Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 56058-2014 "Корма и кормовые добавки. Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения" (утв. и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 705-ст)

Feed and feed additives. Methods of identification and determination GMO of plant origin

ОКС 65.120

Дата введения - 1 июля 2015 г.
Введен впервые

Предисловие

1 Разработан Федеральным государственным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 "Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов"

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. N 705-ст

4 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетически-модифицированной сои (далее - ГМ сои) и генетически-модифицированной кукурузы (далее - ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 31719-2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

ГОСТ Р ИСО 6497-2011 Корма для животных. Отбор проб

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 51848-2001 Продукция комбикормовая. Термины и определения

ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически-модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины, определения и сокращения по ГОСТ Р ИСО 6497, ГОСТ Р 51848, ГОСТ Р 55576 и ГОСТ 31719.

4 Условия выполнения испытаний и требования безопасности

Условия выполнения испытаний и требования безопасности - по ГОСТ Р 55576 (раздел 4, приложение А).

5 Оборудование, материалы и реагенты

5.1 Требования к оборудованию - по ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025.

5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719, а также следующие:

- бокс ламинарный II класса биологической безопасности;

- отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;

- микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1,5 см ³;

- микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см ³;

- ПЦР-бокс;

- прибор для проведения ПЦР ^*;

------------------------------

^*_{Прибор для проведения ПЦР "Rotor-Gene" 2000/3000/6000 ("Corbett Research", Австралия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.}

------------------------------

- халаты медицинские.

Допускается использование другого оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3 При проведения испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК по ГОСТ Р 55576, а также следующие реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации.

5.3.1 Реагенты:

- вода деионизованная;

- ПЦР-буфер;

- раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) 10 ^х (10-кратная смесь четырех компонентов с концентрацией каждого компонента 1,76 х 10 ^-3 моль/дм ³);

- Taq-полимераза термостабильная;

- образцы стандартные состава ГМ сои и ГМ кукурузы, содержащие от 0,1 % до 5,0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы ^*.

------------------------------

^*_{Стандартные образцы состава ГМ сои и ГМ кукурузы "Сигма Алдрич", ССМ от JRC, IRMM. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.}

------------------------------

Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3.2 Праймеры (смесь олигонуклеотидов) и зонды (меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G):

5.3.2.1 Для определения ГМ сои линии 40-3-2:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GCC ATG TTG ТТА ATT TGT GCC AT 3';

2) праймер 2: 5'-GAA GTT CAT ТТС ATT TGG AGA GGA С 3';

3) зонд: 5'-FAM-CTT GAA AGA ТСТ GCT AGA GTC AGС TTG ТСА GCG - BHQ1-3';

б) специфичные гену лектина (lec1):

1) праймер 1: 5'-ТСС АСС ССС АТС САС ATT Т-3';

2) праймер 2: 5'-GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3';

3) зонд: 5'-R6G-AAC CGG TAG CGT TGC CAG СТТ CG-BHQ1-3';

5.3.2.2 Для определения ГМ сои линии А2704-12:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GCA AAA AAG CGG ТТА GCT ССТ-3';

2) праймер 2: 5'-ATT CAG GCT GCG САА CTG ТТ-3';

3) зонд: 5'-FAM-CGG ТСС ТСС GAT CGC ССТ TCC-BHQ1-3';

б) специфичные гену лектина (lec2):

1) праймер 1: 5'-САС СТТ ТСТ CGC АСС ААТ TGA СА-3';

2) праймер 2: 5'-ТСА ААС ТСА АСА GCG ACG АС-3';

3) зонд: 5'-R6G-ССА САА АСА CAT GCA GGT TAT СТТ GG-BHQ1-3'.

5.3.2.3 Для определения ГМ сои линии А5547-127:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GCT ATT TGG TGG CAT ТТТ ТСС А 3';

2) праймер 2: 5'-САС TGC GGC САА СТТ ACT ТСТ 3';

3) зонд: 5'-FAM-CC GCA ATG ТСА ТАС CGT CAT CGT TGT-BHQ1-3';

б) специфичные гену лектина (lec3):

1) праймер 1: 5'-ССТ ТСТ CGC АСС ААТ TGA СА-3';

2) праймер 2: 5'-ТСА ААС ТСА АСА GCG ACG АС-3';

3) зонд: 5'-R6G-CC АСА ААС АСА TGC AGG TTA TCT TGG-BHQ1-3';

5.3.2.4 Для определения ГМ кукурузы линии MON 810:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT-3';

2) праймер 2: 5'-GCC АСС TTC CTT TTC САС TAT CTT-3';

3) зонд: 5'-FAM-AAC АТС CTT TGC CAT TGC CCA GC-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (hmg):

1) праймер 1: 5'-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3';

2) праймер 2: 5'-GCT АСА TAG GGA GCC TTG TCC T-3';

3) зонд: 5'-R6G-CAA TCC АСА CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1-3';

5.3.2.5 Для определения ГМ кукурузы линии NK 603:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA-3';

2) праймер 2: 5'-AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T-3';

3) зонд: 5'-FAM-TGG TAC CAC GCG АСА CAC TTC CAC TC-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 1):

1) праймер 1: 5''-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3';

2) праймер 2: 5'-CCT TCT TGG CGG CTT АТС TG-3';

3) зонд: 5'-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-BHQ1-3';

5.3.2.6 Для определения ГМ кукурузы линии Bt 11:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GCG GAA ССС СТА ТТТ GTT ТА-3';

2) праймер 2: 5'-ТСС AAG ААТ ССС ТСС ATG AG-3';

3) зонд: 5'-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT АТС CGC TCA-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 2):

1) праймер 1: 5'-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3';

2) праймер 2: 5'-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3';

3) зонд: 5'-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3';

5.3.2.7 Для определения ГМ кукурузы линии T 25:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-АСА AGС GTG TCG TGC ТСС АС-3';

2) праймер 2: 5'-GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG-3';

3) зонд: 5'-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 3):

1) праймер 1: 5'-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT-3';

2) праймер 2: 5'-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3';

3) зонд: 5'-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1-3';

5.3.2.8 Для определения ГМ кукурузы линии GA 21:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-СТТ АТС GTT ATG СТА TTT GCA ACT TTA GA-3';

2) праймер 2: 5'-TGG CTC GCG АТС CTC CT-3';

3) зонд: 5'-FAM-CAT ATA СТА ACT CAT АТС TCT TTC TCA АСА GCA CCT GGG-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 4):

1) праймер 1: 5'-CCA GCC TCA TGG CCA AAG-3';

2) праймер 2: 5'-CCT TCC TTG GCG GCT TAT CTG-3';

3) зонд: 5'-R6G-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC СТ-ВНQ1-3';

5.3.2.9 Для определения ГМ кукурузы линии MIR 604:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GCG CAC GCA ATT CAA CAG-3';

2) праймер 2: 5'-GGT CAT ААС GTC ACT ССС TTA ATT CT-3';

3) зонд: 5'-FAM-AGG CGG GAA ACG АСА АТС TGA TCA TG-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 5):

1) праймер 1: 5'-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3';

2) праймер 2: 5'-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3';

3) зонд: 5'-R6G-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC ТСА-ВНQ1-3';

5.3.2.10 Для определения ГМ кукурузы линии MON 863:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5'-GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA С-3';

2) праймер 2: 5'-TGT TAC GGC СТА AAT GCT GAA CT-3';

3) зонд: 5'-FAM-TGA АСА ССС АТС CGA АСА AGT AGG GTC A-BHQ1-3';

б) специфичные гену зеина (adhl 6):

1) праймер 1: 5'-ССА GCC ТСА TGG CCA AAG-3';

2) праймер 2: 5'-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3';

3) зонд: 5'-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3'.

6 Сущность метода

6.1 Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка эндогенной ДНК, характерной для всех линий ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка рекомбинантной ДНК, специфичной для определенных генетических линий.

6.2 Возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ Р 53244.

7 Отбор проб

Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспортирования - по ГОСТ Р 55576.

8 Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК проводят в соответствии с ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.

9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси

Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы берут 1 мм ³ деионизованной воды, по 1 мм ³ каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 5 х 10 ^-6 моль/дм ³, по 1 мм ³ каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 5 х 10 ^-6 моль/дм ³, по 1 мм ³ каждого зонда по 5.3.2 концентрацией 3 х 10 ^-6 моль/дм ³, 3 мм ³ раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешивают в пробирке вместимостью 1,5 см ³.

Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 °С - не более 12 мес.

9.2 Постановка ПЦР

9.2.1 ДНК, экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее, чем в двух повторностях.

9.2.2 Для проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм ³ ПЦР-смеси по 9.1, 5 мм ³ ПЦР-буфера и 0,5 мм ³ полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 15-30 с.

9.2.3 В микропробирку вместимостью 0,2 см ³ вносят по 15 мм ³ смеси, полученной по 9.2.2, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм ³ ДНК, полученной экстракцией из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции - 25 мм ³.

9.2.4 Ставят контрольные реакции амплификации:

- отрицательный контрольный образец (К-) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм ³ ТЕ-буфера;

- положительный контрольный образец (К+) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм ³ 1 %-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.

9.2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными образцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микропробирки со смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм ³ каждого стандартного образца, содержащего от 0,1 % до 5,0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.

Примечание - Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диапазона.

9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала

Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.

Таблица 1

Стадия амплификации	Программа
Денатурация первичная	95 °С/5 мин
45 циклов	95 °С/15 с
	60 °С/30 с
	72 °С/30 с

Детекцию проводят при температуре 60 °С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.

Программа амплификации для количественного определения ГМ кукурузы приведена в таблице 2.

Таблица 2

Стадия амплификации	Программа
Денатурация первичная	95 °С/15 мин
10 циклов	95 °С/15 с
	60 °С/20 с
	72 °С/15 с
35 циклов	95 °С/15 с
	55 °С/20 с
	72 °С/15 с

Детекцию проводят при температуре 55 °С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.

Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции для генетической линии, по каналу JOE - для эндогенной ДНК ГМ сои или ГМ кукурузы. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR).

Границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1 % до 5,0 %, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием стандартных образцов.

Стандартное отклонение повторяемости результатов составляет от 0,067 (для 0,1 %) до 0,54 (для 5 %).

Коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по стандартным образцам ГМО, (R ²) > 0,97. Если коэффициент корреляции R ² менее 0,97 - требуется повторный анализ всех проб, начиная с этапа амплификации.

9.4 Учет результатов

Учет результатов и расчет содержания ГМ сои или ГМ кукурузы проводят по ГОСТ Р 53244.

9.5 Возможные ошибки

Возможные ошибки - по ГОСТ Р 55576 (подраздел 10.3).