Приложение 3-2. Инструкция по проведению диагностики COVID-19 с примением иммунохимических методов

Приложение 3-2

Инструкция по проведению диагностики COVID-19 с примением иммунохимических методов

Общие положения

Иммунохимические методы используются для выявления антигенов SARS-CoV-2 и антител к вирусу и дополняют комплекс клинических, инструментальных и лабораторных методов диагностики COVID-19 новой информацией, имеющей клиническое и эпидемиологическое значение. К иммунохимическим относятся методы иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохемилюминесценции (ИХЛ) и иммунохроматографии. Эффективность иммунохимических методов зависит от стадии инфекционного процесса, состояния иммунной системы пациента, а также от характеристик применяемых диагностических наборов.

Иммунохимические исследования для диагностики COVID-19 могут проводится во всех лабораториях Российской Федерации вне зависимости от их организационно-правовой формы, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека III - IV патогенности и условия для исследований с применением иммунохимических методов. Для проведения исследования должны применяться зарегистрированные в установленном порядке на территории Российской Федерации диагностические наборы реагентов (тест-системы) в соответствии с инструкциями по их применению. Перечень зарегистрированных наборов реагентов представлен в Государственном реестре медицинских изделий.

С целью диагностики COVID-19 непрямым методом рекомендуется проведение раздельного тестирования на антитела класса IgM/IgA и IgG, а также мониторинг появления антител в динамике (детекция сероконверсии) - повторное тестирование в неясных случаях через 5-7 дней.

Для минимизации ложноположительных результатов рекомендуется ввести алгоритм последовательного тестирования пациентов, у которых получены первоначальные положительные результаты на антитела классов IgM/IgA или IgG, с использованием другого теста. С этой целью необходимо использовать тест-систему с максимальными чувствительностью и специфичностью, а также с одновременным выявлением антител классов A, M, G, которая будет играть роль референтной (верифицирующей) тест-системы. В качестве такой тест-системы может использоваться тест-система для выявления рецептор-связывающего домена поверхностного гликопротеина S SARS-CoV-2.

Тестирование на антитела к вирусу SARS-Cov-2 рекомендуется использовать:

- в качестве дополнительного метода диагностики острой инфекции (с учетом сероненгативного периода) или при невозможности исследования мазков МАНК, в том числе при госпитализации в стационар по поводу соматической патологии;

- для установления факта перенесенной ранее инфекции;

- для отбора потенциальных доноров иммунной плазмы.

Иммунохимические методы диагностики COVID-19

Выявление антигенов SARS-CoV-2 проводится иммунохроматографическими методами (ИФА, ИХЛ или иммунохроматографии). Экспресс-тесты для определения антигенов (с применением иммунохроматографии) позволяют получить результат за 10-30 минут. Диагностическая чувствительность и специфичность экспресс-тестов на антиген SARS-CoV-2 могут быть ниже, чем у тестов на основе МАНК.

Положительные результаты тестов на антиген SARS-CoV-2 могут ожидаться в тот же период развития заболевания, что и выявление РНК вируса: за 2 дня до и на протяжении 5-7 дней после появления симптомов. Положительный результат теста может рассматриваться как подтверждение диагноза COVID-19, отрицательный результат не позволяет исключить COVID-19.

Иммуонхроматографические тесты могут применяться для экспресс-диагностики COVID-19 в ситуациях, когда проведение молекулярно-генетического тестирования МАНК невозможно, в том числе в удаленных и малонаселенных регионах. Необходимо иметь ввиду, что тест на антиген SARS-CoV-2 при малой распространенности заболевания имеет более низкую прогностическую ценность положительного результата.

Выявление антител к SARS-CoV-2 проводится с помощью методов ИФА, ИХЛ или иммунохроматографии. Разработанные методы ИФА и ИХЛ позволяют получать качественные, полуколичественные (коэффициент позитивности) и количественные результаты. Для определения уровней иммноглобулинов к SARS-CoV-2 необходимо использовать наборы реагентов для количественного определения антител, а результаты исследлований представлять с использованием условных единиц измерения BAU/мл (binding antibody units, "единицы связывающих анител").

Иммунохроматографические методы - быстрые диагностические тесты, рассматриваются как тесты "у постели больного" (время получения результата - 10-30 минут). Иммунохроматографические тесты являются качественными тестами и позволяют определить наличие антител к SARS-CoV-2 (IgM, IgG, суммарные антитела).

С помощью выявления отдельных классов антител к SARS-CoV-2 (IgA/IgM, IgG) возможно определение различных фаз инфекционного процесса:

- серонегативная фаза - антитела могут не выявляться в первичном образце, но выявляются во взятых через несколько дней образцах;

- активная фаза - при определении диагностически значимого уровня IgA и/или IgM в одном образце или значимого нарастания уровня IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом в 2-4 недели;

- фаза реконвалесценции - концентрация IgA и IgM, как правило, существенно снижается (падение титра в 2-4 раза) во время выздоровления, при сохраняющихся IgG через 2 недели после курса лечения и позднее;

- перенесенная инфекция - персистенция IgG без роста его уровня в парных сыворотках и отсутствие IgA и IgM.

Определение IgG к SARS-CoV-2 через 4 недели после вакцинации позволяет подтвердить наличие поствакцинального иммунитета. Длительность периода детектируемого наличия антител не определена, но в настоящее время рассматривается как период не менее 3 месяцев.

Сбор, хранение и транспортировка образцов биологического материала

Преаналитический этап. Биоматериалом для проведения иммунохимических исследований может быть капиллярная кровь, сыворотка, плазма, цельная венозная кровь (в зависимости от типа тестирования и согласно инструкциям производителей).

Забор крови проводят в соответствии с ГОСТ Р 53079.4-2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа.

Пробирки с кровью транспортируют в термоконтейнерах с надписью: "пробы крови для лабораторных исследований". В термоконтейнере должна поддерживаться температура от +4 до +8°С. Пробы крови от лиц с установленным диагнозом COVID-19 помещают в дополнительный вторичный контейнер, затем - в термоконтейнер с надписью: "пробы с инфицированным материалом".

Образцы крови должны быть доставлены в лабораторию в кратчайшие сроки. В журнале учета лабораторных исследований регистрируют время доставки проб в лабораторию.

Хранение образцов цельной крови допустимо при температуре 20-25°С не более 2 часов, при температуре 2-8°С - не более 6 ч с момента забора биоматериала.

Сроки хранения проб сыворотки при температуре 2-8°С - не более 4 дней. Хранение проб сывороток от 5 дней до 1 года осуществляют в замороженном виде при температуре не выше минус 18°С. Длительное хранение проб (более года) осуществляется при температуре не выше минус 40°С.

Аналитический этап проводится в соответствии с инструкцией к набору реагентов, который применяется для исследования.

Постаналитический этап. Оценка результатов иммунохимических исследований проводится в соответствии с инструкцией производителя применяемых медицинских изделий (тест-системы/набора реагентов и оборудования). Рекомендации по интерпретации результатов исследований приведены в таблице.

Интерпретация результатов исследований методами амплификации нуклеиновых кислот и иммунохимическими методами

Результаты исследования SARS-CoV-2				Интерпретация*
РНК	Антиген	IgM/ IgA	IgG
-	-	-	-	Отсутствие текущей и ранее перенесенной инфекции COVID-19
+	+	-	-	Острая фаза инфекции. Серонегативный период. Результат может предшествовать появлению симптомов COVID-19
+	+	+	-	Острая фаза инфекции, Начало развития иммунного ответа
+	+	+	+	Острая фаза инфекции, выраженный иммунный ответ на инфекцию COVID-19
-	-	+	+	Поздняя фаза заболевания или выздоровление, выраженный иммунный ответ.
-	-	-	+	Наличие инфекции COVID-19 в прошлом или период выздоровления. Сформирован иммунитет к SARS-CoV-2.

------------------------------

* - результаты исследований суммарных антител интерпретируются в соответствии с включенным в определение видом антител

------------------------------

Интерпретация результатов иммунохимических исследований должна проводиться с учетом анамнеза и клинических данных, а также результатов других лабораторных и инструментальных исследований. Необходимо также учитывать вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Ложноположительные результаты могут появиться при наличии в крови пациента так называемых "перекрестно-реагирующих" антител, сходных по своим иммунохимическим свойствам со специфическими антителами (других коронавирусов, ревматоидным фактором IgM). Ложноотрицательные результаты могут быть получены при исследовании биологических образцов, взятых на серонегативном этапе развития инфекции, или при применении наборов реагентов (тест-систем) с низким уровнем чувствительности. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при обследовании пациентов со сниженным иммунитетом.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты могут также появляться при нарушении правил проведения лабораторных исследований на всех этапах.

Дезинфекция, обращение с отходами при проведении диагностики COVID-19 с примением иммунохимических методов проводится аналогично требованиям к дезинфекции и обращению с отходами с применением методов амплификации нуклеиновых кислот (Приложение 3-1).