Приложение D (обязательное). Методы определения азокрасителей и первичных ароматических аминов

Приложение D
(обязательное)

Методы
определения азокрасителей и первичных ароматических аминов

D.1 Общие положения

Для обнаружения азокрасителей навеску подвергают обработке в плотно закрытом сосуде при температуре 70 °C с дитионитом натрия в цитрат-буферном растворе (pH = 6). После восстановительного расщепления образовавшиеся амины экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром при помощи SPE-кизельгур-колонки (например, Chromabont  XTR или другой равноценной колонки). Эфирный экстракт концентрируют с помощью ротационного испарителя или другого аналогичного прибора. Осадок в зависимости от применяемого метода обнаружения растворяют в ацетонитриле или в другом растворителе.

Обнаружение аминов производится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью диодо-матричного детектора (HPLC/DAD); посредством тонкослойной хроматографии (TLC, HPTLC); посредством капиллярной газовой хроматографии с помощью пламенно-ионизационного детектора или масс-селективного детектора (GC/FID или GS/MS) с применением капиллярного электрофореза с помощью детектора с диодной матрицей (CE/DAD).

Амины должны быть идентифицируемы при использовании как минимум одного из описанных в настоящем приложении хроматографических методов. Если идентификация не достигается (например, в результате применения GS/MS и сравнения со стандартами), то подтверждение результатов должно производиться путем использования альтернативного метода разделения (для того чтобы избежать возможной ошибочной оценки, например, посредством изомеров аминов, подлежащих определению).

Количественное определение содержания аминов производят при использовании HPLC/DAD или GS/MS.

Примечание - Некоторые амины расщепляются при условиях, указанных в D.6.2 (см. таблицу D.1).

Таблица D.1 - Амины и продукты их расщепления при восстановлении

Амин	Продукты расщепления
о-аминоазотолуол	о-толуидин, 2-метил-р-фенилендиамин
2-амино-4-нитротолуол	4-метил-м-фенилендиамин
4-аминоазобензол	р-фенилендиамин, анилин

4-аминоазобензол расщепляется на п-фенилендиамин и анилин; о-аминоазотолуол расщепляется на 2-метил-п-фенилендиамин и о-толуидин, 5-нитро-о-толуидин восстанавливается до 4-метил-м-фенилендиамина.

Если после восстановительного расщепления появляются один или несколько первичных аминов, приведенных в таблицах 3 и 4, в количестве, превышающем 30 мг/кг, то это подтверждает наличие в красках запрещенного к применению азокрасителя.

Первичные ароматические амины, приведенные в таблице 3, считаются выявленными в красках, если их концентрация превышает 5 мг/кг.

D.2 Реактивы

Если не указано иное, то при испытаниях должны использоваться следующие химически чистые вещества.

D.2.1 Метиловый спирт.

D.2.2 Ацетонитрил.

D.2.3 трет-бутилметиловый эфир.

D.2.4 цитрат-натрий гидроксид в буферном растворе, С(тринатрийцитрат) = 0,06 моль/л, pH = 6, нагретый до температуры 70 °C или 37 °C. 12,6 г моногидрата лимонной кислоты и 6,4 г гидроксида натрия растворяют в 900 см ³ воды, затем объем доводят до 1 дм ³.

Примечание - Раствор Merck-Nr. 1.09437 является допустимым.

D.2.5 Растворенный в воде дитионит натрия,  = 200 мг/см ³.

D.2.6 Пористая гранулированная SPE-кизельгур-колонка.

Примечание - Chromabond  XTR является приемлемым.

D.2.7 Амины, приведенные в таблицах 3 и 4, имеют наивысшую степень чистоты.

Примечание - Амины, приведенные в таблицах 3 и 4, являются канцерогенами или ракообразующими веществами (Перечень МАК III А1 или III А2: ЕС С1/С2). Они имеют ограниченную область применения, и обращение с ними требует предельного внимания и надлежащих мер безопасности.

D.2.8 Стандартные вещества для газовой хроматографии

D.2.8.1 IS 1: Нафталин-d ₈, номер CAS - 1146-65-2.

D.2.8.2 IS 2: 2,4,5 - трихлоранилин, номер CAS - 636-30-6.

D.2.8.3 IS 3: 4 - амино-2-метилхинолин, номер CAS - 6628-04-2.

D.2.8.4 IS 4: антрацен-d ₁₀, номер CAS - 1719-06-8.

D.2.9 Стандартные растворы

D.2.9.1 Калибровочный раствор амина из таблиц 3 и 4,  = 10,0 мкг/см ³.

D.2.9.2 Стандартный раствор от IS 1 до IS 4 (D.2.8.1-D.2.8.4),  = 10,0 мкг/см ³.

D.2.9.3 Растворы амина из таблиц 3 и 4 для проведения испытания,  = 10,0 мкг/см ³.

Примечание - Растворитель, применяемый для анализа, определяется в зависимости от выбранного метода хроматографии.

Устойчивость аминорастворов должна подтверждаться при испытаниях.

D.3 Оборудование

Применяют обычное лабораторное оборудование.

D.3.1 Сосуд вместимостью от 20 до 50 см ³ из термостойкого стекла с плотно закрывающейся резьбовой пробкой.

D.3.2 Водяная баня, термошкаф или тепловой блок; применяемое оборудование должно обеспечивать температуру (37  2) °C и (70  2) °C.

D.3.3 Колонка, изготовленная из стекла или полипропилена, имеющая внутренний диаметр от 25 до 30 мм, длину от 140 до 150 мм, 20 г наполнителя из пористого гранулированного материала SPE-кизельгур и оснащенная около выпускного отверстия стекловолокнистым фильтром (или стандартная SPE-колонка).

Примечание - Chromabond  XTR (Macherey-Nagel-Katalog-номер 730 507) является приемлемым.

D.3.4 Ротационный вакуумный испаритель или аналогичный низкотемпературный концентратор испытуемой пробы.

D.3.5 Пипетки с номинальным объемом 10, 5 и 1 см ³.

D.4 Оборудование и измерительная аппаратура

Испытания проводят с использованием следующего оборудования:

D.4.1 Оборудование для TLC и/или HPTLC, включая ультрафиолетовую лампу.

D.4.2 HPTLC с градиентным элюированием и DAD.

D.4.3 GC с FID или MS.

D.4.4 CE/DAD.

D.5 Подготовка пробы

Пробу гомогенизируют путем энергичного встряхивания.

D.6 Проведение анализа

D.6.1 Подготовка пробы

Для обнаружения определенных азокрасителей, а также для установления "свободных" первичных ароматических аминов навеску массой 1,0 г взвешивают в сосуде (D.3.1).

D.6.2 Окисление-восстановление азокрасителя

К пробе добавляют 17 см ³ раствора (D.2.4), предварительно нагретого до температуры (70  2) °C. Сосуд плотно закрывают, встряхивают для гомогенизации и выдерживают в течение 30 мин при температуре (70  2) °C.

Для отделения азокрасителя к содержимому сосуда добавляют 3,0 см ³ раствора дитионита натрия (D.2.5). Сосуд плотно закрывают, встряхивают и выдерживают (30  2) мин при температуре (70  2) °C; затем сосуд в течение 2 мин охлаждают до комнатной температуры.

D.6.3 Экстрагирование растворимых аминов

Для определения свободных ароматических аминов (4.5.2) не производится окислительно-восстановительная реакция (D.6.2). Экстрагирование проводят следующим образом: к 20 см ³ испытуемой пробы добавляют буферный раствор (D.2.4), предварительно нагретый до температуры (37  2) °C, сосуд плотно закрывают, затем встряхивают для гомогенизации и выдерживают 30 мин при температуре (37  2) °C.

D.6.4 Раствор по D.6.2 или D.6.3 помещают в SPE-колонку; колонку при этом не промывают водой или раствором. Данный раствор выдерживают 15 мин для абсорбирования в колонке. Затем амины экстрагируют, как описано ниже, два раза раствором по 4 см ³ трет-бутилметилового эфира.

Из SPE-колонки извлекают первые 40 см ³ трет-бутилметилового эфира, предназначенного для промывания реакционных сосудов, и делят его на три части: 2  10 см ³ и 1  20 см ³. 10 см ³ добавляют в сосуд, который затем плотно закрывают и встряхивают. Трет-бутилметиловый эфир после водной фазы выдерживают 15 мин для абсорбирования в колонке, затем сливают из реакционного сосуда на колонку.

Растворитель собирают в колбу вместимостью 100 см ³. Испытания повторяют с оставшимися 10 см ³ и 20 см ³ трет-бутилметилового эфира. После чего непосредственно в колонку вносятся остальные 40 см ³. Растворитель должен быть прозрачным и не требующим сушки.

Трет-бутилметиловый эфир медленно выпаривают до 1 см ³ (но не до суха!) при температуре не более 25 °C, используя ротационный вакуумный испаритель или аналогичный концентратор проб. Если трет-бутилметиловый эфир не предназначен для хроматографии, то его удаляют растворителем при минимальном расходе инертного газа. Если применяемый трет-бутилметиловый эфир предназначен для хроматографии, то его осадок переносят в маленькую градуированную пробирку и заполняют промывочной жидкостью из колбы до объема 2,0 см ³.

Примечание 1 - Если процесс не контролируется (например, высокий вакуум, высокая температура, сильный поток инертного газа), то при удалении растворителя могут возникать значительные потери аминов. Удаление растворителя должно проходить при уменьшенном освещении (следует избегать прямого солнечного света и по возможности прямого люминесцирующего света).

После того как осадок полностью высохнет, его растворяют добавлением 2,0 см ³ растворителя, например метанола, затем испытывают. Если испытания не могут быть проведены немедленно, то навеску подвергают заморозке при температуре минус 20 °C и в таком виде хранят.

Количественное определение аминов проводят при использовании HPLC/DAD или GC/MS. При использовании GC/MS должны применяться стандартные вещества.

Примечание 2 - Определенные амины, например 2,4-толуолдиамин, обладают очень низкой устойчивостью. Если экстрагирование и концентрирование не выполняется надлежащим образом, то это может привести к частичной или полной потере аминов.

D.6.5 Хроматографический метод

Для обнаружения первичных ароматических аминов необходимы следующие условия:

D.6.5.1 Тонкослойная хроматография (TLC)

Вариант 1
Пластины (HPTLC):	Силикагель 60 с флуоресцентным индикатором F 254 20  10 см
Используемый объем:	От 2 до 5 мкл, нанесенный в виде точки
Мобильная фаза 1:	Удельный объем (хлороформ/уксусная кислота) - 90:10
Вариант 2
Пластины (TLC):	Силикагель 60
Используемый объем:	10 мкл, нанесенный в виде капли
Мобильная фаза 2:	Удельный объем (хлороформ/этилацетат/уксусная кислота) - 60:30:10
Мобильная фаза 3:	Удельный объем (хлороформ/метанол) - 95:5
Мобильная фаза 4:	Удельный объем (н-бутилацетат/толуол) - 30:70
Выделение	Насыщенный зловонный запах
Вариант 3
Пластины (TLC):	Силикагель 60
Мобильные фазы 2 и 3:	Выделение посредством растворителя 3, следующего за растворителем 2, не высушивая пластину
Распыляемый реагент 1:	Нитрит натрия, w(NaNO 2) = 0,1 % в водном растворе КОН (с = 1 моль/дм 3)
Распыляемый реагент 2:	-нафтол, w(C 10H 8O) = 0,2 % в водном растворе КОН (с = 1 моль/дм 3)
Детектирование:	1 Ультрафиолетовая лампа. 2 Разбрызгиватель с распыляемым реагентом 1, разбрызгиватель с распыляемым реагентом 2; время реакции - 5 мин.

D.6.5.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC)

Растворитель 1:	Ацетон
Растворитель 2:	0,575 г дигидрогенфосфата аммония и 0,7 г динатрия гидрофосфата в 1000 мл воды, pH = 6,9
Колонка:	HyPurity Advace 250  3 мм, 5 мкм Каталог ThermoQuest номер 21 005-0 035
Расход:	0,4 см 3/мин
Градиент:	Точка отсчета 0, начиная с 15 % растворителя 1, доля растворителя 1 в течение 45 мин повышается на 75 %
Температура колонки:	40 °C (или 15 °C в качестве другой возможной температуры)
Объем впрыскивания:	5,0 мкл
Детектирование:	Детектором с диодной матрицей (DAD) при длине волны 240, 280 и 305 нм, полные спектры

D.6.5.3 Метод газовой хроматографии (GC)

Капиллярная колонка:	DB-5MS, DB-35MS, SE 54 или аналогичная колонка, габариты: длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мкм, толщина пленки 0,25 мкм. Предназначена для деактивирования аминов
Инжектор	Раздельный/нераздельный
Температура впрыскивания:	260 °C
Газ-носитель:	Гелий
Программирование температур:	60 °C (2 мин), от 60 °C до 310 °C (15°С/мин), 310 °C (2 мин)
Объем впрыскивания:	1,0 мкл, отношение деления 1:15
Детектирование:	Масс-спектрометрия (MS)

D.6.5.4 Метод капиллярного электрофореза (СЕ)

К 200 мкл готового раствора (D.6.4) добавляют 50 мкл HCI (с = 0,01 моль/л) и фильтруют при помощи мембранного фильтра (0,2 мкл). Этот раствор используют для капиллярного электрофореза (CE).

Капилляр 1	56 см, без внутреннего покрытия, с внутренним диаметром 50 мкм, с оптически продленной длиной (HP)
Капилляр 2	56 см, изнутри покрытый поливиниловым спиртом, с внутренним диаметром 50 мкм, с оптически продленной длиной (HP)
Буферный раствор:	Буферный фосфатный раствор (с = 0,05 моль/дм 3), pH = 2,5
Температура колонок:	25 °C
Электрическое напряжение:	30 кВ
Время инжекции:	4 с
Продолжительность промывания	5 с
Детектирование:	Детектором с диодной матрицей (DAD) при длине волны 214 и 254 нм, испытание посредством сравнения спектров

D.6.6 Аналитический метод

Для проведения испытания добавляют 1,0 см ³ раствора (D.2.9.3) и 1,0 см ³ метанола в реакционный сосуд (D.3.1), который содержит 15 мл буферного раствора, предварительно подогретого до температуры (70  2) °C. Затем процедура должна проводиться согласно D.6.2 (второе предложение). Доля аминов должна составлять минимум 70 %, исключениями являются 2,4-диаминоанизол, о-толуидин и 2,4-толуолдиамин, для которых ожидаемые процентные доли находятся между 20 % и 50 %.

Примечание - После перепроверки этого метода методом экспертной оценки будут получаться аналогичные значения.

D.7 Расчет

Концентрацию аминов рассчитывают по площади каждого амина и указывают как массовую долю отдельных имеющихся в материале аминокомпонентов w, мг/кг, по следующей формуле:

,

(1)

где A _s - содержание амина в испытуемом растворе, единица площади;

A _с - содержание амина в калибровочном растворе, единица площади;

C _с - концентрация амина в калибровочном растворе, мг/см ³;

E _s - начальная масса испытуемого образца в конечном объеме, г;

V _s - объем полученного раствора для испытаний согласно D.6.4, который используется для хроматографического анализа, см ³.

Если используется стандартное вещество, то массовая доля аминкомпонента w умножается на ;

где - стандартная концентрация в испытуемом растворе, единица площади;

- стандартная концентрация в калибровочном растворе, единица площади.

D.8 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию.

D.8.1 Обозначение испытуемой пробы.

D.8.2 Тип и обозначение испытуемой пробы.

D.8.3 Дата поступления в лабораторию и дата проведения испытания.

D.8.4 Данные по проведению испытания (отделение и доказательства).

D.8.5 Данные по количественному методу.

D.8.6 Результаты, полученные в ходе расчетов.

D.8.7 Вывод о том, был ли выявлен запрещенный азокраситель или нет (см. 4.2.3).

D.8.8 Вывод о том, выполнены ли требования к первичным ароматическим аминам (см. 4.5).