Приложение Д (обязательное). Методы лабораторных исследований материалов, поврежденных микробиодеструкторами

Приложение Д
(обязательное)

Методы
лабораторных исследований материалов, поврежденных микробиодеструкторами

Д.1 Методы проведения микологического анализа

Д.1.1 Состав питательных сред для микологического анализа

Д.1.1.1 Картофельно-глюкозный агар (г/л): картофель - 200,0; глюкоза - 20,0; агар-агар - 20,0; вода дистиллированная.

Д.1.1.2 Среда Чапека-Докса с агаром (г/л): КН ₂РО ₄ - 0,7; К ₂НРО ₄ - 0,3; - 0,5; NaNO ₃ - 2,0; KCl - 0,5; - 0,01 г; сахароза - 30,0, вода дистиллированная.

Д.1.1.3 Среда Сусло-агар: неохмеленное пивное сусло (5-6 градусов по Баллингу) - 1 л; агар-агар - 20,0 г.

Д.1.1.4 Среда Сабуро (г/л): глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 20,0; вода дистиллированная.

Д.1.2 Способы выделения грибов в культуру с поверхности образца

Д.1.2.1 Способ рассева крошек и мелких фрагментов отобранного поврежденного материала (далее - субстрата) на поверхность питательной среды

Перед рассевом материал следует растереть в керамической ступке, после чего равномерно распределить мелкие частицы (1-3 мм) по поверхности питательной среды, подготовленной согласно Г.1.1.

Для сыпучих материалов процедура растирания не обязательна.

Д.1.2.2 Способ смыва с поверхности субстрата

Способ смыва с поверхности субстрата применяют для выявления микроорганизмов, часто развивающихся за счет поверхностного загрязнения материала. Материал желательно измельчить. Необходимо перенести 1 г материала в 10 мл стерильного 0,001 % раствора Твина-80 в дистиллированной воде. Полученную суспензию следует размешивать в течение 1 ч при комнатной температуре для отделения клеток микроорганизмов от материала. Равномерно распределяют 40 мкл суспензии по поверхности твердой питательной среды в чашках Петри (следует использовать среды, указанные в Г.1.1). Чашки выдерживают в термостате при температуре 25 °С - 28 °С. Осуществляют ежедневное наблюдение и фиксируют появление колоний микроорганизмов. По мере развития колоний осуществляют их пересев для последующей идентификации.

Д.1.2.3 Способ избирательного выделения микромицетов на питательную среду с помощью инъекционной иглы

Просматривая материал под бинокулярной лупой при увеличениях от 20 до 80 раз или при малом увеличении светового микроскопа, осуществляют прямой перенос мицелия или мелких колоний микромицетов стерильной инъекционной иглой на питательную среду. Такой способ выделения позволяет получать культуры медленнорастущих (микроколониальных) грибов.

Д.1.2.4 Предварительная активация (возобновление развития) микромицетов во влажных камерах с последующим переносом на питательную среду развивающихся зачатков грибов

Данный способ обеспечивает возобновление развития микромицетов, что существенно облегчает их перенос на питательную среду. Однако при использовании данного способа стимулируется развитие сопутствующих бактерий, загрязняющих получаемые культуры микромицетов. Для предотвращения подобного загрязнения при первом выделении микромицетов в культуру в состав питательных сред целесообразно включать антибиотики (например, стрептомицин, окситетрациклин или актидион) из расчета 3 мг на 1 литр проавтоклавированной и охлажденной до 45 °С - 50 °С среды.

Д.1.2.5 Перенос выявленных на бакпечатках (отпечатках с поверхности субстрата) структур грибов осуществляют на питательную среду.

Д.1.3 Количественный метод

Д.1.3.1 К 1 г измельченного исследуемого материала добавляют 100 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и 1 мл полученной суспензии равномерно распределяют по поверхности агаризованной питательной среды с помощью микробиологического шпателя.

Д.1.3.2 Засеянные чашки Петри выдерживают в термостате при температуре 25 °С - 28 °С до появления колоний.

Д.1.3.3 Проводят подсчет колоний на поверхности среды. Рассчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г субстрата.

Д.1.4 Методы идентификации

Д.1.4.1 Образовавшиеся колонии грибов при первичной изоляции пересевают на стандартные питательные среды, подготовленные согласно Г.3.1, в стерильных условиях, используя микробиологическую петлю.

Д.1.4.2 Культивирование посевов проводят в термостате при температуре 25 °С - 28 °С до получения развитых колоний с характерными морфологическими признаками и зрелым спороношением.

Д.1.4.3 Для идентификации просматривают выросшие колонии в световом микроскопе. Препараты для световой микроскопии готовят в капле воды (временные препараты) или используя консервирующую жидкость - лактофенол (постоянные препараты). Идентификацию до вида по морфолого-культуральным признакам проводят с использованием стандартных отечественных и зарубежных определителей.

Д.1.4.4 Для идентификации медленнорастущих микромицетов применяют специальную методику культивирования грибов на агаровых блоках, помещенных между покровными и предметными стеклами.

Д.1.4.5 В специальных лабораториях возможно применение молекулярно-генетических методов идентификации отдельных штаммов микромицетов. Эта процедура включает несколько этапов и требует специального дорогостоящего оборудования. Для проведения такого анализа в специализированную лабораторию передаются чистые культуры штаммов микромицетов, отобранных для идентификации.

Д.2 Методы проведения бактериологического анализа

Д.2.1 При проведении бактериологического анализа должны быть использованы два взаимодополняющих метода: количественный и качественный. При этом устанавливают принадлежность бактерий к определенным группам, а также оценивают их содержание в 1 г исследуемого материала прямым высевом на твердую питательную среду или методом наиболее вероятных чисел (НВЧ) при высеве в специфические жидкие накопительные среды. Результат выражают в КОЕ/г для прямого высева и кл/г - для метода НВЧ.

Д.2.2 Метод разведений

Навеску образца (1 г) измельчают в стерильной ступке и переносят во флакон с 10 мл стерильного физиологического раствора (или стерильной дистиллированной воды). Флакон тщательно встряхивают не менее 15 мин. Из суспензии готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 10 ^-1 до 10 ^-4, из которых осуществляется посев на рекомендованные питательные среды.

Д.2.3 Определение общего количества бактерий

Под общим количеством бактерий, как правило, подразумевают количество органотрофных бактерий, которые способны расти на готовом коммерческом питательном агаре, изготавливаемом из гидролизата рыбной муки (агар питательный сухой).

В пустые стерильные чашки Петри в двухкратной повторности вносят по 1 мл исходной суспензии и разведений 10 ^-1 - 10 ^-4. В каждую чашку вливают по 8-12 мл расплавленного и остуженного до 45 °С питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя суспензию бактерий в питательной среде. После застывания среды чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 25 °С - 28 °С в течение 3-5 сут. Подсчитывают только колонии бактерий, не включая в общее число колонии плесневых грибов. Результат усредняют и пересчитывают на 1 г исследуемого материала.

Д.2.4 Определение нитрифицирующих бактерий

Для определения нитрифицирующих бактерий используют среду Виноградского следующего состава (г/л): (NH ₄) ₂SO ₄ - 2,0; К ₂НРO ₄ - 1,0; - 0,4; - 0,4; NaCl - 2,0; стерильная вода - 1 л. Среду разливают в колбы по 15 мл. Толщина слоя среды не должна быть более 1,0-1,5 см. В каждую колбу вносят на кончике шпателя небольшое количество мела. Посев проводят в объеме по 1 мл из исходной суспензии и ее разведений 10 ^-1; 10 ^-2; 10 ^-3 в трехкратной повторности. Инкубацию посевов проводят при 28 °С - 30 °С три недели. Присутствие нитрифицирующих бактерий устанавливают по появлению нитратов.

Выявление нитратов проводят с помощью дифениламина. Для этого 2 г дифениламина растворяют в 100 мл концентрированной серной кислоты, затем добавляют 20 мл воды. К одной капле культуры, нанесенной на белую керамическую пластину, добавляют каплю реактива. Присутствие нитратов вызывает появление интенсивного синего окрашивания. Содержание нитрифицирующих бактерий определяют как наиболее вероятное число (кл/г исследуемого материала) по статистическим таблицам Мак-Креди.

Д.2.5 Определение железобактерий

Для определения железобактерий используют среду Хариссона: Раствор 1 (г/л): (NH ₄) ₂SO ₄ - 2,0; KCl - 0,1; К ₂РO ₄ - 0,25; - 0,25; Са (NO ₃) ₂ - 0,01; вода дистиллированная; рН 2,0 - 4,0. Раствор 2 (г/л): агароза - 8,0; вода дистиллированная. Раствор 3 (г/л): - 40,0; вода дистиллированная. Готовят смесь расплавленной агарозы и раствора 1 в соответствии 1:1, охлаждают до 45 °С, вносят раствор 3 в конечной концентрации 1 % FeSO ₄ и разливают среду в чашки Петри, которые хранят при температуре 10 °С. Посевной материал (по 0,1 мл нативной суспензии и ее разведений до 10 ^-2) вносят в 0,3 % агарозу (60 мг агарозы вносят в 10 мл воды, стерилизуют и смешивают с 10 мл стерильного раствора 1, вносят 0,5 мл раствора 3, подогретого до 45 °С) и заливают на чашки вторым слоем. Посевы инкубируют одну - четыре недели. Подсчитывают колонии железобактерий ярко-оранжевого или желтого цвета. Результат выражают как количество КОЕ железобактерий в 1 г исходного материала.

Д.2.6 Определение тиобацилл и сульфатредуцирующих бактерий

Для определения тиобацилл используют среду Бейеринка (г/л): Na ₂SO ₄ - 5,0; NH ₄Cl - 0,1; NaHCO ₃ - 1,0; - 2,0; - 0,1; - следы; стерильная вода. Тиосульфат и бикарбонат стерилизуют по отдельности, растворив в небольшом количестве воды, и после охлаждения добавляют в раствор остальных солей вместе с FeSO ₄. рН среды 9,2-9,4. Исходную суспензию и ее разведения до 10 ^-4 засевают в готовую среду в трех повторностях. При наличии тионовых бактерий в посевном материале среда мутнеет через два - четыре дня, и на ее поверхности появляется пленка молекулярной серы, которая образуется при окислении тиосульфата. Содержание тиобацилл определяют в виде наиболее вероятного числа (кл/г исследуемого материала) по таблицам Мак-Креди.

Для определения сульфатредуцирующих бактерий используют среду Постгейта "В" с осадком, так как первоначальное развитие бактерий происходит в осадке. Среда Постгейта "В" (г/л): NaCl - 1; К ₂НРO ₄ - 0,5; NH ₄Cl - 1,0; - 1,0; - 2,0; лактат натрия (70 %) - 3,5; дрожжевой экстракт - 1,0; аскорбиновая кислота - 1,0; тиогликолевая кислота - 1,0; - 0,5; вода дистиллированная. Аскорбиновую и тиогликолевую кислоту в виде 5 %-ных стерильных растворов и сернокислое железо в 1 %-ной соляной кислоте добавляют в питательную среду непосредственно перед засевом. Реакцию среды доводят до рН 7,5, нейтрализуя 5 %-ным раствором соляной кислоты или углекислого натрия. Среда должна иметь низкий окислительно-восстановительный потенциал, который в самом начале культивирования создается добавлением восстановителя, например сульфида натрия, в концентрации 1 мМ. Культуры накопления лучше всего ставить в склянках на 30-60 мл со стеклянными пробками, которые смазываются перед автоклавированием силиконовой смазкой. Заражение (инокуляцию) проводят 0,1-1 г материала. Склянка наполняется средой так, чтобы после заражения под пробкой не оставалось пузырьков воздуха. Содержание сульфатредуцирующих бактерий определяют в виде наиболее вероятного числа (кл/г исследуемого материала) по таблицам Мак-Креди.

Д.2.7 В отдельных случаях целесообразно проводить изучение микроорганизмов на поверхности поврежденного материала методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Высокие увеличения и хорошее разрешение, достигаемые при использовании данного метода, делают возможным изучение биодеструкторов прямо на поверхности разрушающегося материала. Образцы поврежденного материала, минимальным размером 0,5 на 0,5 см и максимальным размером 1,0 на 1,0 см, первоначально необходимо исследовать под бинокулярной лупой. Критерием отбора участков материала для СЭм-анализа служит наличие разнообразных биологических структур на его поверхности. Отобранные образцы целесообразно выдержать во влажной камере в течение 24 ч с целью активации микроорганизмов, после чего материал фиксируют и анализируют в сканирующем электронном микроскопе в диапазоне увеличений от 100 крат до 10 000 крат.

Д.3 Метод анализа проб воздушной среды

Отбор проб осуществляют с помощью сертифицированного пробоотборника ПУ-1Б, обеспечивающего осаждение на питательную среду клеток микроорганизмов из определенного объема воздуха. При отсутствии прибора допускается использовать метод осаждения микроорганизмов из воздуха на питательные среды в стандартные чашки Петри (время экспозиции - 1 ч). Для первичного отбора проб воздуха следует использовать среду Сабуро и среду Чапека-Докса.

Число спор в 1 м ³ воздуха X вычисляют по формуле

,

(Д.1)

где А - число колоний на чашке Петри;

r - радиус чашки Петри;

Т - время экспозиции.

Инкубацию чашек осуществляют так же, как и при выделении грибов из субстрата (Г.1.3.2). Колонии, как правило, подсчитывают на 7-9 сут культивирования. Идентификацию грибов осуществляют в соответствии с Г.1.4.