с детектором по захвату электронов (ЭЗД) с пределом детектирования по Линдану и приспособлениями для капиллярной колонки.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая HP-1, Methyl Siloxane, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 300°C, испарителя - 270°C, программированный нагрев колонки с 210°C (выдержка 2 мин) по 10 град./мин до 270°C (выдержка 2 мин).

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 20 см/с, давление 99,78 кПа.

Газ 2 (гелий) - 15 мл/мин: расход 0,5 мл/мин, сброс 1:30.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 мл/мин.

Абсолютное время удерживания: 8 мин 10 сек. .

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,01-0,1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю сумму площадей характерных пиков Бифентрина.

10. Обработка результатов анализа

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Бифентрина рассчитывают по формуле:

где X - содержание Бифентрина в пробе, мг/кг;

Sст - площадь (высота) пика стандарта, мВ;

Sпр - площадь (высота) пика образца, мВ;

A - концентрация стандартного раствора, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание Бифентрина в аналитическом стандарте, %.

D - коэффициент пересчета на аликвоту (2).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности P = 0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг"*

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

,

где, - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

,

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где , , среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

(3)

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

______________________________

* - 0.01 мг/кг - предел обнаружения.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко