Приложение В (обязательное). Определение содержания бенз(а)пирена методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Приложение В
(обязательное)

Определение содержания бенз(а)пирена методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматических углеводородов, содержащей бенз(а)пирен, очистке полученной фракции от мешающих примесей на колонке с сефадексом и в тонком слое ацетилированной целлюлозы с последующим количественным определением выделенного бенз(а)пирена высокоэффективной жидкостной хроматографией или спектрофлуориметрией при комнатной температуре.

Диапазон определяемых величин массовой доли бенз(а)пирена в анализируемых продуктах при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и метода спектрофлуориметрии при комнатной температуре - 0,0001-0,0020 мг/кг или 0,1 х 10 ^-7 % - 2,0 х 10 ^-7 %. Оптимальный диапазон определяемых массовых концентраций бенз[а]пирена в растворе при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии составляет 0,01-0,02 мкг/см ³, при использовании метода спектрофлуориметрии - 0,02-0,2 мкг/см ³.

В.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрометр флуоресцентный со спектральным диапазоном длин волн 300-460 нм с кюветами вместимостью 0,4 см ³.

Хроматограф жидкостный с флуориметрическим детектором (диапазон длин волн возбуждения 300-420 нм) с программным обеспечением для регистрации и обработки хроматограмм.

Колонка хроматографическая, заполненная сорбентом с привитой обращенной фазой в условиях выполнения анализа должна иметь эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику бенз(а)пирена.

Весы лабораторные II класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные II класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Испаритель ротационный типа ИР-1М.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Баня водяная.

Мешалка магнитная с электроприводом.

Осветитель ультрафиолетовый типа "Хроматоскоп" со спектральным диапазоном 250-700 нм и лампой типа БУВ-15 в качестве источника УФ-излучения.

Камера хроматографическая стеклянная 40 x 40 x 40 см.

Пластинки стеклянные для тонкослойной хроматографии 5 x 20 и 20 x 20 см.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 500 мм и диаметром 20 мм с оттянутым внизу концом и резервуаром вместимостью 50-60 см ³ ПШ 14/23.

Холодильник ХПТ-2-400-29/32 ХС или ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Алонж типа АИО-14/23-50 ТС или АИО-14/23-14/23-65 ТС по ГОСТ 25336.

Линейка измерительная с ценой деления 0,1 см по ГОСТ 427.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или 300-19/26-29/32 по ГОСТ 25336.

Насадка П-1-19/26-14/23-14/23 ТС или Н-2-19/26-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка делительная ВД-1-500 или ВД-3-500 по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-100, 1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 1770.

Стакан химический В-1-100 или В-1-150 по ГОСТ 25336.

Колба 1-500 по ГОСТ 25336.

Колба Гр 50-14/23 по ГОСТ 25336.

Колбы К-1-100-29/32 ТХС, К-1-25Р-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Колбы Кн-1000-29/32 ТХС по ГОСТ 25336, Кн-250-34 ТХС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Воронка Бюхнера 1 или 2, или 3 по ГОСТ 9147.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ-34/12 по ГОСТ 25336.

Микрошприцы типов МШ-10, стеклянные капилляры.

Пипетки 1-1-1, 1-1-2, 2-1-5, 8-2-0,2 по ГОСТ 29228 или ГОСТ 29229.

Бумага индикаторная универсальная.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Скальпель или тонкий шпатель.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Бензол по ГОСТ 5955, ч. д. а.

Толуол по ГОСТ 5789, ч. д. а.

н-Гексан, ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, ч. д. а.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч. или о. ч.

Ангидрид уксусный по ГОСТ 5815, ч.

Диметилформамид по ГОСТ 20289, ч. д. а.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч. д. а.

Целлюлоза микрокристаллическая порошковая.

Бенз(а)пирен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Бенз(b)хризен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Допускается вместо чистых веществ использовать ГСО раствора бенз(а)пирена и бенз(b)хризена в ацетонитриле массовой концентрации 100 мкг/см ³.

Сефадекс LH-20.

Силикагель марки АСКГ по ГОСТ 3956.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивы и материалы по качеству не уступающие указанным выше и обеспечивающие получение результатов измерений с точностными характеристиками не ниже предусмотренных настоящим стандартом.

В.2 Подготовка к испытанию

В.2.1 Подготовка растворителей

Растворители (н-гексан, этиловый спирт, ацетон, бензол) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

Диметилформамид перегоняют, добавив в перегонную колбу 120 см ³ бензола и 36 см ³ воды на 1 дм ³ растворителя.

В.2.2 Приготовление ацетилированной целлюлозы

(50,0  2,0) г микрокристаллической целлюлозы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см ³, добавляют приготовленную в отдельной колбе смесь 150 см ³ бензола или толуола, 70 см ³ уксусного ангидрида и 0,3 см ³ серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают магнитной мешалкой в течение 6-8 ч, оставляют без перемешивания еще на 18 ч, после чего декантируют жидкую фазу, а остаток заливают 300 см ³ этилового спирта, перемешивают, оставляют в спирте на 24 ч, затем целлюлозу отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 100 см ³ этилового спирта и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге).

Затем проверяют хроматографическую активность ацетилированной целлюлозы. Для этого за 3-4 ч до проведения испытания готовят смесь этилового спирта, ацетона и воды, взятых в объемном отношении 60:25:15 и выливают ее в выстланную полосками фильтровальной бумаги хроматографическую камеру. Высота слоя растворителя должна составлять 1,5-2,0 см. 1,5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 7 см ³ этилового спирта и выливают суспензию ровным слоем на стеклянную пластину 5 x 20 см, дают растворителю полностью испариться на воздухе и наносят на пластинку микрошприцем или стеклянным капилляром в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см ³. Пластину помещают в хроматографическую камеру и оставляют в камере до тех пор, пока уровень растворителя поднимется не менее чем на 100 мм от линии старта. По окончании хроматографии пластину вынимают, высушивают на воздухе и под лампой ультрафиолетового облучателя отмечают флуоресцирующее голубым цветом пятно бенз(а)пирена. Измеряют расстояние от стартовой линии до фронта растворителя и до середины пятна бенз(а)пирена; рассчитывают значение R _f, оценивающую скорость перемещения бенз(а)пирена по пластинке, по формуле

,

(В.1)

где - расстояние от стартовой линии до середины пятна бенз(а)пирена, мм;

L - расстояние от стартовой линии до фронта растворителя, мм.

Значение R _f бенз(а)пирена должно составлять 0,1.

Для приготовления рабочей пластины 5 г ацетилированной целлюлозы суспензируют в 20 см ³ этилового спирта и выливают ровным слоем на пластину размером 20 x 20 см.

В.2.3 Приготовление стандартных растворов бенз(а)пирена и бенз(b)хризена

В стаканчиках для взвешивания (бюксы) взвешивают по (10,0  0,2) мг бенз(а)пирена и бенз(b)хризена. Навески количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см ³: бенз(а)пирен - бензолом (ацетонитрилом), бенз(b)хризен - ацетонитрилом, затем объем раствора бенз(а)пирена доводят до метки бензолом (ацетонитрилом), объем раствора бенз(b)хризена - ацетонитрилом. Полученные растворы имеют массовую концентрацию 100 мкг/см ³. Растворы хранят в темном месте при температуре от 2 °С до 6 °С не более трех месяцев.

Допускается в качестве стандартных растворов бенз(а)пирена и бенз(b)хризена использовать ГСО раствора бенз(а)пирена и бенз(b)хризена в ацетонитриле массовой концентрации 100 мкг/см ³.

В.2.4 Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена и бенз(b)хризена

Рабочие растворы готовят разбавлением стандартных растворов, используя пипетки вместимостью 1,5 и 10 см ³ и мерные колбы вместимостью 100 см ³, объем раствора доводят до метки соответствующим растворителем, перемешивают и хранят в темном месте при температуре от 2 °С до 6 °С не более одного месяца.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1,0 мкг/см ³ (для определения методом спектрофлуориметрии): из стандартного раствора отбирают 1,0 см ³ и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см ³; объем раствора доводят до метки бензолом.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25; 1,0 и 5,0 мкг/см ³ (для определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии): из стандартного раствора отбирают 0,25; 1,0; 5,0 см ³ соответственно и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см ³; объем растворов доводят до метки ацетонитрилом.

Приготовление растворов бенз(b)хризена массовой концентрации 0,5 и 10 мкг/см ³: из стандартного раствора отбирают 0,5 и 10 см ³ соответственно и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см ³; объем каждого раствора доводят до метки ацетонитрилом.

В.2.5 Приготовление градуировочных растворов

Для приготовления градуировочных растворов смеси бенз(а)пирена и бенз(b)хризена в мерные колбы вместимостью 250 см ³ пипеткой вместимостью 1 см ³ переносят приведенные в таблице В.1 объемы стандартного раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см ³ и рабочего раствора бенз(b)хризена массовой концентрации 10 мкг/см ³, доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученные растворы перемешивают и хранят в темном месте при температуре от 2 °С до 6 °С не более одного месяца.

Таблица В.1 - Объемы растворов

Номер раствора	Объем исходного раствора, см 3		Массовая концентрация в градуировочном растворе, мкг/см 3
	Бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см 3	Бенз(b)хризена массовой концентрации 10 мкг/см 3	Бенз(а)пирена	Бенз(b)хризена
1	1,00	1,00	0,40	0,04
2	0,50	0,50	0,20	0,02
3	0,25	0,25	0,10	0,01
4	0,10	0,10	0,04	0,004

В.3 Проведение испытания

В.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную или плоскодонную колбу вместимостью 100 см ³ помещают навеску продукта массой 10 г, добавляют раствор, состоящий из 4 г гидроокиси калия в 50 см ³ 92 %-ного этилового спирта. Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане или на магнитной мешалке при кипении реакционной смеси в течение 3 ч. Затем в колбу через холодильник добавляют 100 см ³ дистиллированной воды. Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения реакционную массу переносят в делительную воронку вместимостью 500 см ³. Если после гидролиза в реакционной массе остался твердый остаток, его отделяют на воронке Бюхнера, промывая остаток на фильтре 30 см ³ горячего этилового спирта. Жидкую фазу реакционной массы используют для экстракции. В делительную воронку добавляют 30 см ³ н-гексана. Содержимое воронки встряхивают и оставляют для расслаивания жидкостей. В случае образования эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см ³ этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают в колбу, а гексановый экстракт переливают в другую делительную воронку. Такую обработку реакционной массы проводят еще два раза, используя для экстракции н-гексан по 30 см ³ и этиловый спирт для расслаивания эмульсии порциями по 20 см ³.

После завершения экстракции промывают объединенный гексановый экстракт в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 30 см ³, переносят экстракт в круглодонную колбу вместимостью 100 см ³, фильтруя через слой безводного сульфата натрия на воронке с пористым фильтром. Упаривают раствор на ротационном испарителе до объема 50 см ³ при температуре водяной бани не выше 60 °С.

Упаренный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 500 см ³ и добавляют к нему 50 см ³ смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении 9:1. Интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин, после расслаивания фаз нижнюю сливают в плоскодонную колбу вместимостью 200 см ³, а из верхнего гексанового слоя снова проводят экстракцию 50 см ³ смеси диметилформамида и воды. Гексановый слой отбрасывают, объединенный в плоскодонной колбе диметилформамидный экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 100 см ³ дистиллированной воды и проводят экстракцию из водной фазы гексаном трижды по 50 см ³. Водную фазу отбрасывают, а гексановый экстракт промывают водой трижды по 30 см ³, переносят в плоскодонную колбу, добавляют 10 г безводного сульфата натрия и выдерживают в течение одного часа. н-Гексан упаривают на ротационном испарителе до объема 1,5-2,0 см ³, оставшийся растворитель удаляют потоком воздуха через вакуумный алонж, соединенный с водоструйным насосом, остаток в колбе растворяют в 0,5 см ³ этилового спирта.

В стакан вместимостью 100 см ³ отвешивают (2,5  0,2) г сефадекса LH-20, добавляют 20 см ³ этилового спирта и оставляют для набухания на 3-4 ч. Затем гель переносят, смывая небольшим количеством спирта, в стеклянную хроматографическую колонку, дают растворителю стечь таким образом, чтобы слой спирта над слоем сорбента оставался не ниже 2 мм. На подготовленную колонку наносят пипеткой остаток экстракта из колбы, трижды смывая его из колбы этиловым спиртом порциями по 0,5 см ³. Элюирование из колонки полициклических ароматических углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, проводят 40 см ³ этилового спирта, первую фракцию объемом 12 см ³ отбрасывают, собирают вторую фракцию объемом 25 см ³. Скорость элюирования растворителя 0,5 см ³/мин обеспечивают, создавая небольшое избыточное давление потоком воздуха или азота через насадку, соединенную с воздуходувкой или газовым баллоном. Газ следует подавать через стеклянную трубку, заполненную силикагелем.

Допускается повторно использовать колонку с сефадексом LH-20. Для повторного использования, не допуская высыхания сорбента после фракционирования, промывают колонку 25 см ³ этилового спирта и наносят следующую пробу. Для хранения необходимо заполнить колонку этиловым спиртом, закупорить колонку пробкой и не допускать высыхания сорбента. В случае высыхания сефадекса LH-20 рекомендуется приготовить новую колонку.

Переносят раствор второй фракции в грушевидную колбу вместимостью 50 см ³, растворитель упаривают до объема 0,5-1,0 см ³, его остаток удаляют в потоке воздуха или азота.

Полученную фракцию, содержащую бенз(а)пирен, далее анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или спектрофлуориметрическим методом.

Одновременно проводят контрольный опыт, проводя все стадии испытания с использованием реактивов согласно методике, но без навески продукта.

В.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

В.3.2.1 Условия хроматографии

Условия хроматографии подбирают в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.

В качестве примера приведены следующие условия хроматографического определения бенз(а)пирена.

Жидкостный хроматограф с флуоресцентным детектором.

Колонка зернением 5 мк, длиной 150 мм, диаметром - 4,6 мм.

Флуориметрический детектор: длина волны возбуждающего света 300 нм, эмиссионный фильтр - 418 нм.

Подвижная фаза: ацетонитрил и вода в объемном соотношении 8:2.

Скорость элюирования - 2,0 см ³/мин.

Объем вводимой пробы - 20 мкл.

Чувствительность усилителя подбирают таким образом, чтобы интенсивность сигналов бенз(а)пирена и внутреннего стандарта - бенз(b)хризена не превышала 95 % шкалы.

Время испытания - 15 мин; время удерживания бенз(а)пирена - 5 мин, бенз(b)хризена - 13 мин.

Анализируемые растворы хроматографируют дважды в одинаковых условиях. Площади пиков измеряют с помощью программного обеспечения или вручную: как произведение высоты пика и его ширины на половине высоты.

Определяют содержание бенз(а)пирена методом внутреннего стандарта или методом добавок.

В.3.2.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по В.3.1, методом внутреннего стандарта

При использовании такого метода количественной оценки предварительно проводят градуировку хроматографа, используя градуировочные растворы, приготовленные по В.2.5.

В условиях, указанных в В.3.2.1, записывают по три хроматограммы для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(b)хризена. Определяют среднеарифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(b)хризена, рассчитанное по трем хроматограммам.

Вычисляют градуировочный коэффициент по формуле

,

(В.2)

где и - массы введенных в хроматограф бенз(а)пирена (m ₁) и бенз(b)хризена (m ₂), мкг;

и - площади пиков бенз(а)пирена S ₁ и бенз(b)хризена S ₂, см ³.

Рассчитывают градуировочный коэффициент K для каждого раствора.

Его значения не должны отличаться от среднеарифметического значения градуировочного коэффициента из всех результатов более чем на 10 %.

При длине волны возбуждающего света 300 нм и эмиссионном фильтре 418 нм значение градуировочного коэффициента составляет 9,5.

Перед началом испытания на стадии подготовки проб к щелочному гидролизу в пробу продукта и пробу контрольного опыта вносят по 50 мкл раствора бенз(b)хризена массовой концентрации 0,5 мкг/см ³. Обе пробы проводят через все стадии испытания, указанные в В.3.1. Сухой остаток растворяют в 200 мкл ацетонитрила.

В условиях, указанных в В.3.2.1, записывают хроматограммы раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см ³ и раствора бенз(b)хризена массовой концентрации 100 мкг/см ³, отмечают время выхода бенз(а)пирена и бенз(b)хризена. Затем записывают хроматограммы пробы контрольного опыта с добавкой бенз(b)хризена и пробы продукта с такой же добавкой бенз(b)хризена. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(b)хризена на хроматограммах пробы продукта и пробы контрольного опыта.

Для каждой пробы записывают по две хроматограммы. Рассчитывают среднеарифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(b)хризена по двум хроматограммам.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта m ₁ и пробе контрольного опыта m ₂:

,

(В.3)

где - масса бенз(а)пирена в пробе продукта, мкг;

- масса бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мкг;

- масса бенз(b)хризена, введенного в пробу продукта и пробу контрольного опыта, мкг;

и - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы продукта S ₂ и пробы контрольного опыта S ₂, см ²;

, - площади пиков бенз(b)хризена на хроматограммах пробы продукта S ₃ и пробы контрольного опыта S ₄, см ²;

K - градуировочный коэффициент, вычисленный по формуле (В.2).

В.3.2.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по В.3.1, методом добавок

Для количественной оценки при использовании метода добавок одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта. Фракции, выделенные из проб продукта и контрольного опыта по В.3.1, растворяют в 400 мкл ацетонитрила. Полученные растворы делят на две части, отбирая меньшую часть (40 мкл) в пробирку или грушевидную колбу.

Записывают хроматограммы пробы продукта, пробы контрольного опыта и хроматограмму раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25 мкг/см ³. Отмечают время выхода бенз(а)пирена.

В оставшиеся части пробы продукта и контрольного опыта (360 мкл) добавляют 10-20 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 5 мкг/см ³. Полученные растворы вновь вводят в хроматограф.

Все хроматограммы записывают дважды. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена. Рассчитывают среднеарифметическое значение площади пика бенз(а)пирена по двум хроматограммам.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта m ₁ и пробе контрольного опыта m ₂:

,

(В.4)

где и - масса бенз(а)пирена, добавленная к части экстракта из пробы продукта (m _оп) и пробы контрольного опыта (m _к), мкг;

и - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы продукта S ₁ и пробы продукта с добавкой бенз[а]пирена S ₂, см ³;

и - площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы контрольного опыта S ₃ и пробы контрольного опыта с добавкой бенз(а)пирена S ₄, см ³;

0,9 - доля пробы, к которой добавляют бенз(а)пирен.

В.3.3 Определение содержания бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре

При определении содержания бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта, в которую добавлено 50 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см ³.

Полученные по В.3.1 фракции, содержащие бенз(а)пирен, из пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой растворяют в 0,5 см ³ бензола и далее подвергают дополнительной очистке в тонком слое ацетилированной целлюлозы.

Для этого пластинку размером 20 x 20 см, подготовленную, как указано в В.2.2, делят на два поля: боковое - шириной 1,5-2,0 см и основное, проводя по слою сорбента скальпелем или тонким шпателем разделительную полосу. На основное поле сплошной полосой, отступив 2 см от нижнего края пластинки и по 1 см с боковых краев, наносят раствор фракции, выделенной по В.3.1. Наносят раствор с помощью тонко оттянутого капилляра или микрошприца, размер пятен не должен превышать 5 мм. Для количественного переноса вещества его дважды смывают со стенок колбы небольшим количеством бензола 0,4-0,6 см ³. На стартовую линию бокового поля наносят в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см ³. После полного испарения растворителя пластинку помещают в предварительно насыщенную хроматографическую камеру под углом 70° - 85° и проводят элюирование в смеси этилового спирта, ацетона и воды, взятых в соотношении 60:25:15. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее удаляют из камеры, сушат на воздухе и проявляют хроматографическую зону бенз(а)пирена под лампой ультрафиолетового облучателя. Соскабливают с пластинки сорбент из зоны бенз(а)пирена с основного поля с помощью скальпеля или тонкого шпателя и переносят на стеклянный фильтр, с которого вещество элюируют в несколько приемов 50 см ³ бензола в колбы вместимостью 100 см ³, далее растворитель упаривают до объема 50 (30) см ³ при температуре водяной бани не выше 50 °С, удаляют остаток растворителя потоком воздуха и добавляют в колбу 1 см ³ бензола.

На спектрофлуориметре при длине волны возбуждающего света 386 нм в диапазоне 400-440 нм при скорости сканирования 60 нм/мин записывают спектры флуоресценции пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой бенз(а)пирена.

Записывают спектры растворов в одном режиме усиления, регулируя щель и коэффициент усиления по раствору контрольной пробы таким образом, чтобы сигнал бенз(а)пирена при 406 нм составлял 0,4-0,6 шкалы прибора. Для каждого раствора спектр записывают дважды, добиваясь хорошей воспроизводимости. На полученных спектрограммах в максимуме при 406 нм измеряют в миллиметрах высоту спектральной линии бенз(а)пирена для пробы продукта и пробы контрольного опыта. Рассчитывают среднее значение высот бенз(а)пирена по данным двух спектрограмм. При высоких уровнях содержания бенз(а)пирена в продукте пробы разбавляют бензолом и вновь записывают спектр в том же режиме усиления, что и для контрольной пробы.

Получают два единичных результата испытаний в условиях повторяемости. За единичный результат испытаний принимают результат одного определения, т.е. значение, полученное при одноразовом выполнении всех операций метода испытаний.

В.4 Обработка результатов

В.4.1 Вычисляют массовую долю бенз(а)пирена в продукте X ₁, %, или Х ₂, мг/кг, при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии по формулам:

;

(В.5)

,

(В.6)

где - масса бенз(а)пирена в пробе продукта, мкг;

- масса бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мкг;

m - масса продукта, взятая для испытания, г.

В.4.2 Вычисляют массовую долю бенз(а)пирена в продукте, % или мг/кг, при использовании метода спектрофлуориметрии по формулам:

;

(В.7)

,

(В.8)

где - массовая концентрация бенз(а)пирена в рабочем растворе, приготовленного по В.2.4 и добавленного в пробу контрольного опыта, мкг/см ³;

H - высота спектральной линии бенз(а)пирена на спектрограмме пробы продукта, мм;

- высота спектральной линии бенз(а)пирена;

V - объем рабочего раствора бенз(а)пирена, добавленного в пробу контрольного опыта, см ³;

m - масса навески продукта, взятого для испытания, г.

Результат округляют до второй значащей цифры.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое двух единичных результатов испытаний, полученных в условиях повторяемости, с тем же числом значащих цифр.

Если расхождение между единичными результатами испытаний в условиях повторяемости не превышает   , где Х ₁, Х ₂ и X - единичные результаты испытаний в условиях повторяемости и их среднее арифметическое, а r _отн - норматив контроля повторяемости, то среднее арифметическое X принимают за результат испытания. В противном случае испытание повторяют. Значение норматива r _отн приведено в таблице В.2.

Таблица В.2 - Диапазон измерений, значение характеристики относительной погрешности и нормативы оперативного контроля случайной составляющей относительной погрешности (повторяемости и воспроизводимости) при доверительной вероятности Р = 0,95

Диапазон измерений, мг/кг	Характеристика относительной погрешности (границы интервала, в котором погрешность находится с заданной вероятностью), , %	Нормативы оперативного контроля повторяемости r отн, % (для двух результатов испытаний в условиях повторяемости, n = 2)	Норматив оперативного контроля воспроизводимости, R отн, % (для двух результатов испытаний в условиях воспроизводимости, m = 2)
От 0,0001 до 0,001 включ.	42	40	60
Св. 0,001 до 0,002 включ.	29	28	42

По полученному результату испытания X и значению относительной погрешности , приведенной в таблице В.2, вычисляют абсолютную погрешность  = .

Результат испытания представляют в виде (Х  ), мг/кг или %, при Р = 0,95.

В.4.3 За отсутствие бенз(а)пирена принимают значение ниже порога обнаружения методики, т.е. менее 0,0001 мг/кг.

В.5 Контроль точности результатов испытания

Внутренний оперативный контроль (ВОК) качества результатов испытания включает контроль повторяемости, воспроизводимости и точности результатов испытания.

В.5.1 Для каждой испытуемой пробы контролируют показатель повторяемости, используя контрольные нормативные значения повторяемости согласно таблице В.2.

В.5.2 Для проведения контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и проводят испытания в соответствии с методикой в разных лабораториях или в одной лаборатории, максимально варьируя условия проведения испытания, т.е. используют разные наборы мерной посуды, испытания выполняют в разные дни или два разных исполнителя.

Воспроизводимость контрольных испытаний признают удовлетворительной, если   , где Х ₁, Х ₂ и X - результаты испытания одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьируемых условиях в одной лаборатории, и их среднее арифметическое значение, R _отн - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива R _отн приведено в таблице В.2.

В.5.3 Для проведения контроля точности используют рабочие пробы с известной добавкой бенз(а)пирена. Пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку бенз(а)пирена и затем также анализируют в соответствии с методикой. Величина добавки должна составлять 50 % - 150 % содержания бенз(а)пирена в анализируемой пробе.

Точность контрольных испытаний признают удовлетворительной, если   K, где Х ₁, X и с - результаты контрольных испытаний пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена соответственно; K - норматив оперативного контроля точности.

Норматив оперативного контроля точности вычисляют по формулам:

при проведении внутрилабораторного контроля (Р = 0,90)

;

(В.9)

при проведении внешнего контроля (Р = 0,95)

,

(В.10)

где и - значения характеристики погрешности, соответствующие массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с добавкой бенз(а)пирена и в реальной пробе;

,

где и Х - массовая концентрация бенз(а)пирена в пробе с добавкой и в реальной пробе, мг/кг или %.

Значения относительной погрешности () приведены в таблице В.2.

При превышении нормативов оперативного внутреннего контроля точности проводят повторные испытания. При повторном превышении указанных нормативов испытания приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

В.6 Требования техники безопасности при проведении испытаний

В.6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004 и требования электробезопасности - по ГОСТ 12.1.019, а также требования безопасности при работе на спектрофлуориметре, жидкостном хроматографе, а также других приборах и оборудовании.

В.6.2 Помещение, в котором выполняют измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работы необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.

В.6.3 Растворы бенз(а)пирена, а также отработанные окись алюминия и ацетилированную целлюлозу после использования необходимо обработать крепким раствором марганцовокислого калия по ГОСТ 5777 для окисления бенз(а)пирена, после чего раствор сливают в канализацию с большим количеством воды.