Приложение D (обязательное). Метод имплантации в ткань головного мозга

Приложение D
(обязательное)

Метод
имплантации в ткань головного мозга

D.1 Область применения

Данный метод исследования применяют для оценки биологической реакции ткани головного мозга на имплантированный биоматериал. Место имплантации в головном мозге выбирают в зависимости от конечного применения биоматериала.

Биоматериал для нейроинтервенционного МИ, находящийся в контакте со стенкой сосуда, а не с нервной тканью непосредственно, предварительно оценивают в соответствии с ISO 10993-4.

Пример - Электрод, имплантированный в головной мозг, шунты для коррекции гидроцефалии и дренирования.

D.2 Сущность метода

Имплантат помещают в ткань головного мозга лабораторного животного. Биологическую реакцию на имплантированные исследуемые образцы сравнивают с биологической реакцией на имплантируемые контрольные образцы. Контрольными образцами являются материалы, применяемые в МИ, клиническая применимость и характеристики биосовместимости которых установлены.

D.3 Требования к образцам

D.3.1 Общие положения

Общие требования к подготовке исследуемых и контрольных образцов установлены в 4.2.

Нерезорбируемый (биостабильный) контрольный образец следует оценивать в каждой временной точке. Допускается использовать одну временную контрольную точку при наличии документально оформленного приемлемого обоснования, содержащего:

- сведения о контрольном образце;

- сведения о продолжительности наблюдений после имплантации;

- информацию о моделях на экспериментальных животных;

- протокол исследования;

- имеющиеся данные о контрольном образце.

Если предполагается, что исследуемый образец вызовет более чем минимальный ответ, то может быть выбран альтернативный контроль с приемлемым ответом. Выбор контрольного образца для сравнения должен быть обоснован с учетом свойств материала и его клинического применения.

D.3.2 Размеры и форма образца

Размеры образца зависят от вида животного и выбранного участка имплантации. Для метода имплантации, установленного в настоящем приложении, рекомендуется использовать крыс и кроликов.

Размеры образцов для имплантации на паренхимную поверхность:

- размеры образцов стержне- или клиновидной формы - диаметр/срез 1 мм х 1 мм или менее, длина от 2 до 6 мм;

- диаметр образца в форме диска - 8 мм.

Толщину образца в форме диска выбирают в зависимости от клинического применения биоматериала, данный выбор должен быть обоснован и задокументирован. Образцы биоматериалов, предназначенных для использования в составе МИ в контакте преимущественно с паренхиматозной тканью, имплантируют на ее поверхность.

D.4 Лабораторные животные и место имплантации

D.4.1 Лабораторные животные

В настоящем стандарте установлен метод имплантации образцов крысам и кроликам. Если из-за характеристик исследуемого образца требуется использовать другой вид животных, то в методику исследования вносят соответствующие изменения. Для исследования применяют животных обоих полов в равном численном соотношении, если не предоставлено достаточное обоснование для использования животных одного пола.

Следует использовать здоровых животных, не подвергавшихся ранее исследовательским процедурам. Вид и возраст животных являются существенными факторами, так как существуют различия в нейрофизиологии и биологической реакции, и данный фактор должен быть учтен до начала процедуры имплантации.

D.4.2 Место имплантации

Для каждой временной точки должно быть определено не менее 8 участков имплантации и 8 участков отрицательного контроля (разделенные поровну между самцами и самками), что позволит оценить местное нейральное действие. Исследуемые и контрольные образцы имплантируют животным в эквивалентные анатомические участки. Участок имплантации следует выбирать так, чтобы минимизировать риск механической травмы при хирургическом вмешательстве. Для имплантации используют только одно полушарие головного мозга у каждого животного и только один вид образца, исследуемый или контрольный. У каждой крысы для имплантации выбирают один участок на полушарии, у каждого кролика - два участка.

При имплантации в костную, мышечную и подкожную ткани исследуемый и контрольный образцы, как правило, вводят одному животному. При имплантации образца в нервные ткани, их ответные реакции не всегда локализованы и могут распространиться на широкую область, в том числе проявиться во всем полушарии головного мозга. В моделях на лабораторных животных при травме головного мозга может быть индуцирована миграция микроглии через миелиновые оболочки мозолистого тела к противоположному полушарию. Таким образом, микроглия, активированная имплантированным образцом, способна мигрировать через мозолистое тело и влиять на биологическую реакцию на противоположной стороне. Это может повлиять на обострение реакции на участке, в который имплантирован отрицательный контроль, и привести к ошибке в базовом ответе. Также, влияние травмы противоположного полушария может обострить реакцию на травму в участке, в который имплантирован исследуемый образец. В первом случае нормальный базовый ответ сдвигается на материал отрицательного контроля, что приведет к ложноотрицательному результату для исследуемого образца. Во втором случае реакция, происходящая в противоположном полушарии, может обострить реакцию на исследуемый образец, что приводит к ложноположительному результату. Учитывая, что для исследования применяют небольшое число животных, следует контролировать указанные факторы и снизить вариативность результатов. В данном методе имплантации следует применять отдельных животных для введения контрольных и исследуемых образцов. Выявленные межполовые различия в реакциях у животных должны быть учтены при оценке ответа на имплантированные образцы (см. [43] - [45]). Для контроля потенциальной вариативности результатов из-за межполовых различий животных в исследованиях следует использовать одинаковые количества самцов и самок каждого вида и линии.

D.5 Процедура имплантации

Каждое животное взвешивают перед имплантацией и периодически после нее через заданные интервалы времени. После обезболивания и анестезии, выполненных соответствующим способом, хирургически подготавливают череп животного. Стабильность обезболивания и анестезии следует поддерживать во время всей процедуры хирургического вмешательства и в течение некоторого времени после имплантации.

Животные должны быть надлежащим образом обездвижены во время процедуры хирургического вмешательства. Используя асептические хирургические методики, обнажают череп и в черепной коробке проделывают отверстия размерами, достаточными для введения образцов. Дополнительно готовят небольшие отверстия в твердой мозговой оболочке, затем образцы осторожно помещают в надлежащую часть головного мозга.

Следует учитывать, что методика хирургического вмешательства серьезно влияет на результат любой процедуры имплантации в ткань головного мозга, так как степень ответной реакции на травму (как глиальной, так и нейрональной) связана с уровнем физической травмы, что может привести к получению недостоверных результатов исследования (см. [45], [46] и [48]).

Рекомендуется применять для введения образцов животным стереотактические методы, обеспечивающие надлежащий контроль правильности размещения образцов и сведения к минимуму физического ущерба в месте пункции. Допускается применять другие методы введения образцов с обездвижением животных.

D.6 Продолжительность наблюдений после имплантации

Для объективной характеристики биологической реакции продолжительность наблюдений после имплантации должна составлять не менее одной недели. Допускается проводить наблюдения в другие подходящие временные интервалы. Следует учитывать, что нейродегенеративные процессы могут быть быстрыми и транзиторными, так как гибель клеток может произойти в первые несколько суток после введения, как выявлено при имплантации некоторых химических веществ (см. [45]).

Допускается увеличивать продолжительность наблюдений после имплантации с учетом клинического применения исследуемого биоматериала.

D.7 Требования к наблюдениям после имплантации

Животные должны быть размещены индивидуально. Животных наблюдают дважды в день, контролируя надлежащее заживление участков имплантации, возвращение к нормальному режиму питания и питья и выявляя какие-либо аномальные клинические признаки результатов хирургического вмешательства. Частоту наблюдения корректируют, основываясь на первоначальных наблюдениях. Если животным вводят антибиотики, то это должно быть задокументировано, так как некоторые соединения, например миноциклин, могут непосредственно модулировать реакцию микроглии мозга и макрофагов (см. [49]).

Повреждение тканей головного мозга может привести к аномальному поведению животного, поэтому клинические наблюдения включают в оценку местного действия образцов на головной мозг.

Для контроля общего состояния здоровья каждого животного следует проводить его тщательный (еженедельный) физический осмотр. Наблюдения регистрируют и включают все аномальные клинические признаки, аномальное поведение животного или общие клинические проявления действия образца, или результаты его действия на центральную нервную систему. Дополнительно, при оценке расстройств центральной нервной системы используют системы стандартных тестов поведенческого фенотипирования (FOB) или модифицированный тест Ирвина. Аномальными клиническими признаками являются: изменения кожи, шерсти, глаз или слизистых, выделения и экскреция или другие свидетельства вегетативной деятельности [например, слезоотделение, пилоэрекция (эффект "гусиная кожа"), размер зрачка, необычный тип дыхания]. Допускается наличие у животного других аномальных клинических признаков. Дополнительные изменения в движениях животного, его осанке, реакции на оклик, а также наличие у животного клонических или тонических судорог, навязчивого поведения (например, избыточная чистка, повторяющееся кружение) или странного поведения (например, самоповреждается, пятится) регистрируют. Для поведенческих и нейрологических признаков следует зарегистрировать время первого наблюдения и последующую прогрессию или разрешение. После первоначального обнаружения у животного аномального поведения, нейрологических признаков, изменения двигательной активности, осанки или рефлексов следует установить ежедневный режим наблюдений за соответствующими признаками.

Конечные точки для раннего вывода животного из исследования должны быть установлены до начала исследования. Как только выявлены серьезные аномалии клинических признаков, следует провести консультации с лечащим или квалифицированным ветеринаром, специализирующимся на лабораторных животных, или персоналом, компетентным в идентификации клинических повреждений, для клинического осмотра. Лечащий или квалифицированный ветеринар, специализирующийся на лабораторных животных, должен определить, необходимо ли удалить лабораторных животных из исследования с применением эвтаназии.

D.8 Оценка биологической реакции

Биологическую реакцию оценивают в соответствии с требованиями, установленными в 5.5.

Все изменения, выявленные при макроскопическом анализе, далее оценивают с применением микроскопического анализа. Рекомендуется применять фиксацию образца для уменьшения его погружения в объем ткани.

Кроме того, шейный (дренирующий) лимфатический (лимфатические) узел (узлы) должен (должны) быть исследован(ы) микроскопически.

Дополнительно цервикальный (дренирующий) лимфатический узел или узлы анализируют визуально с применением микроскопа. Осматривают ткани головного мозга животных с контрольными и исследуемыми образцами. Дополнительно ткани животных, погибших преждевременно или умерщвленных во время исследования, анализируют визуально, какие-либо повреждения анализируют с применением микроскопа.

Выполняют нейропатологическую оценку ткани на выявление наличия глиоза и нейродегенерации, используя надлежащие гистологические красители и/или биохимические индикаторы повреждений. Применение конкретного красителя/индикатора повреждений должно быть задокументировано и обосновано соответствующими ссылками на рецензированные источники, описывающие красители, используемые для оценки нейродегенерации или глиоза. Примеры красителей и биомаркеров, рекомендуемых к использованию для оценки биологического действия имплантированного образца на ткани головного мозга, приведены в таблице D.1 (см. [50]).

Таблица D.1 - Примеры биомаркеров и красителей

Краситель или биомаркер	Оцениваемый тип клеток или клеточный компонент
Гематоксилин и эозин (Н&Е)	Все ткани центральной нервной системы и лимфатических узлов
Флуоронефритный	Дегенерация нейронов
Аутофлуоресценция	Нейродегенерация
Антитело антиглиального фибриллярного кислого белка (GFAP)	GFAP (биомаркер астроцитов)
Антитело Anti-iba-1	Молекула 1 связующего адаптера ионизированного кальция (специфична к микроглии)
Люксол прочный синий	Миелин
Амино медно-серебряный краситель	Дегенерация нейронов

Не существует специфичных антител для всех видов животных.

Рекомендуется получить изображения участков имплантации с высоким разрешением, подтверждающие диагноз патолога или результат количественного анализа, демонстрирующие морфологические особенности клеточного ответа, специфичного для образца.

Специфичные клеточные субпопуляции должны быть распознаваемыми. Изображения должны включать масштабный отрезок с указанием увеличения.

Определяют клеточный критерий и характеристики, используемые для распознавания воспаления, результаты представляют качественно и количественно. Пример системы оценки воспалительных изменений в нервной ткани приведен в таблице Е.4

Клеточный критерий - основной тип или типы клеток или структур, задействованных в биологической реакции, такие как астроциты, нейтрофилы, клетки микроглии, фиброзы и миелин. Определяют характеристики морфологического ответа микроглии и астроцитов, такие как обеспечение транспорта веществ, гипертрофия, снижение рамификации в прогрессии амебоидной морфологии для идентификации стадии реакции микроглии. Определяют наличие макрофагоподобных клеток. По показаниям применяют клеточно-специфичное окрашивание.

Следует обратить внимание на следующие особенности тканей, окружающих образец:

a) нарушение нейрональных процессов вокруг образца;

b) зона астроцитоза и соединительной ткани вокруг образца;

c) увеличение числа крупных кровеносных сосудов;

d) инфильтрирующие лимфоциты;

e) активация микроглии - по особенности организации;

f) формирование капсулы, наличие гигантских клеток и макрофагов;

g) области минерализации/кальцификации;

h) изменения в эпендимальном слое и вышеуказанные изменения в арахноидальных грануляциях.

Рекомендуется дополнительно выполнить осмотр тканей головного мозга, прилегающих к месту введения образца (приблизительно 3 мм, ипсилатерально), и тканей головного мозга вдали от пути ввода имплантата. Характеристики ткани головного мозга, прилегающей к пути ввода образца:

- воспалительные клетки/инфильтраты;

- геморрагия;

- некроз;

- глиоз, серое вещество;

- глиоз, белое вещество;

- другое.

К характеристикам ткани головного мозга вдали от пути ввода образца относят другие нелокальные эффекты для каждого животного.

D.9 Отчет об исследовании

В отчет об исследовании включают полученные результаты и информацию в соответствии с разделом 6 и следующие дополнительные сведения:

- изображения с высоким разрешением, характеризующие ткани, окружающие участок имплантации;

- подробное описание каждого участка имплантации;

- результаты полуколичественной оценки.