Методические указания по диагностике гельминтозов животных (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 29 апреля 1980 г.)

Точный прижизненный диагноз на гельминтозы позволяют поставить лабораторные исследования взятого от животных материала и обнаружение в нем яиц и личинок гельминтов. Чаще всего используют пробы фекалий, реже - мочи, кожи, содержимого конъюнктивальных полостей, соскобы перианальных складок и т.д. Исследование фекалий называют гельминтокопроскопией.

В стационарно неблагополучной по каким-либо гельминтозам местности проведение обследований животных планируют в рациональные сроки с учетом климатических особенностей зоны. Указания о сроках дают зональные научно-исследовательские ветеринарные учреждения, кафедры паразитологии ветеринарных институтов или факультетов.

В случае появления у животных заболевания учитывают клинические признаки и эпизоотологические особенности болезни и направляют материал в ветеринарную лабораторию для подтверждения или исключения гельминтологического диагноза. Если при обследовании животных яйца или личинки гельминтов не найдены, а клинические признаки дают основания заподозрить гельминтоз, через месяц проводят повторное лабораторное исследование этой группы животных.

Посмертный диагноз ставят после вскрытия трупов, вынужденно убитых животных или убоя 2-3 животных, проявляющих клинические признаки заболевания, при этом учитывают патолого-анатомические изменения и результаты гельминтологического исследования внутренних органов.

1. Лабораторная (копроскопическая) диагностика

1.1. Оборудование и средства, необходимые для исследования

Микроскоп биологический (с наклонным тубусом); предметные стекла; чашки Петри; стаканчики стеклянные или из синтетического материала с верхним диаметром не более 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса с делениями на 30 мл, полный объем - 50 мл); фильтрационные ситечки с металлической или капроновой сеткой (из чулочной ткани), величина сторон ячеек которой должна быть 0,25-0,3 мм; стеклянные палочки; металлические петли с диаметром кольца 8-10 мм; растворы азотнокислого свинца плотностью 1,5, гранулированной или обычной аммиачной селитры плотностью 1,3, сернокислого цинка плотностью 1,24; глицерин; гидрофильный целлофан; денсиметр для проверки плотности флотационного раствора; аппарат Бермана.

1.2. Приготовление флотационных растворов

Наилучшей флотационной способностью растворы обладают при температуре 20-22°. Перед применением плотность раствора уточняют денсиметром. Для этого в стеклянный цилиндр наливают раствор и опускают в него один из денсиметров с указанием необходимой плотности. Если соответствующее деление на денсиметре нужной плотности совпадает с уровнем поверхности раствора, значит приготовлен раствор необходимой плотности. Если деление ниже уровня мениска жидкости, раствор имеет недостаточную плотность и наоборот. В этом случае раствор доводят до нужной плотности, добавляя соль или воду.

Раствор азотнокислого свинца (нитрата свинца) плотностью 1,5 готовят из расчета 650 г на 1 л воды. Соль растворяют в горячей воде в эмалированном ведре при постоянном размешивании и подогревании. Фильтрация необязательна.

Раствор гранулированной или обычной аммиачной селитры (нитрата аммония) плотностью 1,3 готовят так же, как и предыдущий, но из расчета 1500 г на 1 л воды.

Раствор сернокислого цинка (сульфата цинка) плотностью 1,24 готовят так же, как и первый раствор, но из расчета 400 г на 1 л воды. Применяют для диагностики диктиокаулезов жвачных.

1.3. Взятие, доставка и отбор проб фекалий

Пробы массой 10 г берут рукой в резиновой перчатке из прямой кишки или из только что выделившихся при испражнении фекалий. В последнем случае берут верхнюю часть экскрементов, не соприкасавшуюся с полом или почвой. Руку после взятия пробы моют в ведре с теплой водой, которую меняют после взятия 20-25 проб. Пробы берут от 10% поголовья комплекса, фермы, отделения, отары или возрастной группы, но не менее чем от 30-50 животных каждой группы; дойное стадо коров обследуют поголовно. Пробы доставляют в лабораторию в целлофановых мешочках или в упаковке из пергаментной бумаги, в сопроводительном документе указывают хозяйство или комплекс, отделение, цех, отару, вид и число животных в отделении, цехе, отаре, предполагаемый гельминтоз и дату взятия проб, номера или клички животных (на упаковке и в описи). Пробы в лабораторию доставляют не позже чем через сутки со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез в теплое время года проба должна быть доставлена в лабораторию в течение 4 ч. Если не удается провести исследование на диктиокаулез в день взятия материала, то пробы кладут в холодильник или ледник с температурой 2-5°, с тем чтобы задержать развитие личинок стронгилят пищеварительного тракта, яйца которых почти всегда имеются в фекалиях жвачных.

Для отбора проб фекалий массой 3 г вначале необходимо провести их взвешивание, чтобы натренироваться в определении массы по величине пробы. В дальнейшем взвешивать пробы не обязательно.

В условиях жаркого климата, когда температура воздуха поднимается до 40°, пробы фекалий, присланные для исследования на диктиокаулез, предварительно охлаждают до 20-25° или исследуют рано утром.

1.4. Проведение исследований

Рекомендуются следующие наиболее эффективные и несложные по технике выполнения методы исследований.

1.4.1. Гельминтоовоскопия

Пробы фекалий животных подвергают специальной обработке, позволяющей обнаружить и определить яйца возбудителей гельминтозов.

Флотация с раствором азотнокислого свинца (по Котельникову и Хренову). Пробу фекалий (3 г) кладут в стаканчик, заливают небольшим количеством раствора азотнокислого свинца и тщательно размешивают палочкой. При размешивании добавляют раствор порциями до объема 50 мл. Затем взвесь фильтруют через чистое ситечко в другой стаканчик. Профильтрованную взвесь при исследовании на фасциолез и парамфистоматозы оставляют стоять 15-20 мин, на другие гельминтозы - не менее чем на 10 мин. Прикосновением металлической петли к поверхности взвеси снимают 3-4 капли с разных мест и переносят на предметное стекло для микроскопии (при малом увеличении: окуляр 7 или 10, объектив 8) с целью обнаружения яиц гельминтов. Металлическую петлю перед исследованием каждой пробы фламбируют или последовательно промывают водой в двух банках (воду в банках меняют после исследования 50 проб). Чтобы не допустить быстрого высыхания и кристаллизации капель на предметных стеклах (когда исследование проводят в жаркое время года и при низкой влажности, а также в том случае, когда готовят большое количество препаратов для исследования), к каждой капле, снятой с поверхности взвеси, добавляют каплю глицерина, разведенного пополам с водой. Яйца фасциол и парамфистомат в растворе слегка деформируются, при этом яйца фасциол приобретают форму полумесяца или овала с тупыми углами и легко обнаруживаются благодаря золотистой или коричневой окраске. При добавлении капли дистиллированной воды к препарату форма яиц восстанавливается.

Метод применяют главным образом при исследовании жвачных на фасциолез, дикроцелиоз, парамфистоматозы, а также на мониезиозы, стронгилятозы пищеварительного тракта, трихоцефалез, стронгилоидоз, свиней - на аскаридоз, эзофагостомоз, трихоцефалез, метастронгилезы, стронгилоидоз и макраканторинхоз, лошадей - на параскаридоз, стронгилидозы и стронгилоидоз.

Флотация с раствором гранулированной или обычной аммиачной селитры (по Котельникову и Хренову). Техника выполнения такая же, как и при флотации с нитратом свинца. Профильтрованную взвесь оставляют для флотации на 10 мин. Применяют для диагностики аскаридоза, трихоцефалеза, эзофагостомоза, стронгилоидоза, а также метастронгилезов свиней, неоаскаридоза, стронгилятозов пищеварительного тракта, трихоцефалеза, стронгилоидоза, мониезиоза и тизаниезиоза жвачных, параскаридоза, стронгилятозов и стронгилоидоза лошадей, токсаскаридоза и токсокароза собак и других плотоядных.

Седиментация с последовательным промыванием. Пробу фекалий (3 г) кладут в стаканчик, заливают небольшим количеством воды и тщательно размешивают палочкой, затем добавляют воду порциями до объема 50 мл при постоянном размешивании. Смесь фильтруют через чистое ситечко в другой стаканчик и отстаивают до образования осадка. Затем верхний слой сливают или отсасывают грушей до осадка, добавляют такое же количество воды и повторяют процедуру до тех пор, пока надосадочный слой не станет прозрачным. Верхний слой сливают, а осадок разливают на предметное стекло и микроскопируют с целью обнаружения яиц гельминтов. Применяют или диагностики фасциолеза, парамфистоматозов и дикроцелиоза жвачных.

Седиментация с целлофановыми пленками (по Котельникову и Хренову). Готовят полоски гидрофильного целлофана размером 3х2 см, помещают их в чашки Петри с 50%-ным раствором глицерина или молочной кислоты и выдерживают 24 ч. Хранят полоски в чашках Петри в указанных растворах.

Пробу фекалий (2 г) кладут в стаканчик с небольшим количеством воды и размешивают, добавляя воду до объема 50 мл. Затем взвесь фильтруют в другой стаканчик через ситечко и после 5-минутного отстаивания сливают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют воду до объема 50 мл и таким же способом промывают осадок еще раз. После сливания надосадочного слоя осадок помещают на одно или несколько предметных стекол и покрывают обработанными целлофановыми пленками, которые просветляют препарат и предохраняют его от высыхания. Через 10 мин препарат микроскопируют. Пигментированные яйца гельминтов легко обнаруживаются.

Метод применяют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют золотистую, коричневую или желтую окраску (фасциолез, дикроцелиоз, неоаскаридоз жвачных, трихоцефалезы жвачных и свиней, аскаридоз свиней, параскаридоз лошадей и др.).

Метод комбинированный (в модификации Котельникова и Хренова). Пробу фекалий (3 г) кладут в стаканчик, вливают небольшое количество воды и тщательно размешивают палочкой, добавляя воду порциями до объема 50 мл. Смесь фильтруют через ситечко в другой стаканчик и отстаивают 5 мин. Верхний слой сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку, куда наливают раствор гранулированной аммиачной селитры плотностью 1,3 и центрифугируют 1-2 мин. Затем металлической петлей снимают 3 капли с поверхности взвеси и переносят на предметное стекло для микроскопирования (окуляр 7 или 10, объектив 8) с целью обнаружения яиц гельминтов. Металлическую петлю перед исследованием каждой пробы фламбируют или последовательно промывают водой в двух банках (воду в банках меняют после исследования 50 проб). Применяют для диагностики в основном метастронгилезов свиней, при этом обнаруживаются яйца аскарид, трихоцефалюсов и других нематод.

1.4.2. Гельминтоларвоскопия

Гельминтоларвоскопию применяют для диагностики диктиокаулезов, мюллериоза и других протостронгилидозов, а также стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных и стронгилоидозов разных животных.

Метод Бермана и Орлова. Пробы фекалий (10 г) помещают в воронки аппарата Бермана на металлической сетке или завернутыми в кусочки марли. Предварительно воронки заливают водой комнатной температуры. Заполненный пробами аппарат оставляют при комнатной температуре на 3-6 ч. За это время личинки диктиокаулюсов выползают из пробы в жидкость и опускаются по трубке на дно пробирки. Затем осторожно отсоединяют резиновые трубки и быстрым движением, не встряхивая осадок на дне, сливают жидкость из каждой пробирки до осадка (можно отсасывать воду пипеткой). Пробирки ставят в штатив. Осадок после встряхивания разливают на предметные стекла и микроскопируют при малом увеличении. Личинки нематод подвижны, легко обнаруживаются. Вместо воронок в аппарате Бермана можно использовать резиновые груши со срезанным дном, в которые закладывают пробы. К наконечникам прикрепляют гельминтологические пробирки или же перекрывают их зажимами Мора.

Упрощенная модификация метода Бермана (по Шильникову). В стаканчики с водой кладут пробы, завернутые в марлевые салфетки. Через 3-6 ч пробы вынимают, жидкость отстаивают 10-15 мин. Стаканчики медленно наклоняют и сливают до появления мути. Остаток жидкости отстаивают 5-10 мин, после чего стаканчики наклоняют и из их пипеткой отсасывают прозрачный слой воды, пока не начнет всасываться осадок на дне. Затем капли осадка пипеткой наносят на предметное стекло для микроскопии. Если осадок получается густой, то в стаканчик наливают воду и взмучивают, затем отстаивают 10 мин, после чего верхний слой жидкости сливают. Пипетку после взятия каждой пробы тщательно промывают водой в двух банках (воду в банках меняют после исследования 50 проб).

Седиментация с центрифугированием (экспресс-методика по Котельникову, Корчагину и Хренову). Пробы фекалий (3-5 г) от овец и коз кладут в пробирки с водой температурой 20-22°. Пробирки центрифугируют со скоростью 1000-1500 об/мин в течение 2 мин. Затем пробы вынимают пинцетом, воду сливают до осадка, а осадок, встряхнув, выливают на предметное стекло и исследуют под микроскопом на наличие личинок диктиокаулюсов, мюллериусов и других протостронгилид.

Методика Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец, коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°. Если шарики помещают на предметное стекло, то достаточно несколько капель воды. Через 40 мин шарики удаляют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроскопом на наличие личинок нематод. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные.

Флотация с раствором сульфата цинка - избирательный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза (по Котельникову и Хренову). Пробы фекалий овец и коз (5 г) кладут в стаканчики с раствором сульфата цинка, энергично разгоняют по кругу палочкой в течение 1-2 мин, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин после разгонки пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической петлей (диаметром 8 мм) снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют на наличие личинок диктиокаулюсов.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также кладут в стаканчики с раствором сульфата цинка и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешивания. Затем (при необходимости) их удаляют, через несколько минут снимают 6 капель с поверхностной пленки и микроскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной пленке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избирательностью в отношении личинок диктиокаулюсов (личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов деформируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спиралью и напоминают пузырьки воздуха).

Дифференциальная диагностика диктиокаулезов. В тех случаях, когда в материале, исследуемом по Берману, Вайда или седиментацией, обнаружены личинки разных стронгилят, проводят дифференциальную диагностику по избирательной способности живых личинок к окраске. К осадку (в пробирке или на часовом стекле) добавляют 1-2 капли 0,1%-ного водного раствора метиленового синего. Через 20-30 с препарат микроскопируют. Личинки диктиокаулюсов окрашиваются в сиреневый цвет. Личинки других нематод не окрашиваются.

1.4.3. Гельминтоскопия

Гельминтоскопию применяют в основном для диагностики цестодозов жвачных, лошадей, плотоядных и птиц в течение эпизоотического сезона одним из следующих способов.

Осмотр свежевыделенных фекалий рано утром или после дневного отдыха на пастбище с целью обнаружения и сбора члеников цестод с последующим определением их (осматривают фекалии не менее чем от 5-10% животных).

Ректальный способ. Из стада отбирают от 50 до 100 животных. Ветеринарный работник одним или двумя пальцами правой руки (в резиновой перчатке) извлекает из прямой кишки порции фекалий и просматривает их на наличие члеников; для отбора члеников авителлин следует пользоваться ручной лупой, держа ее в левой руке (членики очень мелкие). Помимо этого, фекалии от овец добывают также с помощью влагалищного зеркала. Для этого животное фиксируют, резиновой спринцовкой вливают в прямую кишку 100-150 мл охлажденной воды, после чего вводят влагалищное зеркало. При раскрытии зеркала шарики свободно выходят. Собранные в кювет шарики осматривают на наличие члеников. Перед следующим взятием фекалий от другой овцы руки и влагалищное зеркало промывают в дезинфицирующем растворе. Членики цестод располагаются на поверхности фекальных шариков.