Приложение А (справочное). Формулы для оценки цитотоксичности

Приложение А
(справочное)

Формулы для оценки цитотоксичности

А.1 При использовании cytoB

А.1.1 При использовании cytoB оценка цитотоксичности основана на индексе пролиферации при цитокинетическом блоке (CBPI) и индексе репликации (RI) ¹⁾. СВРI показывает среднее число ядер на клетку и может использоваться для вычисления клеточной пролиферации. RI показывает относительное число клеточных циклов на клетку в течение периода воздействия cytoB в обработанных культурах по сравнению с контрольными культурами и может использоваться для вычисления процента цитостатичности по формулам:

------------------------------

¹⁾_{См. [17], [69].}

------------------------------

,

(А.1)

где ;

Т - культура, обработанная исследуемым химическим веществом;

С - контрольная культура.

Таким образом, значение СВРI = 1 (все клетки с одним ядром) соответствует 100 %-ной цитостатичности.

,

(А.2)

где ;

Т - обработанные культуры;

С - контрольные культуры.

А.1.2 Таким образом, значение RI, равное 53 %, означает, что по сравнению с количеством клеток, которые разделились с образованием двуядерных и многоядерных клеток в контрольной культуре, только 53 % клеток от этого числа разделились в обработанной культуре, то есть цитостатичность составляет 47 %.

А.2 При отсутствии cytoB

А.2.1 Если cytoB не используют, оценку цитотоксичности рекомендуется проводить на основе относительного увеличения числа клеток (RICC) или относительного удвоения популяции (RPD) ²⁾, поскольку оба показателя учитывают долю популяции клеток, которые разделились. RICC и RPD вычисляют по формулам:

------------------------------

²⁾_{См. [69].}

------------------------------

;

(А.3)

,

(А.4)

где удвоение популяции равно [log (число клеток после обработки/начальное число клеток)]/log 2.

А.2.2 Таким образом, значения RICC или RPD, равные 53 %, указывают на значения цитотоксичности/цитостатичности, равные 47 %.

А.2.3 С использованием индекса пролиферации (РI) цитотоксичность может быть определена путем подсчета числа клонов, состоящих из одной клетки (cl1), двух клеток (cl2), от трех до четырех клеток (cl4) и от пяти до восьми клеток (cl8) по формуле

.

(А.5)

А.2.4 PI используют так же, как объективный и надежный параметр цитотоксичности для клеточных линий, культивируемых in vitro в отсутствие cytoB ³⁾, который может рассматриваться как полезный дополнительный параметр.

------------------------------

³⁾_{См. [5], [36]-[38].}

------------------------------

В любом случае количество клеток должно быть одинаковым для обрабатываемых культур и отрицательного контроля.

Больше не рекомендуется использовать в качестве параметра цитотоксичности использовавшийся ранее RCC (т.е. количество клеток в обработанных культурах/количество клеток в контрольных культурах), поскольку данный параметр может занижать оценку цитотоксичности.

При использовании автоматизированных систем подсчета, например проточной цитометрии, лазерной сканирующей цитометрии или анализа изображений, количество клеток в формуле (А.5) может быть заменено количеством ядер.

В культурах отрицательного контроля индекс удвоения популяции или индекс репликации должны быть совместимыми с требованием отбора образцов клеток после обработки во время, эквивалентное примерно 1,5-2 нормальным клеточным циклам.