Приложение А (обязательное). Количественное исследование белка, демонстрирующее изменение количества белков во время экстракорпорального хранения

Приложение А
(обязательное)

Количественное исследование белка, демонстрирующее изменение количества белков во время экстракорпорального хранения ^*

------------------------------

^*_{Исследование выполнено проектом EU FP7 SPIDIA, финансированным седьмой рамочной программой Европейского союза [FP7/2007-2013] по грантовому соглашению N 222916. Для получения дополнительной информации см. www.spidia.eu. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.}

------------------------------

А.1 Введение

Фосфорилирование и дефосфорилирование являются ключевыми механизмами внутри- и межклеточной передачи сигнала и отражают статус активации клетки. Определение специфических профилей фосфопротеинов необходимо для разработки таргетных терапий, борющейся с нарушениями в системе сигнальных путей у больных раком. Тем не менее имеющиеся знания о влиянии факторов, предшествующих исследованию, таких как время, прошедшее до замораживания ткани, на изменения белка и фосфопротеина очень ограничены.

Результаты данного исследования дают представление о различиях, возникающих у пациентов, а также колебаниях белковых и фосфопротеиновых профилей в клинических образцах тканей во время преаналитического этапа. Как будет показано ниже, результаты данной экспериментальной работы, используя в качестве примеров ткани кишечника и печени человека, ясно показывают, что существует необходимость стандартизировать сбор замороженных тканей и последующее выделение и хранение белков и фосфопротеинов перед количественным анализом. Стандартизация должна подразумевать отражение в документации длительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения. Хотя результаты, полученные для интракорпоральной ишемии, здесь не приведены (см. дополнительные источники информации), приведенные данные указывают, что продолжительность экстракорпорального хранения влияет на белковые профили. Таким образом, существует риск того, что из-за различий в продолжительности интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения, а также других параметров процесса подготовки результаты исследования могли бы стать ненадежными, а значимые биомаркеры для лечения пациентов могли бы быть пропущены или неверно истолкованы.

А.2 Пример

А.2.1 Общие положения

В эксперименте использовались ткани кишечника и печени человека для оценки с учетом временной динамики влияния длительного экстракорпорального хранения на количество белков и фосфопротеинов в образцах до заморозки. Результаты показали, что количество белка и фосфопротеина изменилось до стабилизации тканей путем заморозки.

Эти изменения были различны у разных пациентов и в случае разных типов ткани. Например, усиление экспрессии фосфо-р42/44 митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) в образцах кишечника наблюдалось у одних пациентов и не наблюдалось у других. Эти выраженные различия у разных пациентов препятствовали установлению в группе пациентов общих тенденций повышения или снижения экспрессии большинства белков. Однако количество некоторых белков, таких как цитокератин 18, значительно изменялось после резекции в образцах у большинства пациентов в сравнении с исходным индивидуальным уровнем. И напротив, было установлено, что количество глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и -актина стабильно в течение длительного периода экстракорпорального хранения.

А.2.2 Методика эксперимента

А.2.2.1 Общие положения

Ткани кишечника и печени человека собирали в разных больницах, применяя один рабочий процесс. Время между перевязкой сосуда (t ₁) и хирургической резекцией (t ₂) определяется как экстракорпоральная ишемия (1). Время между хирургической резекцией и заморозкой, как правило, являющееся временем транспортирования (2) в патологоанатомическою лабораторию, определяется как экстракорпоральное хранение (4). В целях изучения влияния временной динамики был выполнен эксперимент, заморозка в котором проводилась с задержкой (3); в момент t ₃ был изготовлен образец сравнения, далее материалы хранились во влажной камере при комнатной температуре, и в разные моменты времени (от t ₄ до t ₈) образцы замораживались, что в результате привело к задержке времени экстракорпорального хранения (5).

А.2.2.2 Ткани

Чтобы изучить влияние экстракорпорального хранения на количество белка и фосфопротеинов, в ходе плановых хирургических процедур были взяты образцы доброкачественных тканей кишечника и печени человека. Образцы были доставлены при комнатной температуре в Институт патологии для дальнейшей работы. Каждый образец был разделен на фрагменты размером минимум 5 мм x 5 мм x 5 мм, которые были подвергнуты процедуре мгновенной заморозки в жидком азоте. Образец сравнения был заморожен немедленно по прибытии в лабораторию патологии (см. рисунок А.1, t ₃). Все остальные фрагменты хранили во влажной камере при комнатной температуре в течение 30-360 мин, имитируя в рамках эксперимента задержку до заморозки (см. рисунок А.1).

1 - время интракорпоральной ишемии; 2 - транспортирование; 3 - время, на которое была отложена заморозка в рамках эксперимента; 4 - экстракорпоральное хранение; 5 - продленное экстракорпоральное хранение в рамках эксперимента; 6 - различные временные точки, в которые проводилось замораживание образцов в лаборатории в рамках эксперимента; 7 - молекулярный анализ; t - время; t ₀ - начало операции; t ₁ - легирование сосуда; t ₂ - хирургическая резекция; t ₃ - заморозка образца сравнения; t ₄ - заморозка образца 1; t ₅ - заморозка образца 2; t ₆ - заморозка образца 3; t ₇ - заморозка образца 4; t ₈ - заморозка образца 5

Рисунок А.1 - Схема краткого обзора процедуры взятия ткани

А.2.2.3 Белковый анализ

Как референсные методы анализа количества отдельных белков и некоторых фосфорилированных белков применялись метод обращенно-фазового микроматричного анализа белков (RPPA) и вестерн-блоттинг. Использованные антитела приведены в таблице А.1.

Таблица А.1 - Антитела, использованные для анализа с использованием RPPA и вестерн-блоттинга

Белок (n = 23)	Вид лабораторного животного	Раствор
Phospho-PTEN (Ser380)	кр	1:500/5 % BSA/TBST
PTEN	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Phospho-Akt (Ser473)	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Akt	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
Phospho-GSK-3beta (Ser9)	кр	1:500/5 % BSA/TBST
GSK-3beta	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Phospho-p44/42 МАРК (Thr202/Tyr204)	кр	1:500/5 % BSA/TBST
p44/42 МАРК	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)	кр	1:500/5 % BSA/TBST
p38 МАРК	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Phospho-Stat3 (Ser727)	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
Stat3	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
Phospho-NF-kappaB p65 (Ser536)	кр	1:500/TBST
NF-kappaB p65	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
FAK	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
c-Fos	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Расщепляющая каспаза-3	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Е-кадгерин	мш	1:1000/5 % BSA/TBST
Egr-1	кр	1:1000/5 % BSA/TBST
HIF-1 альфа	кр	1:500/5 % BSA/TBST
Hsp70	кр	1:500/5 % BSA/TBST
-актин	мш	1:1000/5 % BSA/TBST
GAPDH	мш	1:1000/5 % BSA/TBST
Примечание - Расшифровка использованных аббревиатур: кр - кролик, мш - мышь, BSA - альбумин бычьей сыворотки, TBST - трис-буферный солевой раствор с 0,1 % полисорбата-20.

А.2.3 Результаты

Чтобы исследовать влияние длительности экстракорпорального хранения на белковые профили, образцы доброкачественных тканей человека (n = 11) были собраны во время плановых операций и доставлены в лабораторию патологии, где по их прибытии были начаты эксперименты с контролем временной динамики. После выделения белка было проведено количественное исследование стабильности выбранных белков с помощью противофазного белкового чипа (RPPA) с 23 специфическими антителами, семь из которых направлены против фосфорилированных эпитопов, а один распознает расщепленный белок. Белки были отобраны на основе их потенциального участия в критических клеточных функциях или сигнальных путях, таких как структура клетки, пролиферация и выживание, реакция на стресс, гипоксия, апоптоз и адгезия. Предполагается, что, проанализировав расщепление белка и посттрансляционные модификации (фосфорилирование), можно надежно определить потенциальные колебания уровней белка и фосфопротеина во время хранения.

X - время, мин; Y - относительная средняя степень выраженности

Рисунок А.2 - Анализ белков и фосфопротеинов во время отсроченного в рамках эксперимента экстракорпорального хранения

Рисунок А.2 показывает степень выраженности сигнала трех репрезентативных белков (phospho-p44/42-МАРК, GAPDH, -актина). Изображенные графики типа диаграмм размаха показывают среднюю нормированную выраженность сигнала и процент относительно образца сравнения (см. рисунок А.1, t ₃), который принят за 1,0.

Для phospho-p44/42-MAPK (р-р44/42-МАРК) выражены изменения количества фосфопротеина во время экстракорпорального хранения, тогда как количества GAPDH и -актина не сильно изменялись во временной динамике в эксперименте.

А.2.4 Дополнительный источник информации

, S., Hauck, S., Sarioglu, H. et al. Изменчивость уровней белка и фосфопротеина в клинических образцах ткани на преаналитическом этапе. Journal of Proteome Research. 2012 Dec 7; 11(12):5748-62.

www.spidia.eu