Приложение Б (обязательное). Методы санитарно-паразитологического исследования смывов с поверхностей, воздуха и пыли для проведения внутрилабораторного контроля

Приложение Б
(обязательное)

Методы санитарно-паразитологического исследования смывов с поверхностей, воздуха и пыли для проведения внутрилабораторного контроля

Б.1 Исследование смывов с поверхностей при осуществлении внутрилабораторного контроля в паразитологических лабораториях (комнатах, помещениях)

Б.1.1 Отбор проб и подготовка к исследованию

При определении обсемененности возбудителями паразитарных болезней в лабораториях (комнатах, помещениях), задействованных в паразитологических исследованиях не реже 1 раза в месяц, отбираются смывы с поверхностей.

Смывы берут с любых поверхностей в лаборатории (комнате, помещении), непосредственно задействованных в паразитологических исследованиях (столы, стены, рабочие поверхности микроскопов, лотки, руки, халаты, спецодежда персонала, ручки дверей, ручки и поверхности раковин, поверхности фильтровальных установок, полы, санузел лаборатории и т.д.)

Для отбора смывов применяют кисточки из щетины, беличьи кисточки, смоченные в 1 %-ном растворе едкого натра, или в 10 %-ном растворе глицерина, или 1 %-ном растворе стирального порошка. В центрифужные пробирки наливают до половины объема 10 %-ный раствор глицерина. Для каждой группы предметов берут отдельную пробирку и кисточку, которые нумеруются (номер кисточки и пробирки должны совпадать). В одну пробу, т.е. в пробирку, можно собирать смывы с нескольких однородных предметов (например: столы, рабочие поверхности микроскопа, ручки дверей и т.д.).

Смывы с рук персонала берут у каждого отдельно, чтобы при обнаружении яиц гельминтов или/и цист кишечных простейших можно было знать, какой именно сотрудник нарушает правила гигиены.

Для снятия яиц гельминтов с рук персонала рекомендуется мыть их раствором питьевой соды или 1 %-ным раствором едкого натра; смывные воды центрифугируют, осадок можно также профильтровать в аппарате Гольдмана и затем исследовать фильтры.

При взятии смывов с поверхностей кисточкой, смоченной в растворе, многократно и с нажимом проводят по поверхности однородных предметов обследуемого объекта. Причем кисточку в процессе отбора часто и тщательно ополаскивают в пробирке и вновь делают смывы с поверхности предметов.

Площадь исследуемой поверхности для одной пробы смывов составляет не менее 0,25 м ² (0,5 x 0,5 м).

После отбора проб пробирки с вложенными в них кисточками в штативах доставляются на паразитологическое исследование.

Этикетирование целесообразно проводить не для каждой отдельной пробирки.

Б.1.2 Исследование смывов на яйца гельминтов

Б.1.2.1 Метод центрифугирования

Ход исследования

Кисточки со смывами ополаскивают в жидкости пробирки.

Центрифугируют полученные пробы в этих же пробирках, надосадочную жидкость сливают.

Осадок помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Плотный осадок делят на несколько предметных стекол.

Б.1.2.2 Флотационный метод

Ход исследования

В пробирку со смывом добавляют 5-6 см ³ флотационного раствора, в котором тщательно и многократно промывают кисточку в течение 3-5 мин вертикальными и круговыми движениями, после чего кисточку сразу удаляют из пробирки.

В пробирку доливают флотационный раствор до образования выпуклого мениска, накрывают ее обезжиренным покровным стеклом до полного соприкосновения с поверхностной пленкой раствора.

Время экспозиции 12-15 мин.

При использовании флотационного раствора хлорида натрия - 20-25 мин. Затем покровное стекло снимают пинцетом и полученную висячую каплю на покровном стекле аккуратно переносят на предметное стекло в каплю 50 %-ного раствора глицерина. Полученный препарат микроскопируют при 80-150-кратном увеличении.

Готовить пробы к исследованию одновременно следует партиями не более 5-6 пробирок, так как при большом количестве пробирок увеличивается время экспозиции, и яйца, поднявшиеся в поверхностную пленку, покрываются кристаллами соли, что затрудняет их обнаружение.

Б.1.3 Исследование смывов на цисты простейших

Б.1.3.1 Метод Романенко

Ход исследования

Кисточки со смывом ополаскивают в жидкости пробирки, затем сливают эту жидкость в высокий цилиндр емкостью 0,5-1,0 дм ³ с чистой водой, которую наливают с таким расчетом, чтобы при добавлении смыва не превысить общую емкость цилиндра. Всплывшие на поверхность жидкости кусочки бумаги, ткани и другие крупные частицы удаляют петлей с сеткой, а оставшуюся жидкость отстаивают в течение 12-16 ч, надосадочную жидкость удаляют, а осадок микроскопируют, окрашивая 1 %-ным раствором Люголя.

Б.1.3.2 Метод иммуномагнитного разделения и мечение флуоресцирующими антителами (ИМС) на определение цист и ооцист кишечных простейших.

Б.1.4 Материал, оборудование и реактивы

Магнитный штатив.

Автоматические пипетки на 1-10 мкл, 20-200 мкл и 100-1000 мкл.

Наконечники для автоматических пипеток.

Градуированная пипетка на 10 см ³.

Лабораторный вортекс.

Лабораторный ротатор.

Пробирки для иммуномагнитной сепарации (ИМС-пробирки или плоскостенные пробирки) или обычные центрифужные.

Штатив для ИМС-пробирок.

Пробирки типа Эппендорф на 1,5 см ³.

Штатив для пробирок типа Эппендорф.

Флуоресцентный микроскоп с набором необходимых фильтров и принадлежностей в рекомендованной комплектации или насадка на микроскоп ОптиЛюм.

Стекла предметные SuperStick_: S100-2 (два окна), или обычные предметные стекла.

Пастеровские пипетки.

Буфер для иммуномагнитной сепарации Grab_ Buffer А (1), 2-концентрированный.

Иммуномагнитная суспензия Giardia-Grab_ IMS Beads (2), специфичная к цистам лямблий.

Иммуномагнитная суспензия Crypto-Grab_ IMS Beads (3), специфичная к ооцистам криптоспоридий.

Моющий буфер Grab_ Buffer В (4).

Таблетированный фосфатный буфер PBS (6).

DAPI концентрированный раствор (7), 2 мг/см ³.

DAPI в метаноле.

Моющий буфер SureRinse_ (8).

Иммунореагент Aqua-Glo_G/C (9) в рабочем разведении.

Положительный контроль (10).

Контрастирующий краситель (11), С101.

Защитная среда (12) No-Fade_, М101 или E1-vanol No-Fade_, М102.

Метанол.

0,1 Н раствор соляной кислоты.

1 Н раствор NaOH.

Примечание - Допускается использование материалов, оборудования и реактивов иных производителей с аналогичными характеристиками, но не ниже указанных.

Б.1.5 Подготовка проб (смывов) к исследованию

Подготовка проб (смывов) к исследованию после фильтрации смыва с рабочих поверхностей осадок с фильтров (МФАС или ATM) смывают в 10 см ³ дистиллированной воды, переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Затем удаляют надосадочную жидкость и проводят исследование осадка. При этом осадок должен быть не более 1 см ³. Если получился больший объем осадка, его необходимо ресуспендировать дистиллированной водой.

В одной ИМС-пробирке обрабатывается не более 0,5 см ³ концентрата пробы, ресуспендированного в 3 см ³ дистиллированной воды. Больший объем осадка необходимо перемешать с дистиллированной водой, разделить на части, в каждой из которых должно содержаться не более 0,5 см ³ исходного осадка, и далее обрабатывать как две и более пробы.

Примечание - Диагностические наборы с иммунореагентами и буферными растворами перед использованием выдержать в течение одного часа при комнатной температуре.

Б.1.6 Иммунохимическое связывание, магнитная сепарация и промывка

С помощью градуированной пипетки на 10 см ³, предварительно омытой дистиллированной водой, перенести в пробирку для иммуномагнитной сепарации (ИМС-пробирку или плоскостенную пробирку) исследуемый концентрат, ресуспендированный в 3 см ³ дистиллированной воды. Омыть пробирку, в которой находился концентрат, двумя порциями дистиллированной воды по 1 см ³, оба смыва перенести в пробирку для иммуномагнитной сепарации. Общий объем раствора в пробирке для ИМС составит 5 см ³. Внести в пробирку для ИМС 5 см ³ 2-концентрированного буфера Grab_ Buffer А (1). Плотно закрыть крышку пробирки и перемешать раствор, переворачивая пробирку 3 раза. По выполнении всех процедур переноса пробы общий объем раствора в ИМС-пробирке составляет 10 см ³.

Перемешать иммуномагнитную суспензию Giardia-Grab_ IMS Beads (2) на вортексе в течение 20 с, отобрать 100 мкл суспензии и перенести ее в ИМС-пробирку, в которой уже находится проба. Перемешать иммуномагнитную суспензию Crypto-Grab_ IMS Beads (3) на вортексе в течение 20 с, отобрать 100 мкл суспензии и перенести ее в пробирку для ИМС, в которой уже находится проба. Закрепить пробирку для ИМС в штативе лабораторного ротатора перпендикулярно к оси вращения. Перемешивать в течение 1 ч при скорости 18 об/мин при комнатной температуре. Извлечь ИМС-пробирку из ротатора. Поместить ее в магнитный штатив плоской стороной к магниту. Бережно покачивать штатив с пробиркой вручную в течение 3 мин, поворачивая ее на 90° от себя/на себя, при этом плоская сторона пробирки должна находиться снизу.

Остановив покачивание в вертикальном положении пробирки и не вынимая ее из магнитного штатива, осторожно вылить надосадочную жидкость из пробирки. Не вынимая ИМС-пробирку из штатива и не касаясь магнитного осадка на стенке, отобрать остатки жидкости со дна пробирки с помощью пастеровской пипетки.

Извлечь пробирку из штатива, добавить в пробирку 0,48 см ³ буфера Grab_ Buffer В (4). Поворачивая пробирку, осторожно смыть суспензию с плоской стенки. С помощью пастеровской пипетки омыть плоскую стенку пробирки.

С помощью пастеровской пипетки перенести 0,48 см ³ суспензии в пробирку типа Эппендорф на 1,5 см ³.

Дважды омыть плоскую стенку ИМС-пробирки 0,48 мл буфера Grab_ Buffer В, осторожно поворачивая пробирку и используя ту же пастеровскую пипетку. Последовательно перенести оба смыва в пробирку типа Эппендорф на 1,5 см ³ с помощью одной пастеровской пипетки, при этом избегать образования пузырей. Подождать примерно 15 с и перенести остатки жидкости из ИМС-пробирки в ту же пробирку типа Эппендорф.

Закрыть крышку пробирки типа Эппендорф и поместить ее в магнитный штатив. Бережно покачивать штатив с пробиркой вручную в течение 1 мин, поворачивая ее на 180° от себя/на себя, при этом пробирка должна находиться сверху.

Не вынимая пробирку типа Эппендорф из магнитного штатива и не касаясь суспензии на стенке пробирки, с помощью пастеровской пипетки осторожно отобрать всю жидкость из пробирки.

Б.1.7 Диссоциация

Извлечь пробирку типа Эппендорф из магнитного штатива, добавить в пробирку 50 мкл 0,1 Н раствора соляной кислоты. Перемешать суспензию на вортексе в течение 50 с.

Инкубировать пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре.

Перемешать суспензию в микроцентрифужной пробирке на вортексе в течение 30 с.

Установить пробирку в магнитный штатив. Через 30 с осторожно, не касаясь осадка на стенке пробирки, с помощью автоматической пипетки отобрать 50 мкл супернатанта и перенести его в окно предметного стекла (слайда) SuperStick_ (5), в котором находится 6 мкл 1,0 Н раствора NaOH.

Повторить процедуры диссоциации. Обе порции исследуемого раствора можно внести в одно и то же или в два окна предметного стекла (слайда) SuperStick_ для последующего иммунофлуоресцентного мечения. Внести в окно предметного стекла (слайда) положительный контроль с цистами лямблий и криптоспоридий (контрольный образец прилагается и находится в диагностическом наборе), предварительно ресуспендированный с помощью вортекса за 20 с.

Подсушить предметное стекло (слайд) SuperStick_ в потоке теплого (не горячего) воздуха или с помощью устройства для сушки предметных стекол (слайдов) (примерно 15-30 мин).

Б.1.8 Подготовка к иммунофлуоресцентному мечению

Растворить 1 таблетку таблетированного фосфатного буфера (6) в 100 см ³ дистиллированной воды.

Приготовить рабочий раствор DAPI: развести 1 мкл 500х-концентрированного раствора (7) из диагностического набора в 5 см ³ готового фосфатного (PBS) буфера. Рабочий раствор DAPI необходимо готовить в день выполнения исследования. Использовать только свежеприготовленный рабочий раствор DAPI. Избегать воздействия прямого солнечного света.

Примечание - Для фиксации цист и ооцист на предметном стекле (слайде) внести в каждое окно предметного стекла (слайда) по 45 мкл абсолютного метанола и высушить (примерно 30 мин). После фиксации метанолом интенсивность флуоресценции DAPI возрастает.

Б.1.9 Флуоресцентное и иммунофлуоресцентное мечение

Убедиться в завершении сушки предметного стекла (слайда). Внести в окна предметного стекла (слайда) 50 мкл рабочего раствора DAPI. Инкубировать при комнатной температуре приблизительно 1 мин. Внести в окна слайда 50-100 мкл моющего буфера SureRinse_ (8), подождать 1 мин. Осторожно наклонить предметное стекло (слайд) (узким краем вниз) и с помощью фильтровальной бумаги удалить моющий буфер, не касаться при этом поверхности окна предметного стекла (слайда).

Внести одну каплю (ок. 45 мкл) иммунореагента AquaGlo_ G/C (9) в окна предметного стекла (слайда). При необходимости, с помощью аппликатора или стеклянной палочки распределить реагент по лунке, не касаться при этом поверхности окна предметного стекла (слайда).

Поместить препараты в ячейку влажности и инкубировать не менее 25 мин при 37 °С или не менее 40 мин при комнатной температуре. Допускается более длительное время инкубации.

Внести в окна предметного стекла (слайда) 50-100 мкл моющего буфера SureRinse_ (8), подождать 1 мин. Осторожно наклонить предметное стекло (слайд) (узким краем вниз) и с помощью фильтровальной бумаги удалить моющий буфер, не касаться при этом поверхности окна предметного стекла (слайда).

Примечание - Чтобы снизить неспецифическую флюоресценцию и выделить контрастный фон для лучшего наблюдения зеленой флюоресценции цист и ооцист, используется следующая процедура: нанести по одной капле контрастирующего красителя (11) в каждую лунку, инкубировать 1 мин при комнатной температуре. Внести в окна предметное стекла (слайда) 50-100 мкл моющего буфера SureRinse_ (8), подождать 1 мин. Осторожно наклонить предметное стекло (слайд) (узким краем вниз) и с помощью фильтровальной бумаги удалить моющий буфер, не касаться при этом поверхности окна предметного стекла (слайда).

Разложить препараты на наклонном штативе для предметных стекол (слайдов), подсушить в токе теплого воздуха.

Нанести 1 каплю защитной среды (12) No-Fade_ в каждую лунку. Нанести покровное стекло.

Примечание - Меченые препараты должны храниться в темноте при температуре (5 3) °С. Не допускать замораживания. Меченые препараты, защищенные средой No-Fade_, могут храниться при температуре (5 3) °С в течение по крайней мере 6 месяцев.

Б.1.10 Люминесцентная микроскопия

Исследуют препараты не менее чем при 100-кратном общем увеличении на наличие яблочно-зеленой флюоресценции, микроскопируя все поля зрения лунки предметного стекла (слайда). При использовании каждой новой партии реагентов и перед началом микроскопии препаратов исследуемых проб следует предварительно просмотреть препарат положительного контроля, для чего используется контрольная суспензия с точно подсчитанными цистами лямблий и ооцистами криптоспоридий, прилагаемая в диагностическом наборе.

Результат:

- цисты лямблий - светящиеся и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических (от 10 до 18 мкм в диаметре), с ярко подсвеченными краями;

- ооцисты криптоспоридий - сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических (от 2,5 до 6 мкм в диаметре), с ярко подсвеченными краями.

Б.2 Санитарно-паразитологическое исследование пыли и воздуха в помещениях для осуществления внутрилабораторного контроля

Б.2.1 Отбор проб и подготовка к исследованию

Для сбора пыли используют камеру, представляющую собой металлический цилиндр длиной 110-120 мм с внутренним диаметром 27 мм [по ширине стандартного предметного стекла (слайда)]. В стенке цилиндра имеется всасывающее отверстие размером 2 x 25 мм. Внутри цилиндра укреплены 2 стержня, фиксирующие предметное стекло (слайд) в диаметральной плоскости и продольном направлении. С одного конца цилиндр закрывают съемной крышкой, а открытым концом присоединяют к патрубку пылесоса или другого всасывающего устройства (аспиратор, воздуходувка и т.п.).

На одну сторону чистого предметного стекла (слайда) наносят тонкий слой 50 %-ного раствора глицерина в виде полоски шириной 1,5-2,0 см и длиной 4-5 см. Предметное стекло (слайд) вставляют в камеру так, чтобы смазанная глицерином поверхность была обращена к всасывающему отверстию камеры. Камеру закрывают крышкой. Затем включают пылесос или другое всасывающее устройство и производят отбор пыли.

При отборе проб всасывающее отверстие камеры должно быть обращено к исследуемой поверхности и находиться на расстоянии 2-3 мм. Перемещать всасывающее устройство во время работы над поверхностью следует равномерно. На одну пробу собирают пыль с площади не менее 0,25 м ² в течение 20 с, воздуха - 60 с. После отбора пробы пылесос или другое всасывающее устройство выключают, открывают камеру и извлекают предметное стекло (слайд). На смазанной стороне предметного стекла (слайда) будет отчетливо виден пылевой след, представляющий собой готовый препарат, который микроскопируют (при увеличении x56-80). Если препарат получился плотным, его просветляют 1-2 каплями воды или 50 %-ного раствора глицерина. Под микроскопом среди пылевых частиц хорошо видны яйца гельминтов. Микроскопирование препаратов может производиться на обследуемом объекте сразу после отбора проб или в лаборатории.

Сбор проб пыли и воздуха непосредственно на предметное стекло (слайд), покрытое клейкой смазкой, исключает использование фильтров, центрифугирование, приготовление мазков и другие действия, во время которых могут быть потери яиц гельминтов или нарушение их целостности. Кроме того, использование клейких предметных стекол (слайдов) ускоряет время отбора проб и позволяет, что особенно важно при обследовании детских учреждений, просматривать предметные стекла на местах обследования. Последнее дает возможность на местах составлять план мероприятий по предупреждению загрязнения и дегельминтизации внешней среды.

Б.2.2 Исследование пыли и воздуха на яйца гельминтов. Метод Каледина и Романенко (1982)

Для отбора и исследования проб пыли используют липкую прозрачную целлофановую ленту (скотч) со слоем клея до 3 мм.

Ленту шириной 20 мм и длиной 7-8 см приклеивают липким слоем к разным участкам исследуемой поверхности 6-8 раз, в зависимости от запыленности объекта, а затем ее помещают на предметное стекло (слайд). Липкой лентой нельзя делать отбор проб пыли с бумажных поверхностей (книги), мягких игрушек и очень загрязненных предметов (половики, коврики).

При проведении исследования ленту отклеивают на участках микроскопирования и вносят под нее несколько капель касторового или вазелинового масла (для устранения пузырьков воздуха), исследуют при малом увеличении микроскопа. Препарат может храниться несколько дней.