Приложение А (справочное). Основные методы идентификации

Приложение А
(справочное)

Основные методы идентификации

А.1 Приготовление чистой культуры

А.1.1 Общие положения

Начинают приготовление чистой культуры с выбора колонии на или в агаризованной среде, которая была получена путем посева разведения пробы продукции для испытаний или путем посева культуры.

Затем высевают выбранную колонию на неселективную агаризованную питательную среду. После инкубации выбирают хорошо изолированную колонию. Повторяют операцию при необходимости.

Используют методы посева на чашки, описанные в А.1.2. В отдельных случаях могут использоваться другие методы.

А.1.2 Посев на чашки

А.1.2.1 Общие положения

Отбирают небольшое количество с поверхности хорошо изолированной колонии на кончик стерильной петли. Затем либо производят посев непосредственно клетками, присутствующими на петле (см. А.1.2.2), либо приготавливают суспензию из этих клеток (см. А.1.2.3).

А.1.2.2 Прямой метод: пример

Чашки с агаризованной средой приблизительно на одну треть поверхности засевают кончиком петли близко расположенными штрихами. Стерилизуют и охлаждают петлю. От края засеянной площади выполняют другой ряд штрихов, менее плотно расположенных, чем первый, занимая часть свободной площади. Повторяют операцию на оставшейся поверхности, делая штрихи еще более широкими (см. рисунок А.1).

Рисунок А.1 - Пример посева на чашку: прямой метод

А.1.2.3 Метод с использованием разведения

Суспендируют клетки в 1-2 см ³ выбранного разбавителя, проводя инокулированной петлей по стенкам пробирки у поверхности жидкости, затем хорошо перемешивают.

Стерилизуют и охлаждают петлю. С помощью петли отбирают небольшое количество микробной суспензии и продолжают согласно А.1.2.2.

А.1.3 Инкубация

Переворачивают засеянные чашки Петри вверх дном и помещают их в инкубатор на заданный период времени при заданной температуре.

А.1.4 Отбор колоний

После инкубации выбирают хорошо изолированную колонию из чашки либо для последующего пересева, либо для проведения испытаний.

Если возможно, окончательные испытания следует проводить, используя клетки одной единственной колонии. В случае недостатка клеточного материала от одной колонии сначала необходимо осуществить повторный посев в жидкую среду или на скошенную агаризованную среду, после чего субкультуру можно использовать для проведения испытаний.

А.2 Окраска по Граму [модифицированный метод Хакера]

А.2.1 Общие положения

Такое окрашивание бактериальных клеток позволяет описать морфологию клеток бактерий и классифицировать их на две группы, в зависимости от того, способны они удерживать фиолетовую окраску кристаллического фиолетового в условиях испытаний или нет. Такое деление обусловлено главным образом различиями в структуре клеточных стенок двух групп и коррелируется с другими существенными различиями между этими двумя группами. Существует ряд способов выполнения окраски по Граму, однако все они учитывают последовательность действий, приведенных ниже.

А.2.2 Растворы

А.2.2.1 Общие положения

Можно использовать имеющиеся в продаже растворы. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.

А.2.2.2 Раствор кристаллического фиолетового

А.2.2.2.1 Состав

- кристаллический фиолетовый - 2,0 г;

- этанол (95 %) - 20 см ³;

- оксалат аммония C ₂H ₈N ₂O ₄ - 0,8 г;

- вода - 80 см ³.

А.2.2.2.2 Приготовление

Растворяют кристаллический фиолетовый в этаноле и оксалат аммония в дистиллированной воде. Смешивают два раствора и дают отстояться смеси в течение 24 ч перед применением.

А.2.2.3 Раствор йода

А.2.2.3.1 Состав

- йод - 1,0 г;

- йодид калия KI - 2,0 г;

- вода - 100 см ³.

А.2.2.3.2 Приготовление

Растворяют йодид калия в 10 см ³ дистиллированной воды, добавляют йод частями. После растворения доводят объем раствора до 100 см ³ в мерной колбе.

А.2.2.4 Раствор сафранина

А.2.2.4.1 Состав

- сафранин О - 0,25 г;

- этанол (95 %) - 10 см ³;

- вода - 100 см ³.

А.2.2.4.2 Приготовление

Растворяют сафранин в этаноле, затем смешивают с дистиллированной водой. Доводят до конечного объема 100 см ³.

При использовании кристаллического фиолетового следует проверить стабильность раствора. Для проверки смешивают одну каплю раствора кристаллического фиолетового с одной каплей раствора йода на предметном стекле, чтобы проследить за химической реакцией. Если кристаллизация наблюдается на стекле, раствор кристаллического фиолетового не используют.

А.2.2.5 Метод окрашивания

Из культуры, выращенной в течение 18-24 ч, готовят мазок на предметном стекле и фиксируют его над пламенем спиртовки, затем на мазок наносят раствор кристаллического фиолетового (см. А.2.2.2) и дают прореагировать в течение 1 мин.

Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой в течение нескольких секунд.

Покрывают предметное стекло раствором йода (см. А.2.2.3). Дают ему прореагировать в течение 1 мин. Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой в течение нескольких секунд.

Осторожно и непрерывно промывают этанолом (95 %) мазок на предметном стекле в течение не более 30 с, до тех пор пока не исчезнет фиолетовый цвет.

Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой для удаления этанола.

Докрашивают мазок раствором сафранина (см. А.2.2.4) в течение 10 с.

Осторожно наклоняя, промывают предметное стекло водой.

Высушивают предметное стекло.

А.2.2.6 Интерпретация результатов

Исследуют предметное стекло под объективом микроскопа с большим увеличением (см. 5.13). Бактериальные клетки, которые окрасились в синий или фиолетовый цвет, относятся к грамположительным бактериям, а окрашенные в темно-розовый и красный - к грамотрицательным.

Для чистой культуры некоторых видов бактерий как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии могут быть получены в одном и том же поле зрения микроскопа.

Примечание - У плотно расположенных клеток может отмечаться нехарактерная реакция.

А.3 Тест на каталазу

А.3.1 Общие положения

Обнаружение данного фермента, который разлагает перекись водорода (Н ₂O ₂) на воду и кислород, может быть проведено с помощью бульонной культуры, культуры, выросшей на агаризованной среде или одной единственной колонии, взятой с поверхности агаризованной среды.

А.3.2 Из бульонной культуры

Добавляют к 1 см ³ бульонной культуры 0,5 см ³ десятикратно разбавленного по объему [с массовой долей 3 %] раствора перекиси водорода. Наблюдают появление пузырьков кислорода (каталазоположительные) или их отсутствие (каталазоотрицательные).

А.3.3 С поверхности агаризованной питательной среды

Наливают на культуру 1-2 см ³ десятикратно разбавленного по объему [с массовой долей 3 %] раствора перекиси водорода.

Наблюдают сразу же и по истечении 5 мин, образовались или не образовались пузырьки кислорода.

А.3.4 Из колонии

Наносят раздельно две капли десятикратно разбавленного по объему раствора перекиси водорода на предметное стекло.

Отбирают колонию с помощью стерильной стеклянной или пластиковой палочки (но только не металлической иглой) и осторожно эмульгируют ее в одной из этих двух капель. Наблюдают сразу же и через несколько минут (не ранее чем через 1 мин), образовались или не образовались пузырьки кислорода. В случае сомнения покрывают каждую каплю покровным стеклом и сравнивают появление пузырьков между двумя покрывными стеклами.

Наблюдение можно проводить визуально или с помощью микроскопа с малым увеличением.

А.4 Тест на оксидазу

А.4.1 Общее

Наличие оксидазы обнаруживают по изменению цвета соединения во время окисления под действием данного фермента.

А.4.2 Реактив

А.4.2.1 Состав

- N,N,N',N''-тетраметил-3-пара-фенилендиаминдигидрохлорид - 1,0 г;

- вода - 100 см ³.

А.4.2.2 Приготовление

Растворяют реактив в холодной воде. Готовят реактив непосредственно перед его использованием.

Можно использовать доступные, имеющиеся в продаже диски или полоски. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя.

А.4.2.3 Метод

Увлажняют фильтровальную бумагу реактивом. Берут часть бактериальной культуры с агаризованной среды с помощью платиновой иглы либо стеклянной или пластиковой палочки (никель-хромовая игла дает ложноположительный результат) и наносят ее на смоченную фильтровальную бумагу.

А.4.2.4 Интерпретация полученного результата

В случае наличия оксидазы появляется фиолетово-пурпурный цвет в течение 5-10 с. Если цвет не изменился в течение 10 с, тест рассматривается как отрицательный.

А.5 Использование биохимических тестов для идентификации

Для идентификации могут использоваться существующие в настоящее время биохимические тесты. Вместе с тем все имеющиеся в продаже тесты не обеспечивают одинаковый уровень достоверности. Их характеристики необходимо оценивать перед использованием, за исключением случаев, когда их пригодность подтверждена изготовителем и/или независимой организацией.