Методические указания МУК 4.2.3695-21* 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы микробиологического контроля почвы (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 2 июня 2021 г.)

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методы и порядок проведения микробиологического контроля почвы (почва, песок, грунт, донные (придонные), иловые отложения, сапропели) жилых территорий, территорий образовательных, медицинских, оздоровительных организаций, курортных и рекреационных (скверы, парки, бульвары, пляжи, в том числе галечные, лесопарки) зон, игровых площадок и дворов, зон санитарной охраны водных объектов, территорий сельскохозяйственного назначения (поля, сады, огороды, приусадебные участки, тепличные хозяйства), промышленных зон, транспортных магистралей и других территорий, где возможно влияние загрязненных почв (песка) на здоровье и условия проживания населения, по показателям эпидемической безопасности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы органами и организациями (предприятиями), в том числе хозяйствующими субъектами и индивидуальными предпринимателями, осуществляющими исследования почвы по микробиологическим показателям.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Отбор, хранение и транспортировка проб

2.1. Отбор, хранение и транспортировка проб производятся в соответствии с методическими документами ².

III. Подготовка и обработка проб

3.1. Отобранные с соблюдением правил асептики пробы почвы с одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают примеси (прочие твердые предметы, неперегнившую растительную массу). Если проба однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке.

Затем пробу распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Данный квадрат почвы делят 2 диагоналями на 4 треугольника. Почву из 2 противоположных треугольников удаляют.

Оставшуюся часть почвы перемешивают, распределяют тонким слоем и повторяют процедуру деления и удаления до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг пробы.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемых определений. Почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке.

Для приготовления первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут навеску в зависимости от выбранных методов исследований. Первое разведение навески почвы (1 : 10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду (1 г пробы - в 9,0 воды или 10 г пробы - в 90,0 воды и т. д.).

Перед приготовлением дальнейших разведений применяется предварительная обработка почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель предварительной обработки почвы заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

3.2. Основными приемами предварительной обработки почвы является вертикальное перемешивание (механическое или ручное) почвенной суспензии первого разведения: 10 минут при навеске почвы 1 г; 3 минуты при навеске почвы более 1 г.

Почвенную суспензию, содержащую в 1 0,1 г почвы, используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 отбирают стерильной пипеткой 1,0 почвенной суспензии и переносят в пробирку с 9,0 стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 (разведение ) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,001 (разведение ) и далее. Для приготовления каждого разведения используют стерильные пипетки или насадки к дозатору.

Допускается выбирать необходимое количество разведений в зависимости от предполагаемого загрязнения пробы, но не менее двух.

3.3. Ориентировочный список оборудования, расходных материалов, реактивов представлен в приложении 1 к настоящим МУК.

3.4. При выполнении микробиологического исследования следует отдавать предпочтение стандартизованным сухим питательным средам промышленного производства. При использовании промышленных сухих питательных сред следует соблюдать способ приготовления, применения и сроки хранения, указанные изготовителем.

Проверка ростовых качеств питательных сред, в том числе хромогенных, с применением тест-штаммов соответствующих микроорганизмов проводится в рамках внутрилабораторного контроля.

3.5. Для выявления и идентификации микроорганизмов возможно применение альтернативных методов исследований и автоматических микробиологических анализаторов в соответствии с методическими документами и инструкциями производителей.

3.6. Лабораториям рекомендовано иметь запас питательных сред для проведения исследований и производственного контроля.

3.7. Хранение и контроль питательных сред, дистиллированной воды, растворов, реактивов проводят в соответствии с методическими документами ³ или инструкциями производителя.

IV. Определение ОКБ

4.1. Определение общих (обобщенных) колиформных бактерий, в том числе Escherichia coli, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), лактозоположительных кишечных палочек (колиформы) (далее - ОКБ) титрационным методом.

Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой (дозатором) берут 10,0 и засевают в 90,0 лактозо-пептонной среды (далее - ЛПС) или среды Кесслера или в среду Эйкмана с лактозой, что соответствует посеву 1 г почвы.

По 1,0 нативной почвенной суспензии и последующих ее разведений (0,1 г, 0,01 г, 0,001 г, то есть разведения и т. д.), подготовленных по п. 3.2, вносят в пробирки с 9,0 питательной среды (ЛПС, среда Кесслера или среда Эйкмана с лактозой).

Посевы инкубируют до 48 ч при °С с предварительным просмотром посевов через 16-18 ч инкубации.

При наличии в посевах признаков роста (помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение) производят высев петлей на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки с посевами инкубируют при температуре °С в течение 16-18 ч. Посев из накопительных питательных сред можно производить на хромогенные питательные среды.

При обнаружении грамотрицательных и оксидазоотрицательных колоний идентификация проводится путем подтверждения ферментации лактозы. По 2-3 колонии каждого типа засевают параллельно в две пробирки с питательной средой, разлитой в количестве 4,0-5,0 (например, полужидкая лактоза, среда Гисса с лактозой или аналогичные среды): одну пробирку инкубируют при температуре °С, вторую - при температуре °С. Учет производят через 16-18 ч инкубации.

Образование кислоты и газа при температуре °С свидетельствует о наличии ОКБ. Наличие Е. coli подтверждают образованием кислоты и газа при температуре °С.

Для подтверждения наличия в пробе Е. coli можно использовать лактозный бульон с борной кислотой (подтверждение роста и образование газа) или среду, содержащую триптофан (выявление способности бактерий продуцировать индол). Продукция индола определяется реактивом Ковача или индикаторной полоской.

Учет результатов проводят по приложению 2 к настоящим МУК.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 грамме почвы.

Результат по показателю ОКБ, в т. ч. Е. coli отрицательный (не обнаружено), если:

- в среде накопления нет признаков роста через 48 ч инкубации;

- на плотной питательной среде нет роста или отмечается рост нехарактерных для колиформных бактерий колоний;

- все колонии оксидазоположительные;

- отсутствует образование кислоты и газа при идентификации.

В случае наличия кислоты и газа при °С и отсутствии положительной реакции при °С, результат исследования представляют числовым выражением количества ОКБ (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г). При наличии кислоты и газа при °С и положительной реакции при °С, результат исследования выражают суммарным числовым выражением количества ОКБ, в том числе Е. coli (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

4.2. Определение ОКБ методом мембранной фильтрации.

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации. Метод основан на фильтрации почвенной суспензии через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде (например, Эндо, среда ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Мембранные фильтры готовятся к анализу в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для подготовки фильтровального аппарата воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут стерильным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум. При посеве нескольких разведений одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала объемы меньших разведений, а затем больших, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Фильтрации подлежат нативная почвенная суспензия и ее разведения, подготовленные по п. 3.2, в объеме не менее 10 (1 почвенной суспензии вносят в 10 стерильной водопроводной воды).

После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край стерильным пинцетом и переносят фильтр, не переворачивая, на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки, хромогенные), избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром и исключая соприкосновение фильтров между собой. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре °С в течение 16-18 ч.

Подсчет колоний проводят на фильтре. Для повышения точности анализа учет ведут на фильтрах с числом типичных для колиформных бактерий колоний: не более 30 для фильтров с диаметром диска 35 мм и не более 50 для фильтров с диаметром диска 47 мм.

При наличии на фильтре грамотрицательных и оксидазоотрицательных культур идентификация проводится в соответствии с п. 4.1.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

При использовании метода мембранной фильтрации индекс (КОЕ/г, кл/г) рассчитывают путем умножения суммы колоний ОКБ, выросших на фильтре, на 10 ⁿ (n - степень соответствующего десятикратного разведения).

Результат по показателю ОКБ, в т. ч. Е. coli отрицательный (не обнаружено), если:

- на фильтре нет роста или отмечается рост нехарактерных для колиформных бактерий колоний;

- все колонии оксидазоположительные;

- отсутствует образование кислоты и газа при идентификации.

В случае наличия при идентификации кислоты и газа при °С и отсутствии положительной реакции при °С результат исследования представляют числовым выражением количества ОКБ (КОЕ или кл) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

При наличии кислоты и газа при °С и положительной реакции при °С результат исследования представляют суммарным числовым выражением количества ОКБ, в том числе Е. coli (КОЕ или кл) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

4.3. Определение ОКБ методом прямого посева на агаризованные питательные среды.

При проведении прямого поверхностного посева нативной почвенной суспензии или ее разведений 0,1 см засевают на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки, хромогенные) и равномерно распределяют по поверхности стерильным шпателем. Посевы инкубируют при °С в течение 16-18 ч.

Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов по п. 4.1.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

При использовании метода прямого посева на агаризованные питательные среды индекс (КОЕ/г, кл/г) рассчитывают путем последовательного умножения количества ОКБ, выросших на чашке, на 10 и на степень десятикратного разведения.

Результат по показателю ОКБ, в т. ч. Е. coli отрицательный (не обнаружено), если:

- на чашках нет роста или отмечается рост нехарактерных для колиформных бактерий колоний;

- все колонии оксидазоположительные;

- отсутствует образование кислоты и газа при идентификации.

В случае наличия при идентификации кислоты и газа при °С и отсутствии положительной реакции при °С, результат исследования представляют числовым выражением количества ОКБ (КОЕ или кл) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

При наличии кислоты и газа при °С и положительной реакции при °С результат исследования представляют суммарным числовым выражением количества ОКБ, в том числе Е. coli (КОЕ или кл) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

V. Определение энтерококков (фекальных)

5.1. Определение энтерококков (фекальных) титрационным методом.

К группе энтерококков относят Enterococcus faecalis (биовары zymogenes и liquefaciens), Enterococcus faecium, Enterococcus durans.

Энтерококки - индикаторный показатель, определяющий степень эпидемической опасности различных типов и категорий почв.

Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой (дозатором) берут 10,0 и засевают во флаконы с 90,0 см (лактозо-пептонная среда, щелочно-полимиксиновая среда или иные аналогичные среды), что соответствует посеву 1 г почвы.

По 1,0 нативной почвенной суспензии и последующих ее разведений (0,1 г, 0,01 г, 0,001 г, то есть разведения и т. д.), подготовленных по п. 3.2, вносят в пробирки с 9,0 накопительной питательной среды (лактозо-пептонная среда, щелочно-полимиксиновая среда или иные аналогичные среды).

Посевы инкубируют при температуре °С в течение ч. Из среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных питательных сред (молочно-ингибиторная среда, селективный агар по Сланецу и Бертли, питательная среда для выделения энтерококков (энтерококкагар) или иные аналогичные среды).

Если через ч признаки роста отсутствуют, посевы оставляют еще на сутки. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

Через 24-48 ч инкубации посевов на молочно-ингибиторной среде при температуре °С в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных выпуклых с металлическим блеском или сероватых мелких колоний. Эта среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: Е. faecalis образует аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском, Е. faecalis биовар liguefaciens - такие же колонии, окруженные зоной просветления, Е. faecium биовар durans - серые мелкие плоские колонии.

На селективном агаре по Сланецу и Бертли, энтерококкагаре подсчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые с ровными краями темно-малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром, коричневые.

Для подтверждения наличия энтерококков проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков и постановку каталазного теста.

Для постановки каталазного теста петлей наносят на предметное стекло каплю дистиллированной воды, в которой растирают исследуемую культуру. После подсушивания на воздухе добавляют каплю свежеприготовленной 3%-й перекиси водорода. При отсутствии пузырьков, газа тест считается каталазоотрицательным. В качестве контрольной каталазоположительной культуры используют любой вид стафилококков.

Для дифференциации можно также использовать солевой агар с ТТХ: после 24-48 ч инкубации при температуре °С энтерококки дают равномерный нежный рост на протяжении всего штриха; иные бактерии на этой среде не растут.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

Учет результатов проводится по приложению 2 к настоящим МУК.

В случае роста грамположительных, каталазоотрицательных кокков, результат исследования представляют числовым выражением количества энтерококков (КОЕ или кл) в 1,0 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

5.2. Определение энтерококков (фекальных) упрощенным методом.

При анализе почвы титрационным методом лактозопептонная среда может быть использована одновременно для накопления ОКБ и энтерококков.

Из всех емкостей лактозопептонной среды, где имелось помутнение, независимо от наличия или отсутствия газа, делают высев со дна пробирки секторами на одну из сред по п. 5.1 путем троекратного нанесения материала бактериологической петлей диаметром 2-3 мм для посева штрихом. Посев штрихом делают с таким расчетом, чтобы к концу штриха получить изолированные колонии, посевы инкубируют ч при температуре °С.

Учет результатов производят по п. 5.1.

5.3. Определение энтерококков (фекальных) методом мембранной фильтрации.

Подготовку фильтровальной установки и мембранных фильтров, фильтрование почвенной суспензии и дальнейший посев проводят по п. 4.2. Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2 фильтрах выросли изолированные колонии в количестве до 50. Фильтры, не переворачивая, переносят на поверхность плотных питательных сред (молочно-ингибиторная среда, селективный агар по Сланецу и Бертли, питательная среда для выделения энтерококков (энтерококкагар) или иные аналогичные среды).

Чашки с посевами инкубируют при температуре °С в течение 24-48 ч. Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом) плоские разных оттенков колонии не учитывают.

Учет характерных колоний и дальнейшую идентификацию энтерококков проводят по п. 5.1.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

При использовании метода мембранной фильтрации индекс (КОЕ/г, кл/г) рассчитывают путем умножения количества энтерококков, выросших на фильтре, на (n - степень соответствующего десятикратного разведения).

5.4. Определение энтерококков (фекальных) методом прямого посева на агаризованные питательные среды.

При проведении прямого поверхностного посева нативной почвенной суспензии или ее разведений 0,1 см засевают на поверхность плотных питательных сред по п. 5.1 и равномерно распределяют по поверхности стерильным шпателем. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до . Посевы инкубируют при °С в течение ч.

Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов по п. 5.1.

При использовании метода прямого посева на агаризованные питательные среды индекс (КОЕ/г, кл/г) рассчитывают путем умножения количества энтерококков, выросших на чашке, на 10 и на степень десятикратного разведения.

VI. Определение патогенных бактерий, в т. ч. сальмонелл

6.1. Определение патогенных бактерий методом прямого посева на агаризованные питательные среды.

Из первого разведения испытуемого образца (1 : 10) (соответствует 0,1 г почвы), прошедшего предварительную подготовку, стерильной пипеткой берут 0,1 и засевают на висмут-сульфитный агар и одну из агаризованных питательных сред для выявления патогенных энтеробактерий (например, ксилозализин дезоксихолатный (XLD) агар, SS-arap, среда Плоскирева, среду Левина или иные аналогичные среды). Можно использовать хромогенные питательные среды.

Чашки с посевами инкубируют при температуре °С в течение 18-24 ч, а в случае отсутствия роста чашки с висмут-сульфит агаром оставляют до ч в термостате.

Отсутствие роста на средах свидетельствует, что патогенные бактерий в анализируемой пробе не обнаружены.

При наличии хотя бы на одной среде роста типичных для патогенных бактерий колоний, а также при наличии на среде Эндо при исследовании на ОКБ характерных для патогенных бактерий колоний (например, лактозонегативные) проводят их подсчет и пересев (с каждой чашки снимают 3-5 подозрительных колоний) на одну из дифференциально-диагностических сред для биохимической идентификации (согласно приложению 3 к настоящим МУК) и на скошенный питательный агар.

Дальнейшую идентификацию биохимических и серологических свойств патогенных микроорганизмов проводят в соответствии с действующими методическими документами. Допускается применение тест-систем, экспресс-тестов, микробиологических анализаторов и идентификаторов в соответствии с методическими документами ⁴ и инструкциями производителя.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

Расчет индекса (КОЕ/г, кл/г) проводят для каждого выявленного патогенного микроорганизма отдельно путем умножения количества колоний, выросших на чашке, на 10 и на степень десятикратного разведения.

Результат исследования выражают суммарным индексом патогенных бактерий, в т. ч. Сальмонелл, (КОЕ или кл) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

6.2. Определение патогенных бактерий методом обогащения.

По эпидемическим показаниям дополнительно проводят определение патогенных бактерий методом обогащения. Из первого разведения испытуемого образца почвы, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой (дозатором) берут 10,0 почвенной суспензии и засевают во флаконы с 90,0 сред селективного обогащения. Для сальмонелл используют не менее двух сред накопления: среду Мюллера-Кауфмана, магниевую среду, тетратионатовый бульон, среду Раппопорт-Вассилиадис; для шигелл - селенитовую среду и среду с охмеленным суслом; для патогенных сероваров кишечной падочки используется среда селективного обогащения бульон Хоттингера, лактозо-пептонная среда или среда Кесслер.

Посевы инкубируют при °С в течение 18-24 ч. Из каждой емкости, где отмечено равномерное помутнение среды, производят высев на две агаризованные питательные среды, далее по п. 6.1.

При обнаружении патогенных бактерий в результате микробиологического исследования указывают: "Патогенные бактерии обнаружены в 1 г почвы".

Дополнительно рекомендуется указывать наименование микроорганизма.

VII. Показатели биологической активности почвы

7.1. Определение общей численности почвенных микроорганизмов (далее - ОМЧ).

Основными интегральными показателями биологической активности являются: ОМЧ, определение С. perfringens актиномицетов, аммонификаторов, нитрификатов и др.

Для более полного учета общей численности сапрофитных микроорганизмов диспергирование и десорбцию клеток с поверхности почвенных частиц рекомендуется проводить следующим способом. Навеску почвы, используемую для приготовления первого разведения, доводят путем добавления небольшого количества стерильной водопроводной воды до пастообразного состояния, растирают в течение 5 минут. Затем готовят первое разведение 1 : 10, т. е. 10-1 почвы на стерильной водопроводной воде, и почвенная суспензия охлаждается при температуре (5-7)°С в течение 20-30 мин, затем производят раститровку суспензии обычным способом. Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 на поверхность питательного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают по всей поверхности чашки. Термостатирование засеянных чашек ведут при (28-30)°С в течение 72 ч. Учет результата: количество колоний на обеих чашках суммируют, делят на два и умножают на степень разведения. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ в 1 г почвы).

Метод глубинного посева. По 1 исследуемого материала из разведений параллельно вносят в две чашки Петри для каждого разведения, слегка приоткрыв крышку чашки Петри и внеся посевной материал на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения материала его заливают 15-20 предварительно расплавленной и охлажденной до температуры °С агаризованной почвенной среды. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают для равномерного распределения посевного материала по питательной среде и оставляют на горизонтальной поверхности до её полного застывания.

После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (28-30)°С в течение 72 ч.

Учет результата: количество колоний на обеих чашках суммируют, делят на два и умножают на степень разведения. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ в 1 г почвы)

7.2. Определение С. perfringens.

Сульфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре °С в течение (16-18) ч.

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

7.2.1. Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера и иные железосульфитные среды. Из приготовленных почвенных разведений (до 1 : ) по 1,0 переносится в два параллельных ряда пробирок. Затем во все пробирки наливают по 9-10 горячего железосульфитного агара, приготовленного ex tempore и прогретого до (70-80)°С (среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков). Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при °С в течение 16-18 ч. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ: С. perfringens обнаружены в 1 г почвы.

7.2.2. Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом пробирки с железосульфитным агаром расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70-80)°С в водяной бане.

После фильтрования 100 почвенного разведения 1 : 10 мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при °С в течение (16-18) ч.

7.2.3. Определение методом фильтрования в чашках Петри.

Чашки Петри заливают тонким слоем железосульфитного агара 4,0-5,0 . После фильтрации фильтр помещают фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при °С в течение (16-18) ч.

Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом КОЕ сульфитредуцирующих клостридий в 1 г почвы. При отсутствии роста на всех фильтрах дают отрицательный ответ.

7.3. Определение количества актиномицетов и грибов.

Актиномицеты (греч. actis - луч, mucos - гриб) - одноклеточные микроорганизмы, тело которых состоит из нетитрованного мицелия, имеющего вид ветвящихся тонких нитей. У актиномицетов, как и у бактерий, генетическую функцию выполняет нуклеоид. В нитях мицелия находятся зерна хроматина. Размножаются актиномицеты при помощи специальных органов плодоношения путем прорастания спор, прикрепленных на спороносцах, простым делением, перешнурованием и почкованием.

Актиномицеты - факультативные анаэробы, хорошо развиваются при температуре (25-30)°С (оптимальная температура 35-37°С) на плотных средах. Одни виды растут с образованием плотных гладких колоний, другие имеют складчатые, бугристые, корковидные, бархатистые, пушистые или мучнистые колонии, которые срастаются со средой и с трудом снимаются петлей. Актиномицеты могут быть бесцветными или пигментированными (синие, фиолетовые, красные, желтые, оранжевые, зеленые и т. д.), на плотных питательных средах может образовываться воздушный мицелий, на концах которого развиваются споры, придающие колониям определенный цвет.

Грибы. Среди грибов встречаются сапрофита и паразиты.

Наибольшее значение для медицины представляют оомицеты (Oomycetus), аско-мицеты (Ascomycetes), базидиомицеты (Basidiomycetes), дейтеромицеты (Deuteromycetes). Форма клеток у молодых культур может быть круглая, яйцевидная или удлиненная, у зрелых клеток - грушевидная, булавовидная, веретенообразная, амебовидная. Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий, состоящий из разветвленных бесцветных нитей (гиф). У одних видов он состоит из нерасчлененной клетки (mucor), у других (высших грибов) он многоклеточный; у дрожжеподобных грибов (Candida) имеется псевдомицелий.

Почвенные актиномицеты и грибы имеют высокую чувствительность к действию отдельных химических веществ по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ. Они обладают чрезвычайно выраженными антагонистическими и токсическими свойствами, поэтому оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных биоценозов. Являются продуцентами многих физиологических активных веществ: аминокислот, ферментов, витаминов.

Для учета почвенных актиномицетов и грибов используются те же разведения почвенной суспензии, что и при учете общей численности микроорганизмов. Для выявления редких видов актиномицетов, не относящихся к роду Streptomyces, применяют антибиотики канамицин, рифампицин, новобиоцин, стрептомицин, нистатин, ингибирующие рост грибов, бактерий и быстрорастущих актиномицетов. Для учета почвенных грибов используют разведение почвенной суспензии 1 : 10 - 1 : 100, то есть , а при учете актиномицетов - 1 : 100-1 :10000 (от до ). Посев производят поверхностным способом, нанося на агаризованные среды 0,1-0,05 суспензии.

Для учета актиномицетов используется чаще всего крахмально-аммиачный агар или агар Ваксмана, при учете грибов - сусло-агар или минеральная среда Чапека, среда N 2 (агар Сабуро с левомицитином или теллуритом калия для ингибиции посторонней микрофлоры). При учете грибов используют добавление в среду веществ, ингибирующих рост бактерий, например, молочную кислоту в количестве 4 среды. Прибавлением такого количества кислоты доводят рН среды до (4,0-4,5). Кислота добавляется непосредственно перед посевом в расплавленную среду. Поскольку прибавляют концентрированные кислоты, то их предварительно не стерилизуют.

7.4. Определение аммонификаторов.

Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, определяющими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр, индекс аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25-30°С.

7.5. Определение степени токсичности почв по отношению к микроорганизмам.

Метод определения степени токсичности почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения ориентировочных данных о способности почвы самоочищаться от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Данный тест также чувствительный при определении влияния химических веществ на почвенный микробиоценоз. Низкая степень токсичности или ее снижение по отношению к патогенным микроорганизмам свидетельствует о наличии или возникновении более благоприятных условий для выживания возбудителей в таких почвах.

Данное явление неблагоприятное по классам:

1 - отсутствие - 0-20% токсичных образцов;

2 - слабо выраженная - 21-40% токсичных образцов;

3 - средняя 41-60% токсичных образцов;

4 - сильно выраженная - 61-80% токсичных образцов;

5 - абсолютная - 81 -100% токсичных образцов.

Для определения токсичности почв можно использовать два метода - качественный и качественно-количественный.

7.5.1. Качественный метод определения токсичности почв.

В стерильную чашку Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тест-микроорганизм. Затем чашки переносят в бокс и устанавливают на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5%-м непитательным агаром в количестве около 10,0 с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится питательный агар также в количестве 10 , адекватный тест-микроорганизмам. Из одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.

Посевы производятся петлей, причем движения петли всегда начинают с той части чашки, на которой помещена почва. В качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные среды, но без почвы.

Посевы инкубируют в зависимости от вида индикаторного микроорганизма. Учет результатов начинается с просмотра контрольного посева. В случае равномерного роста тест-микроба на всей поверхности агаровой пластинки просматривают остальные чашки с посевами. Колонии идентифицируются по "форме роста".

Из каждой серии посевов с нескольких чашек снимаются колонии и производится их идентификация.

Рост колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т). На отсутствие токсичности указывает наличии роста колоний на местах всех посевов.

7.5.2. Качественно-количественный метод определения токсичности почв.

В стерильную чашку Петри также вносится 10 г почвы и распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.

На матовую поверхность мембранных фильтров простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуют кипячением. Затем на питательную среду помещают мембранные фильтры (матовой поверхностью вверх) на чашку Петри. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производят посев бактериальной петлей (иглой) культуры индикаторного штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн бактериальных клеток в 1 по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливают в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируют в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей индикаторного штамма.

Учет результатов производят путем подсчета выросших колоний в точках посева. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле:

, где:

T - токсичность исследованного почвенного образца;

P - процент пророста.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова

------------------------------

* МУК 4.2.3695-21 введены взамен методических рекомендаций "Методы микробиологического контроля почвы", утвержденных заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.12.2004 N ФЦ/4022.

¹СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды, обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01,2021, регистрационный номер 62296); СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный номер 62297).

² Например, ГОСТ 17.4.3.01; ГОСТ 17.4.4.02.

³МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 06.07.2001, с изменениями, внесенными МУ 2.1.4.2899-11 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды. Изменение 1 к МУ 2.1.4.1057-01", утвержденными Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 12.07.2011; МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008; ГОСТ ISO 11133; ГОСТ ISO 7218.

⁴МУ 4.2.2723-10 "Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 13.08.2010; Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями, утвержденные заместителем министра здравоохранения СССР, Главным государственным санитарным врачом СССР 17.12.1984 N 04-723/3.

------------------------------

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 03.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 1.2.3685-20 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

3. СанПиН 2.1.3684-20 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".

4. МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".

5. МУ 2.1.4.2899-11 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды. Изменение 1 к МУ 2.1.4.1057-0,1".

6. МУ 4.2.2723-10 "Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в, пищевых продуктах и объектах окружающей среды".

7. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

8. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями, N 04-723/3.

9. ГОСТ ISO 11133 "Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред".

10. ГОСТ ISO 7218 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

11. ГОСТ 17.4.3.01 "Почва. Общие требования к отбору проб".

12. ГОСТ 17.4.4.02 "Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа".

13. ГОСТ Р 53091 "Качество почвы. Отбор проб. Руководство пo безопасности".

Методические указания разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (С. В. Кузьмин, Г. М. Трухина, П.В.Михеев, Н. А. Дмитриева, Е. А. Вишневская, Е. П. Лаврик, О. Н. Исакова); ФВУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В. Ю. Ананьев, М. В. Зароченцев, М. А. Ярославцева, В. В. Мордвинова).