Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 15302-2019 "Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 октября 2021 г. N 1387-ст)

Animal and vegetable fats and oils. Determination of benzo[a]pyrene. Reverse-phase high performance liquid chromatography method

УДК 665.2/.3:543.544.5.068.7(083.74)(476)
МКС 67.200.10

Дата введения - 1 декабря 2021 г.
Взамен ГОСТ 32123-2013

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протокол от 30 сентября 2019 г. N 122-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Институт стандартизации Молдовы
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	KG	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 октября 2021 г. N 1387-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 15302-2019 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 декабря 2021 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 15302:2017 "Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания бенз(а)пирена. Метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Animal and vegetable fats and oils - Determination of benzo[a]pyrene - Reverse-phase high performance liquid chromatography method", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 11 "Животные и растительные жиры и масла" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Взамен ГОСТ 32123-2013

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания бенз(а)пирена в нерафинированных или рафинированных маслах и жирах с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с использованием флуориметрического детектирования в диапазоне от 0,1 до 50 мкг/кг.

Настоящий стандарт не распространяется на молоко и молочную продукцию (или молочный жир).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 661, Animal and vegetable fats and oils - Preparation of test sample (Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для испытания)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

Международная организация по стандартизации (ISO) и Международная электротехническая комиссия (IEC) ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации, доступ к которым можно получить по следующим адресам:

- электропедия IEC: http://www.electropedia.org/;

- платформа для онлайн-просмотра ISO: http://www.iso.org/obp.

3.1 содержание бенз(а)пирена (benzo[a]pyrene content): Массовая доля бенз(а)пирена в пробе для испытания, определенная методом, установленным в настоящем стандарте.

Примечание - Содержание бенз(а)пирена выражается в микрограммах на килограмм.

4 Сущность метода

Пробу для испытания растворяют в петролейном эфире и добавляют бенз(b)хризен в качестве внутреннего стандарта. Далее пробу очищают на колонке, заполненной оксидом алюминия, и элюируют бенз(а)пирен с помощью петролейного эфира.

5 Реактивы

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не указано иное. Если используют растворители, отличные от рекомендуемых, то проводят полный холостой анализ и записывают его результаты.

Предупреждение - Необходимо соблюдать действующие правила, регулирующие обращение с опасными веществами. Пользователи должны быть знакомы и должны соблюдать технику безопасности.

5.1 Вода бидистиллированная, прошедшая фильтрацию через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Допускается использование деионизированной воды, полученной с помощью систем очистки и деминерализации воды.

5.2 Петролейный эфир (диапазон температур кипения от 40 °С до 60 °С) или гексан, подвергнутый повторной перегонке над гранулами гидроксида калия (4 г/л).

5.3 Ацетонитрил, пригодный для ВЭЖХ.

5.4 Тетрагидрофуран, пригодный для ВЭЖХ.

5.5 Смесь ацетонитрила и тетрагидрофурана, приготовленная путем смешивания 90 мл ацетонитрила (см. 5.3) и 10 мл тетрагидрофурана (см. 5.4).

5.6 Толуол, пригодный для ВЭЖХ.

5.7 Сульфат натрия гранулированный безводный.

5.8 Оксид алюминия 4-й степени активности, приготовленный из нейтрального оксида алюминия с активностью выше 1-й степени ¹⁾, дезактивированного добавлением 10 мл воды (см. 5.1) к 90 г оксида алюминия.

Из-за существующих различий в активности оксида алюминия различных марок рекомендуется проверить, что процедура дезактивации подходит для полного извлечения бенз(а)пирена из стандартного образца.

Предостережение - Реакция дезактивации экзотермическая, и возможен рост давления.

Емкость встряхивают около 15 мин и дают содержимому отстояться в течение 24 ч. Оксид алюминия хранят в закрытой емкости при комнатной температуре.

5.9 Бенз(а)пирен ²⁾ чистотой 99,0 % по массе.

Предостережение - Бенз(а)пирен является канцерогеном. Для минимизации его вредного воздействия все работы необходимо проводить в вытяжном шкафу и в перчатках.

5.9.1 Основной раствор бенз(а)пирена в толуоле, 0,5 мг/мл.

В мерной колбе вместимостью 25 мл взвешивают около 12,5 мг бенз(а)пирена с точностью до 0,1 мг. Растворяют его в толуоле (см. 5.6) и объем доводят до метки этим же растворителем. Раствор хранят в темном месте при температуре 4 °С не более 6 мес.

5.9.2 Стандартные растворы бенз(а)пирена

Готовят два стандартных раствора, содержащие около 0,2 мкг/мл и 0,01 мкг/мл бенз(а)пирена, путем разбавления ацетонитрилом аликвот основного раствора бенз(а)пирена (см. 5.9.1).

5.10 Раствор бенз(b)хризена ³⁾, используемого в качестве внутреннего стандарта, в ацетонитриле.

Готовят основной раствор, содержащий около 10 нг/мкл вещества, с точностью до нанограмма. Для приготовления раствора внутреннего стандарта с концентрацией около 1 нг/мкл основной раствор разбавляют в мерной колбе в 10 раз.

Примечание - Раствор также можно приготовить путем растворения бенз(b)хризена с чистотой 99,0 % по массе в ацетонитриле.

6 Оборудование

Используют стандартное лабораторное оборудование, в том числе перечисленное ниже.

6.1 Стеклянная колонка для хроматографии длиной 300 мм и внутренним диаметром 15 мм, с фриттой и краном из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

6.2 Водяные бани: одна - поддерживающая температуру (35  2) °С, а другая - температуру (65  2) °С.

6.3 Может использоваться испаритель мгновенного испарения, ротационный испаритель с вакуумом и водяной баней, поддерживающей температуру 40 °С. Необходимо принять меры для предотвращения перекрестного загрязнения. В периоды между проведением определений систему подвергают тщательной очистке.

6.4 Высокоэффективный жидкостный хроматограф, состоящий из насоса для ВЭЖХ, инжектора с петлей объемом 50 мкл, колонки с обращенной фазой, электронного интегратора и регистрирующего устройства.

При использовании автодозатора петлю инжектора промывают ацетонитрилом между последовательными инъекциями.

6.5 Колонки для анализа ВЭЖХ

6.5.1 Защитная колонка с обращенной фазой, способная отделить бенз(а)пирен от совместно экстрагируемых веществ, вместе с подходящей предколонкой (например, предколонка из нержавеющей стали длиной 75 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом Lichrosorb RP-18 (размер частиц 5 мкм)) ⁴⁾.

6.5.2 Колонка для ВЭЖХ с обращенной фазой длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм (нержавеющая сталь) для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (например, Chromspher 5 РАН или Vydac 201 ТР5) ⁴⁾.

6.6 Флуоресцентный детектор с длиной волны эмиссии 406 нм (щель 10 нм) и длиной волны возбуждения 384 нм (щель 10 нм). Детектор должен обладать требуемой производительностью для проведения анализа.

6.7 Маленькие флаконы с горловиной под алюминиевый колпачок объемом около 1 мл, с прокладками из ПТФЭ и алюминиевыми колпачками.

6.8 Устройство ручное для обжатия колпачков на флаконах.

6.9 Одноразовые пипетки.

7 Отбор проб

В лабораторию следует направлять представительную пробу. Она не должна быть повреждена или изменена во время транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 5555 [1].

8 Подготовка проб

Подготовку анализируемой пробы осуществляют в соответствии с ISO 661.

9 Методика проведения испытания

9.1 Очистка пробы

9.1.1 В стеклянном химическом стакане взвешивают с точностью до 0,001 г около 0,400 г жира или масла и растворяют в 2 мл петролейного эфира (см. 5.2). С помощью микрошприца добавляют 20 мкл раствора внутреннего стандарта (см. 5.10), что эквивалентно 50 мкг/кг при пересчете на массу пробы. Если предположить, что содержание бенз(а)пирена в пробе будет высоким, добавляют 50 мкл раствора внутреннего стандарта (см. 5.10), что эквивалентно 125 мкг/кг при пересчете на массу пробы.

9.1.2 Колонку для хроматографии (см. 6.1) заполняют петролейным эфиром (см. 5.2) до половины ее высоты. Незамедлительно взвешивают 22 г оксида алюминия (см. 5.8) в небольшом химическом стакане и немедленно переносят его в колонку, после чего осторожно встряхивают колонку для усиления эффекта осаждения оксида алюминия.

9.1.3 Добавляют безводный сульфат натрия (см. 5.7) в верхнюю часть колонки для образования слоя толщиной около 30 мм.

9.1.4 Открывают кран и дают петролейному эфиру стечь до уровня верхней части слоя сульфата натрия.

9.1.5 Под колонкой помещают мерную колбу вместимостью 20 мл.

9.1.6 Вводят раствор жира или масла (см. 9.1.1) в колонку. Промывают колонку минимальным количеством петролейного эфира (см. 5.2), позволяя слою растворителя пройти сквозь слой сульфата натрия в период между промываниями.

9.1.7 Элюируют бенз(а)пирен из колонки петролейным эфиром со скоростью потока около 1 мл/мин, отбрасывая первые 20 мл элюата и собирая последующие 60 мл элюата в круглодонную колбу вместимостью 100 мл.

9.1.8 Выпаривают растворитель из элюата на водяной бане, установленной на 65 °С, до объема примерно 0,5-1,0 мл и переносят концентрированный раствор в маленький флакон с горловиной под алюминиевый колпачок (см. 6.7), предварительно взвешенный с точностью до 0,1 мг.

9.1.9 Продолжают выпаривание из маленького флакона на водяной бане (см. 6.2) при температуре 35 °С в слабом токе азота (около 25 мл/мин) до практически сухого состояния. Ополаскивают круглодонную колбу, используя около 1 мл петролейного эфира, и количественно переносят промывочную жидкость в маленький флакон, продолжая выпаривание в атмосфере азота. Ополаскивание повторяют и промывочную жидкость переносят в маленький флакон еще раз.

9.1.10 Продолжают выпаривание при температуре 35 °С в токе азота до полного высушивания.

9.1.11 Взвешивают маленький флакон с точностью до 0,1 мг и рассчитывают массу остатка. Маленький флакон закрывают прокладкой из ПТФЭ и укупоривают алюминиевым колпачком. Хранят при температуре 4 °С.

9.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

9.2.1 В качестве элюента используют смесь 880 мл ацетонитрила (см. 5.3) и 120 мл воды (см. 5.1). Для предотвращения гашения флуоресценции элюент дегазируют с целью удаления кислорода. Используют продувку гелием или установку вакуумной дегазации.

9.2.2 Элюируют со скоростью потока около 1 мл/мин.

9.2.3 Градуировочная кривая и определение относительного коэффициента чувствительности детектора: из стандартных растворов бенз(а)пирена (см. 5.9.2) готовят пять градуировочных растворов таким образом, чтобы вводимый объем 50 мкл каждого из них давал показания, соответствующие 0,01; 0,04; 0,2; 1,0 и 2,0 нг бенз(а)пирена. К полученным растворам добавляют 0,5 нг внутреннего стандарта. Строят градуировочную кривую из пяти точек, используя площади пиков, полученные интегратором и регистрирующим устройством при анализе пяти разведений стандартных растворов. Полученные данные используются также для расчета относительного коэффициента чувствительности детектора (см. 10.1) между бенз(а)пиреном и внутренним стандартом.

9.3 Анализ проб

9.3.1 В маленький флакон, содержащий очищенный остаток (см. 9.1.11), вводят 250 мкл смеси ацетонитрила и тетрагидрофурана (см. 5.5). Растворяют остаток, осторожно вращая маленький флакон и избегая контакта растворителя с прокладкой.

Градуировочная кривая (см. 9.2.3) позволяет определять содержание бенз(а)пирена в диапазоне от 0,1 до 50 мкг/кг. Если содержание бенз(а)пирена в растворенном остатке выше 10 мкг/кг (см. 9.3.2), его необходимо дополнительно разбавить смесью ацетонитрила и тетрагидрофурана (см. 5.5) или ввести в колонку для ВЭЖХ объем растворенного остатка меньше 50 мкл (см. 9.3.2).

9.3.2 Вводят точно известный объем (около 50 мкл) растворенного остатка в колонку для ВЭЖХ и начинают процесс хроматографии. Необходимо следить за тем, чтобы количество остатка, вводимого в хроматографическую колонку, не превысило 1,5 мг. Пример хроматограммы приведен на рисунке 1. При наличии большого количества остатка необходимо скорректировать количество тетрагидрофурана (см. 5.4) или повторить стадию очистки.

V - поглощение, мВ; t - время, мин; 1 - бенз(b)хризен; 2 - бенз(а)пирен; 3 - бенз(k)флуорантен

Рисунок 1 - Типичная хроматограмма

10 Представление результатов

10.1 Расчет относительного коэффициента чувствительности детектора

Используя полученные данные (см. 9.2.3), рассчитывают относительный коэффициент чувствительности детектора f _rr как среднее арифметическое значение пяти стандартных растворов, используя формулу (1):

,

(1)

где А _ВаР - площадь пика бенз(а)пирена;

A _is - площадь пика внутреннего стандарта;

- концентрация бенз(а)пирена, мкг/л;

- концентрация внутреннего стандарта, мкг/л.

10.2 Расчет содержания бенз(а)пирена

Содержание бенз(а)пирена w _BaP, мкг/кг, в анализируемой пробе рассчитывают, используя формулу (2):

,

(2)

где f _rr - относительный коэффициент чувствительности детектора, рассчитанный на основе стандартных растворов (см. 10.1);

m - масса пробы для испытания, г;

- концентрация внутреннего стандарта в элюате, в нг/л.

Содержание выражают как массовую долю в микрограммах на килограмм с точностью до одного десятичного знака для содержания бенз(а)пирена от 0 до 10 мкг/кг и до ближайшего целого числа для содержания бенз(а)пирена более 10 мкг/кг.

11 Прецизионность

11.1 Повторяемость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытания, которые были получены при применении одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткого промежутка времени, не должно превышать значений r, приведенных в таблице А.1, более чем в 5 % случаев.

11.2 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытания, которые были получены при применении одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, в разных лабораториях, разными операторами, использующими разное оборудование, не должно превышать значений R, приведенных в таблице А.1, более чем в 5 % случаев.

12 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) сведения об используемом методе отбора проб, если известно;

c) сведения об используемом методе испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) любые детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все особенности, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) информацию о полученном(ых) результате(ах);

f) если была проверена повторяемость, информацию о полученном окончательном результате.

------------------------------

¹⁾_{Оксид алюминия 90 активный, нейтральный является примером подходящей продукции, имеющейся в продаже. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не представляет собой рекламу данной продукции со стороны ISO. Использование аналогичной продукции допускается, если может быть доказано, что она обеспечивает получение тех же результатов.}

²⁾_{Соответствующий стандартный образец доступен в Объединенном исследовательском центре Европейской комиссии, Институте эталонных материалов и измерений (IRMM). Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не представляет собой рекламу данной продукции со стороны ISO. Использование аналогичной продукции допускается, если может быть доказано, что она обеспечивает получение тех же результатов.}

³⁾_{Соответствующий стандартный образец доступен в Объединенном исследовательском центре Европейской комиссии, Институте эталонных материалов и измерений (IRMM) или в Dr. Ehrenstorfer GmbH. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не представляет собой рекламу данной продукции со стороны ISO. Использование аналогичной продукции допускается, если может быть доказано, что она обеспечивает получение тех же результатов.}

⁴⁾_{Указаны примеры подходящей продукции, имеющейся в продаже. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не представляет собой рекламу данной продукции со стороны ISO. Использование аналогичной продукции допускается, если может быть доказано, что она обеспечивает получение тех же результатов.}

------------------------------

Библиография

[1]	ISO 5555	Animal and vegetable fats and oils - Sampling (Жиры и масла животные и растительные. Отбор проб)
[2]	ISO 5725-2	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения)

Ключевые слова: жиры и масла животные, жиры и масла растительные, содержание бенз(а)пирена, обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.