Приложение С (справочное). Использование ПЦР для оценки амплифицируемой ДНК из образцов FFPE

Приложение С
(справочное)

Использование ПЦР для оценки амплифицируемой ДНК из образцов FFPE

ДНК, извлеченная из фиксированных формалином тканей, фрагментирована и содержит повреждения, которые являются источниками артефактов ее последовательности. В частности, обширная фрагментация значительно уменьшает количество матриц, доступных для ПЦР-амплификации. Второй серьезной проблемой, связанной с ДНК FFPE, является появление артефактов последовательности, то есть видимых изменений последовательности, которых нет в исходном образце.

Фрагментация - распространенная форма повреждения ДНК, обнаруживаемая в тканях, фиксированных формалином. Было показано, что фрагментация ДНК в фиксированных формалином тканях растет с увеличением времени хранения и снижением рН формалина, используемого для фиксации тканей [37]. Таким образом, одно и то же количество ДНК FFPE из разных образцов может содержать существенно различающееся количество амплифицируемых матриц в зависимости от степени повреждения.

Индуцированные формальдегидом сшивки ДНК снижают стабильность двухцепочечной ДНК, что приводит к частичной денатурации ДНК. Формальдегид легко окисляется до муравьиной кислоты в реакции с кислородом воздуха. Образование муравьиной кислоты снижает рН формалина. Таким образом, для поддержания нейтрального уровня рН в формалин следует добавить буферный раствор. N-гликозидные связи пуриновых оснований и сахаров подвержены гидролизу при низком рН, что способствует образованию лишенных оснований (abasic) участков ДНК.

Среди артефактов последовательности, обнаруженных в ДНК FFPE, переходные варианты C:G > Т:А являются наиболее частым типом однонуклеотидной вариации SNV. Артефакты последовательности чаще обнаруживают при тестировании ДНК FFPE с низким количеством копий, как правило, при использовании протоколов на основе амплификации. Варианты артефактов C:G > Т:А могут быть заметно снижены после обработки ДНК в парафине УДГ перед ПЦР-амплификацией, что свидетельствует о повреждении урацила как одного из основных источников артефактов C:G > Т:А вариантов в ДНК в парафине. Высокий уровень артефактов C:G > Т:А SNVs, найденных в сайтах метилирования CpG ДНК из парафина, убедительно указывает на дезаминирование оснований 5-метилцистозина.

Качество ДНК FFPE для ДНК-анализа может быть оценено с помощью ПЦР-реакции с наборами праймеров, которые производят короткие и длинные фрагменты (100, 200, 300 и 400 пар нуклеотид) из неперекрывающихся целевых сайтов в конкретном гене, таком как GAPDH. Образцы могут быть классифицированы на основе наибольшего из возможных обнаруженных продуктов ПЦР, а именно 100, 200, 300 и 400 пар нуклеотид.

Минимизация артефактов последовательности имеет решающее значение для точного обнаружения активных мутаций в фиксированных формалином тканях. Предлагаемые стратегии минимизации артефактов последовательности обобщены в таблице С.1 [38].

Таблица С.1 - Стратегии минимизации артефактов последовательностей ДНК FFPE

Шаг	Стратегия
Выделение ДНК	Оценка чистоты опухоли и выявление патологоанатомом участков, обогащенных опухолью. Макродиссекция или вырезание сердцевины из обогащенных опухолью участков. Использование достаточного количества ткани, когда это возможно, чтобы гарантировать выделение достаточного количества ДНК для последующего молекулярного тестирования. Термическая обработка для удаления индуцированных формальдегидом сшивок и облегчения последующего переваривания тканей протеиназой. Расширенная обработка протеиназой К для переваривания тканей и удаления белков, сшитых с ДНК
Оценка ДНК	Оценка количества двухцепочечной ДНК с помощью флуориметрии. Количественная оценка амплифицируемых шаблонов с использованием количественной qРНК или цифровой ПЦР, особенно для массивного параллельного секвенирования. Используют размеры ампликонов, соответствующие среднему размеру ампликонов в анализе секвенированием
Подготовка библиотеки образцов	Удаление урацила in vitro перед ПЦР-амплификацией ДНК FFPE. Использование анализов, генерирующих короткие ампликоны, для увеличения количества матриц для ПЦР. Обогащение цели на основе захвата таргетной ДНК, узнаваемой по уникальным последовательностям начальных и конечных сайтов. Использование праймеров, специфичных для каждой нити ДНК-матрицы, в подходе обогащения мишеней на основе амплификации. Молекулярная маркировка ДНК-матриц для идентификации артефактов последовательности
ПЦР-амплификация	Использование специфических ДНК-полимераз (например, Pfu и KAPA), которые имеют низкую эффективность обхода повреждений ДНК, таких как урацил и участки, лишенные оснований. Использование высокоточной ДНК-полимеразы для уменьшения ошибок полимеразы
Валидация вариантов последовательностей из МП на основе ампликона	Запуск каждого теста в двух повторностях для использования отдельных пулов матриц. Применение ортогональных (статистически независимых) методов для клинически значимых мутаций