Приложение 3. Положение о лабораторной диагностике ВИЧ

Приложение 3
к приказу
Департамента здравоохранения
Ивановской области
от 01.12.2010 N 393

Положение
о лабораторной диагностике ВИЧ

Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции включают выявление вирусных антигенов и антител к ВИЧ. Специфические антитела к ВИЧ образуются вскоре после инфицирования, однако точное время их появления зависит от характеристики организма хозяина и вируса. Антитела могут присутствовать на ранних стадиях инфекции, но их концентрация может быть ниже предела чувствительности используемых методов. Тесты новых поколений, включая тесты третьего поколения с использованием сэндвича антигенов, могут выявлять антитела уже через 3 - 4 недели после инфицирования. Скрытый период (период "окна") можно сократить на несколько дней, используя тесты для выявления антигена, и еще на несколько дней путем определения провирусной ДНК вируса. Поэтому период "окна" может иметь продолжительность 2 - 3 недели. Тесты последнего поколения, выявляющие одновременно антигены и антитела к ВИЧ, позволяют еще более повысить чувствительность метода.

Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции служит определение антител к ВИЧ с помощью ИФА. Метод широко используется для скрининга на наличие антител к ВИЧ, обладает высокой чувствительностью (более 99,5%) и пригоден для исследования большого числа образцов. Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата.

Новое поколение комбинированных ИФА-тестов одновременно выявляет антиген и антитела. Их преимуществом является сокращение времени, необходимого для анализа, снижение трудозатрат и большая экономичность по сравнению с тем, когда каждый из анализов выполняется индивидуально.

Быстрые тесты

Быстрые тесты для определения специфических антител к ВИЧ - это тесты, которые можно выполнить менее чем за 30 минут. При правильном использовании быстрые тесты на антитела к ВИЧ являются точными и имеют широкое распространение в ряде областей:

- трансплантология (перед забором материала);

- эпидемиологический надзор (обследование труднодоступных групп населения);

- обследование крови в случае экстренного переливания препаратов крови и отсутствия обследованной на антитела к ВИЧ крови;

- тестирование на ВИЧ, если требуется немедленное начало медикаментозной профилактики ВИЧ в случае аварийной ситуации;

- тестирование беременных женщин с неизвестным ВИЧ-статусом в предродовом периоде.

Виды быстрых тестов:

- мембранные устройства для концентрации иммунного материала.

В результате выполнения этих анализов образуется четко видимая окрашенная точка на твердой поверхности, если анализ дает положительный результат. В большинстве методов требуется покапельное добавление реактивов в следующей последовательности: буфер, образец, промывной буфер, конъюгант, промывной буфер, субстрат и стоп-раствор. Большинство быстрых тестов содержат внутренний контроль, который показывает, что анализ выполнен корректно. Этим контролем является иммуноглобулин против иммуноглобулина человека, который связывает любой иммуноглобулин, присутствующий в образце, и дает отдельную точку, если реактивы были добавлены надлежащим образом;

- иммунохроматографический метод (латеральная диффузия).

Кровь, жидкость или сыворотка помещается на кончик устройства, далее происходит диффузия вдоль полоски, которая пропитана реактивами, затем происходит реакция антител с антигеном. Эти тесты не требуют добавления реактивов (или требуют добавления только буфера); содержат компонент, предназначенный для контроля технических ошибок, и позволяют получить результаты менее чем за 10 минут.

Иммунный блот

Иммунный блот (ИБ) представляет собой наиболее широко применяемый подтверждающий метод для выявления антител к ретровирусам. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса (таблица 1).

Группа белков	ВИЧ-1	ВИЧ-2
Белки оболочки вируса (gp)	gp160, gp120, gp41	gp140, gp105, gp36
Белки сердцевины (gag)	p55, p24, p17	p56, p26, p36
Ферменты вируса (pol)	p66, p51, p31	p68

На первом этапе исследования производят разделение белков ВИЧ по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Затем осуществляется электрофоретический перенос из геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сыворотки крови, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски, которые вкладываются в набор. Полученный результат сравнивается с результатами тестирования положительной и отрицательной сывороток.

Интерпретация результатов (рекомендации ВОЗ)

Положительный результат	Сомнительный результат	Отрицательный результат
Сочетание полос к gp41 и gp120, или gp41 и gp160, или gp120 и gp160	Полосы к другим антигенам ВИЧ	Отсутствие полос к какому-либо из антигенов ВИЧ

При получении сомнительного результата рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнителен, ВОЗ рекомендует провести повторное тестирование через 2 недели (хотя другие организации рекомендуют подождать от 1 до 6 месяцев перед проведением повторного анализа). Если повторное тестирование выполняется через 6 месяцев и результаты становятся отрицательными или не имеется прогрессии в отношении характера полос, ВИЧ-инфекцию можно исключить. Если имеет место серологическая прогрессия (увеличение числа или интенсивности положительных полос) или конверсия к положительному результату (сероконверсия) при повторном анализе, это означает, что пациент был инфицирован на момент первого анализа (ранняя инфекция).

Сбор, хранение и транспортировка образцов для проведения исследования

Забор крови для серологического исследования на антитела к ВИЧ производится из локтевой (или другой) вены в чистую сухую пробирку в количестве 3 - 5 мл. Полученный материал (цельную кровь) нельзя замораживать, не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при 4 - 8 °C. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой по стенке пробирки пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер и в таком виде хранится до 7 дней при температуре 4 - 8 °C, в замороженном виде - несколько лет. При работе следует соблюдать правила техники безопасности согласно Санитарным правилам "Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности и гельминтами" (постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации N 4 от 3 февраля 1999 года).

Диагностический алгоритм тестирования на наличие антител к ВИЧ

В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блоттинга. В работе допустимо использование только тест-систем, разрешенных к применению Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Диагностические процедуры должны проводиться только в соответствии с утвержденными инструкциями по применению соответствующих тестов.

Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа:

I этап (скрининговая лаборатория) - выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов (иммуноферментных, агглютинационных, комбинированных, гребеночных, мембранно-фильтрационных или мембранно-диффузных).

Если получен положительный результат, анализ проводится последовательно еще 2 раза с той же сывороткой и в той же тест-системе. Если при этом был получен еще хотя бы один положительный результат (два положительных результата из трех постановок в ИФА), сыворотка считается первично положительной и направляется в референс-лабораторию для дальнейшего исследования.

II этап (референс-лаборатория). В референс-лаборатории первично положительная сыворотка повторно исследуется в ИФА в другой (второй) тест-системе, выбранной для подтверждения. При получении положительного результата анализа и во второй тест-системе сыворотку необходимо исследовать в ИБ.

При получении отрицательного результата анализа и во второй тест-системе сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе. В случае получения отрицательного результата анализа и во второй, и в третьей тест-системе выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ. При получении положительного результата в третьей тест-системе сыворотка направляется на исследование в ИБ.

Результаты, полученные в подтверждающем тесте (ИБ), интерпретируются как:

- положительные (позитивные) - это пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ. При получении положительного результата делается заключение о наличии в исследуемом материале антител к ВИЧ;

- отрицательные (негативные) - это пробы, в которых не обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или имеется слабое реагирование с белком p18. При получении отрицательного результата выдается заключение об отсутствии в исследуемом материале антител к ВИЧ;

- неопределенные (сомнительные) - пробы, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ. При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ в зависимости от белкового профиля.

При получении белкового профиля, включающего белки сердцевины (gag), проводится исследование для диагностики ВИЧ-2.

При получении "подозрительного белкового профиля" необходимо повторить исследования через 2 недели, затем через 3 месяца от момента первого исследования. Если через 3 или 6 месяцев получен отрицательный результат в ИФА, то дальнейшее исследование не требуется. Если через 6 месяцев после первого обследования вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложноположительный. При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования повторяются по назначению.

При возможности используют дополнительные методы диагностики (определение р24-антигена или ПЦР-исследования). Если были выявлены антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ, повторное обследование на наличие антител проводится через 2 недели и далее через каждые 2 недели до получения положительного результата в подтверждающем тесте.

Основание:

1. Приложение 1 к приказу Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации от 16 августа 1994 года N 170 "О мерах по совершенствованию профилактики и лечения ВИЧ-инфекции в Российской Федерации".

2. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 июля 2001 года N 292 "Об использовании иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВИЧ в сыворотке крови человека".

3. Методическое письмо Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 14 августа 2006 года N 4174-РХ "Проведение лабораторного обследования на ВИЧ-инфекцию (в том числе исследование иммунитета и вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции).

Перечень
клинико-диагностических лабораторий, проводящих иммуноферментные анализы (ИФА) на ВИЧ

1. Клинико-диагностическая лаборатория ГУЗ "Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями".

2. Иммунологическая лаборатория ГУЗ "Ивановская областная станция переливания крови".

3. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Вичугская ЦРБ".

4. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Фурмановская ЦРБ".

5. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Шуйская ЦРБ".

6. Иммунологическая лаборатория МУЗ ГО Кинешма "ЦГБ".

7. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Тейковская ЦРБ".

8. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Родниковская ЦРБ".

9. Иммунологическая лаборатория МУЗ "Комсомольская ЦРБ".

10. Лаборатория ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии Ивановской области".

11. Лаборатория ООО "Медицина".

12. Лаборатория ЛДЦ "Миленарис".

13. Лаборатория клинической иммунологии УИН МЮ РФ по Ивановской области.