Приложение А (справочное). Контроль качества РНК, выделенной из тканей залитой в парафиновых блоках: результаты основных исследований RT-qPCR

Приложение А
(справочное)

Контроль качества РНК, выделенной из тканей залитой в парафиновых блоках: результаты основных исследований RT-qPCR ¹⁾

------------------------------

¹⁾_{Исследование в рамках проекта EU FP/SPIDIA, финансируемого седьмой структурной программой Европейского Союза [FP7/2007-2013] в рамках соглашения N 222916.}

------------------------------

А.1 Программа испытаний

РНК из разных фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) образцов печени человека были использованы для оценки влияния фиксации формалином, времени фиксации и хранения блоков на течение реакций, таких как синтез комплементарной ДНК (кДНК) и обратной транскрипции количественной ПЦР (RT-qPCR) и его последствия для контроля качества в сравнении с замороженными фрагментами этих же образцов. Полученные данные показали, что фиксация формалином приводит к менее эффективному синтезу кДНК и RT-qPCR, а также вводит основные генные транскрипты в вариации генов-транскриптов. Эти различия не могут быть надежно обнаружены при контроле качества с использованием обычных методов электрофореза или спектрофотометрии, но могут быть обнаружены с помощью анализа RT-qPCR, основанного на оценке длины различных ампликонов и анализе эффективности синтеза кДНК ²⁾. Кроме того, деградация РНК в зависимости от условий хранения и времени фиксации наблюдалась как в образцах человека, так и при использовании модели на животных.

------------------------------

²⁾_{LIBUs J., SToRCHovA Н. Количественное определение кДНК, с применением обратной транскрипции тотальной РНК, обеспечивает альтернативный инструмент для качественной нормализации RT-PCR. Биотехника. 2006, Aug 41 (2), стр. 156, 158, 160.}

------------------------------

А.2 Результаты

А.2.1 Временная зависимость целостности РНК

Фиксация формалином нарушает целостность РНК в зависимости от времени, как показано на рисунках А.1 и А.2.

Серия фрагментов образца печени человека фиксировали в течение различных периодов времени от 4 до 120 ч в стандартном забуференном растворе формалина перед заливкой парафином. Аналогичные значения показателя целостности РНК (RIN) были получены для всех временных точек фиксации в диапазоне от 2,1 до 2,7. Однако амплификация RT-qPCR фрагментов различной длины гена "домашнего хозяйства" GAPDH выявила повышение значений пороговых циклов (Cf) для различных ампликонов, коррелирующих со временем фиксации. Длительная фиксация вызывала более крутой наклон генерируемых кривых, что указывало на повышенную фрагментацию и делала невозможным амплификацию более длинных фрагментов.

X - длина ампликона в п.о.; Y - значение Ct (порог = 0,2); 1 - 4 ч; 2 - 8 ч; 3 - 12 ч; 4 - 24 ч; 5 - 48 ч; 6 - 12 ч; 7 - 96 ч; 8 - 120 ч; 9 - замороженный фрагмент образца ткани

Рисунок А.1 - Амплификация RT-qPCR фрагментов гена GAPDH различной длины (печени человека), фиксированные в стандартном забуференном растворе формалина в течение различных периодов времени до заливки парафином

А.2.2 Влияние фиксации формалином на эффективность синтеза кДНК

Синтез кДНК из РНК, выделенной из замороженного фрагмента ткани печени человека (см. рисунок А.2), находился в прямой корреляционной зависимости с количеством РНК-матрицы. Такая корреляции ожидаема. Из РНК, выделенной из ткани в парафиновых блоках (см. рисунок А.2), получалось лишь небольшое количество кДНК даже в случае, когда было взято большее количество РНК-матрицы. Планки погрешностей на рисунке А.2 иллюстрируют величину стандартного отклонения среднего количества кДНК, суммированного по значениям трех повторов.

X - матричная РНК в мкг; Y - относительное количество кДНК; 1 - замороженный фрагмент образца ткани печени; 2 - образец ткани печени в парафиновых блоках

Рисунок А.2 - Накопление выделенной кДНК из замороженного фрагмента и образцов ткани печени человека в парафиновых блоках в корреляции с количеством матричной РНК

А.2.3 Фиксация и хранение привнесенных основных ген-генных вариантов в RT-qPCR

X - различные исследуемые гены; Y - значение Ct; 1 - замороженный фрагмент образца ткани печени; 2 - образец ткани печени в парафиновом блоке через 6 мес; 3 - образец ткани печени в парафиновом блоке через 1 год

Рисунок А.3 - Значения Ct для 92 генов из замороженных фрагментов и образцов ткани печени человека в парафиновых блоках

Образцы печени человека замораживали или фиксировали в стандартном забуференном растворе формалина и заливали парафином. РНК экстрагировали из тканей в разные моменты времени (через 6 мес и 1 год). Сравнение результатов RT-qPCR для 92 генов из замороженных фрагментов и образцов ткани печени человека в парафиновых блоках выявило среднюю разницу значений Ct в диапазоне от четырех (6 мес) до восьми циклов (1 год), увеличивающуюся со временем хранения при комнатной температуре (см. рисунок А.3). Кроме того, большие вариации транскриптов генов наблюдались в РНК всех образцов ткани в парафиновых блоках по сравнению с замороженными фрагментами. Это различное и специфичное для генов проявление РНК, выделенной из образцов ткани в парафиновых блоках, может серьезно повлиять на результаты и интерпретацию исследований экспрессии генов.

А.2.4 Влияние условий хранения образцов ткани в парафиновых блоках на целостность РНК

X - месяцы (м); Y - значение RIN; t ₀ - начало хранения; 1 - температура хранения 22 °С; 2 - температура хранения 4 °С; 3 - температура хранения минус 20 °С; 4 - температура хранения минус 80 °С

Рисунок А.4 - Значения RIN РНК, выделенных из образцов ткани селезенки крыс в парафиновых блоках, хранящихся при различных температурах

Для определения значений RIN РНК из тканей крыс в парафиновых блоках, образцы хранили перед экстракцией РНК при различных температурах (22 °С, 4 °С, минус 20 °С и минус 80 °С). РНК экстрагировали в начале хранения (t ₀) и после 3, 6, 9, 12, 18, 24 и 36 мес хранения.

Значения RIN показаны для трипликатов образцов, экстрагированных из ткани селезенки при каждой температуре хранения (см. рисунок А.4). Постоянное снижение значения RIN наблюдалось в блоках, хранящихся при температуре 22 °С. Деградация замедлялась в блоках, хранящихся при температуре 4 °С. В РНК из замороженных блоков (минус 20 °С и минус 80 °С) при исследовании RIN не наблюдалось серьезной деградации.

А.3 Выводы

Химические модификации РНК, внесенные с помощью фиксации формалином, оказывают влияние на последующие исследования, такие как обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (RT-PCR). В случае RT-PCR это воздействие может быть измерено как снижение эффективности амплификации и синтеза кДНК по сравнению с химически немодифицированной РНК из, например, замороженного фрагмента образца ткани.

Стандартизация преаналитического процесса, применение дополнительных методов контроля качества и детальной информации об образцах могут значительно повысить сопоставимость и надежность молекулярно-биологических исследований образцов тканей в парафиновых блоках.

А.4 Дополнительная литература

Kashofer К., Viertler C., Pichler М., Zatloukal K (2013) Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PLoS ONE 8(7): e70714, doi: 10.1371/ journal, pone. (Контроль качества сохранности РНК и экстракция из тканей в парафиновых блоках: применение для RT-PCR и микрочипов).

Standardization and improvement of generic pre-analytical tools and procedures for in vitro diagnostics. http://www.spidia.eu/. (Стандартизация и совершенствование общих преаналитических подходов и процедур для диагностики in vitro).