Приложение А (обязательное). Постановка оксидазного теста и определение грам-принадлежности для подтверждения наличия в пробе воды колиформных бактерий

Приложение А
(обязательное)

Постановка оксидазного теста и определение грам-принадлежности для подтверждения наличия в пробе воды колиформных бактерий

А.1 Оксидазный тест с тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлоридом

В качестве реактива для оксидазного теста используют тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид.

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями с питательной среды переносят на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченной реактивом тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлоридом для определения оксидазной активности. Оксидазный тест считают положительным, если в течение 1-4 мин появляется окрашивание колоний в фиолетово-коричневый цвет.

В случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий проводят пересев колоний на подтверждающие среды непосредственно с мембранного фильтра, расположенного на кружке фильтровальной бумаги с реактивом. Время пересева не ограничено.

А.2 Оксидазный тест с диметил-п-фенилендиамин дигидрохлоридом и -нафтолом

В качестве реактива для оксидазного теста используют диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид с -нафтолом.

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями с питательной среды переносят на кружок фильтровальной бумаги ненамного большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченной реактивом диметил-п-фенилендиамин дигидрохлоридом с -нафтолом для определения оксидазной активности. Оксидазный тест считают положительным, если появляется окрашивание колоний в синий цвет.

Допускается использовать готовые к употреблению диски СИБ-оксидаза, соблюдая сроки хранения.

После появления первых признаков положительного теста (окрашивание колоний в синий цвет), но не позднее чем через 4 мин, мембранный фильтр переносят обратно на питательную среду.

В случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий проводят пересев колоний на подтверждающие среды непосредственно с мембранного фильтра, расположенного на питательной среде.

Посев целесообразно проводить не сразу после определения оксидазной активности, а после выдерживания на питательной среде свыше 5 мин.

А.3 Постановка оксидазного теста способом посева штрихом

Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают двумя-тремя каплями одного из указанных выше реактивов для оксидазного теста. Если используют бумажные индикаторные системы (СИБ), то их смачивают дистиллированной водой.

С мембранных фильтров отбирают по три-четыре изолированные колонии каждого типа из числа характерных для колиформных бактерий и бактерий семейства Enterobacteriaceae колоний и наносят штрихом или бляшкой на подготовленную фильтровальную бумагу с помощью платиновой петли или стеклянной палочки.

Примечание - Металлическая петля из нихрома дает ложноположительную реакцию при работе с реактивом тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлоридом.

Оксидазный тест считают положительным, если в течение 1 мин появляется окрашивание в сине-фиолетовый цвет. Тест считают отрицательным, если цвет в месте нанесения культуры не изменяется.

При получении нечеткого результата колонии пересевают на питательный агар для получения изолированных колоний, посевы инкубируют при температуре (36  2) °С в течение 24-26 ч, а затем проводят повторное определение оксидазной активности.

А.4 Определение грам-принадлежности

На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды.

Вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла.

Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки.

На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на 0,5-1,0 мин, снимают бумагу.

Наливают раствор Люголя на 0,5-1,0 мин, сливают раствор Люголя.

Стекло промывают в этиловом спирте в течение 0,5-1,0 мин, пока не перестанет отходить краситель.

Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение 1-2 мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой.

После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют: грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску; грамположительные микроорганизмы окрашиваются в синий цвет.

Отношение бактерий к окраске по методу Грама допускается определять прибором для автоматического окрашивания мазков по Граму. Допускается использовать промышленные наборы для окраски.