Методические указания по определению остаточных количеств пирипроксифена в зелёной массе, огурцах и томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МУК 4.1.1836-04 (утв. Главным Государственным санитарным врачом РФ 13 февраля 2004 г.)

Дата введения: с 1 мая 2004 г.

1. Вводная часть

Фирма-регистрант: Агропрогресс.

Торговое наименование: Адмирал.

Действующее вещество: пирипроксифен.

Структурная формула:

4-феноксифенил (RS)-2-(2-пиридилокси)пропиловый эфир (IUРАС).

2-[1-метил-2-(4-феноксифенокси)этокси]пиридин (С.А.).

Брутто-формула: .

Мол. масса: 321,5.

Бесцветные кристаллы (технический - бледно-жёлтое воскообразное вещество со слабым запахом).

Температура плавления: 47С.

Давление паров при 23°С менее 0,013 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: (25°С).

Растворимость (г/кг): гексан - 400, метанол - 200, ксилол - 500 (20-25°С). Растворимость в воде - 0,367 мг/л (при 25°С).

Вещество устойчиво к гидролизу: период полураспада более 367 дней (20°С, рН 4-9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс >5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс >2000 мг/кг, не раздражает кожу и слизистую глаз (кролики).

Класс токсичности по ВОЗ - III.

Гигиенические нормативы для пирипроксифена в России не установлены.

Область применения препарата. Пирипроксифен - инсектицид контактного и кишечного действия из группы аналогов ювенильного гормона, подавляющий эмбриогенез и процесс метаморфоза насекомых. Активно подавляет развитие мух, жуков, комаров и других насекомых.

2. Методика определения пирипроксифена в зелёной массе, огурцах и томатах методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении пирипроксифена методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с флорисилом.

2.1.2. Метрологически характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Объект анализа	Предел обнаружения мг/кг	Диапазон определяемых концентраций мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0.95
Зелёная масса	0.02	0.02-0.2	87,9	8,61	7,55
Огурцы	0.01	0.01-0.1	90,3	7,84	6,87
Томата	0.01	0.01-0.1	91,0	8,11	7,10

Таблица 2

Полнота определения пирипроксифена в зелёной массе, огурцах и томатах (n = N + 1 = 6 для каждой концентрации)

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение,	Полнота определения, %
1	2	3	4	6
Зелёная масса	0,02	0,01734		86,7
	0,04	0,03564		89,1
	0,1	0,0885		88,5
	0,2	0,1746		87,3
Среднее				87,9
Огурцы	0,01	0,00893		89,3
	0,02	0,01794		89,7
	0,05	0,04545		90,9
	0,1	0,0912		91,2
Среднее				90,3
Томаты	0,01	0,00935		93,5
	0,02	0,01794		89,7
	0,05	0,0444		88,8
	0,1	0,0919		91,9
Среднее				91,0

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМН" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Пирипроксифен, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (75:25, по объему).

Стекловата.

Флорисил 150-250 (Merck, Германия).

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: гексан - хлористый метилен (70:30, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: гексан - хлористый метилен (60:40, по объему).

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry - C18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ100 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 29/32 и КШ10 14/19 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные B-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 , ГОСТ 1774-74.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду ГОСТ 1770-74

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25x1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°C. Перед проведением анализа пробы огурцов и томатов гомогенизируют в гомогенизаторе.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил, х.ч. сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 750 мл ацетонитрила с 250 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл н-гексана и 300 мл хлористого метилена. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 600 мл н-гексана и 400 мл хлористого метилена.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску пирипроксифена (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (Стандартный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 и 2.0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - бидистиллированная вода (75:25, по объему).

Растворы пирипроксифена для внесения в образец при определении полноты извлечения готовят растворением навески пирипроксифена (5 мг) в 100 мл гексана (раствор с концентрацией 50 мкг/мл) с последующим разбавлением полученного раствора гексаном в 50 и 100 раз (растворы внесения с концентрациями 1.0 и 0.5 мкг/мл), используя мерные колбы ёмкостью 50 и 100 мл.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градировочные растворы и растворы внесения - в течение суток.

2.5.5. Построение градировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пирипроксифена в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пирипроксифена в градировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл элюента N 1. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя флорисила на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10-15 мм. Колонку промывают 40 мл элюента N 2, затем 40 мл элюента N 1 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения пирипроксифена на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 1 мл раствора внесения пирипроксифена с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 100 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание пирипроксифена по п. 2.6.4.

Фракции, содержащие пирипроксифен, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание пирипроксифена в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания пирипроксифена может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Экстракция пирипроксифена из проб зелёной массы, огурцов и томатов

Гомогенизированные пробы зелёной массы, массой 10 г, огурцов и томатов, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-го водного ацетона (для зелёной массы) или 75%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют ещё дважды с 50 мл водно-ацетоновой смеси Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (50-75 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Очистку экстрактов проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2. Очистка экстрактов

Объем водного остатка доводят до 100 мл, фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента", переносят в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют трижды гексаном порциями по 40 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 минут и собирая после расслаивания верхний гексановый слой*. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. Полученный раствор выпаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40°С досуха. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.3. Очистка на колонке с флорисилом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1. и 2.6.2. экстрактов растительного материала, растворяют в 5 мл элюента N 1 и количественно переносят в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6.). Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Пирипроксифен элюируют 80 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка Symmetry-C18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки .

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20x3.9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 75:25 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 272 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания пирипроксифена мин.

Линейный диапазон детектирования 0.1-2.00 мкг/мл.

ГАРАНТ:

Нумерация подразделов приводится в соответствии с источником

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание пирипроксифена в образце воды, почвы или растительных материалов (X, мг кг) вычисляют по формуле:

где - площадь пика пирипроксифена в стандартном растворе, ед. адс. х с;

- площадь пика пирипроксифена в анализируемой пробе, ед. адс. х с;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);

С - концентрация стандартного раствора пирипроксифена, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств пирипроксифена в анализируемом образце вычисляют, как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пирипроксифена 2 мкг/мл разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

Юзихин О.С., Короткова Н.В., Цибульская И.А., Долженко В.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

______________________________

* В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции гексаном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

Главный Государственный санитарный врач РФ Первый зам. Министра здравоохранения РФ

Г.Г. Онищенко