Приложение 2. Процедура белковой экстракции

Приложение 2
к МУК 4.2.3733-21

Процедура белковой экстракции

1. Проведение экстракции неспорообразующих микроорганизмов этанолом/муравьиной кислотой.

1.1. Подготавливают и маркируют необходимое количество микропробирок с защелкой объемом 1,5 мл, соответствующее числу исследуемых штаммов.

1.2. В каждую микропробирку вносят 300 мкл деионизованной воды для масс-спектрометрии.

1.3. Бактериологической пластиковой петлей объемом 1 мкл вносят в пробирку культуру возбудителя (1 петля) и аккуратными, плавными движениями тщательно суспендируют.

1.4. К суспензии добавляют 900 мкл 96% этилового спирта и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин (для бруцелл - в течение 90 мин).

1.5. Полученную смесь тщательно перемешивают на вортексе не менее 1 мин.

1.6. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин.

1.7. Супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором. В случае неполного удаления спирта пробы подсушивают с открытыми крышками на воздухе или в твердотельном термостате при температуре 37-42°С или дополнительно центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин с отбором супернатанта.

1.8. К осадку добавляют 70% водный раствор муравьиной кислоты (см. п. 4 приложения 3 к настоящим МУК). Вносимый объем муравьиной кислоты зависит от первоначального количества культуры, взятой в исследование, и может варьировать от 1 до 80 мкл (таблица 1).

Таблица 1

Объем муравьиной кислоты и ацетонитрила

	Размер колонии		Объем петли
	<1,0 мм	>1,0 мм	1 мкл	10 мкл
Муравьиная кислота	1-5 мкл	5-15 мкл	10-40 мкл	30-80 мкл
Ацетонитрил	1-5 мкл	5-15 мкл	10-40 мкл	30-80 мкл

1.9. Полученную смесь тщательно перемешивают пипетированием.

1.10. К суспензии добавляют ацетонитрил в объеме, равном объему муравьиной кислоты, и смесь повторно тщательно перемешивают пипетированием.

1.11. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин.

1.12. Отбирают супернатант в стерильную микропробирку типа "Эппендорф", а исходную пробу помещают в емкость с дезинфицирующим раствором.

1.13. Наружную поверхность микропробирки обтирают салфеткой, смоченной в дезинфицирующем растворе.

1.14. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.

1.15. Полученная суспензия готова для нанесения на ячейки мишени.

2. Проведение экстракции и фильтрации спорообразующих микроорганизмов (сибиреязвенного микроба) 80%-й трифторуксусной кислотой.

2.1. Подготавливают и маркируют необходимое количество микропробирок с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл, соответствующее числу исследуемых штаммов.

2.2. В каждую пробирку вносят 300 мкл деионизованной воды.

2.3. Микробиологической пластиковой петлей объемом 1 мкл, вносят в пробирку одну изолированную колонию возбудителя и аккуратными, плавными движениями тщательно суспендируют.

2.4. Для культур со среды хранения (споровые формы) взвесь микроорганизмов готовят в 0,9% растворе хлорида натрия по стандартному образцу мутности, который ориентировочно соответствует концентрации спор в 1 мл, с помощью бактериологической петли объемом 1 мкл.

2.5. Отбирают 20 мкл полученной взвеси и переносят в 80 мкл 100% трифторуксусной кислоты в микропробирке 1,5-2 мл с завинчивающейся крышкой и кольцевой прокладкой.

2.6. Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге-вортексе и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин.

2.7. Пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 20 мин при 13000 об/мин.

2.8. Полученный супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и переносят в микропробирку с ультрамикроцентрифужным фильтром (поливинилиденфторид, ПВДФ) с диаметром пор 0,22 мкм.

2.9. Центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин.

2.10. Фильтрат из нижней части центрифужного ультрафильтра переносят в микропробирку. Верхнюю и нижнюю составляющую часть центрифужного ультрафильтра помещают в дезинфицирующий раствор в соответствии с требованиями нормативных документов для спорообразующих микроорганизмов. Затем после экспозиции твердые отходы утилизируют в автоклаве.

2.11. Наружную поверхность микропробирки обтирают салфеткой, смоченной в дезинфицирующем растворе.

2.12. Полученный объем фильтрата доводят до 200 мкл деионизованной водой, добавляют 200 мкл ацетонитрила, перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 20 с при 13000 об/мин, чтобы убрать капли образца со стенок и крышки пробирки. Полученная суспензия готова для нанесения на ячейки мишени.

2.13. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.

3. Проведение экстракции возбудителей глубоких микозов 80%-й трифторуксусной кислотой.

3.1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавляют 50 мкл 80%-го раствора трифторуксусной кислоты.

3.2. В эту пробирку переносят мицелий микромицета в объеме 1 микологической лопатки (приблизительно 50 мг), исключив попадание в микропробирку питательной среды, и механически измельчают микологической лопаткой.

3.3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

3.4. Добавляют 150 мкл воды и перемешивают.

3.5. Добавляют 200 мкл ацетонитрила, повторно перемешивают.

3.6. Центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 2 мин.

3.7. Супернатант отбирают в отдельные микропробирки и используют для масс-спектрометрического анализа.

3.8. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.

3.9. Материал можно хранить при температуре не выше минус 20°С.