Откройте актуальную версию документа прямо сейчас
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Вход
Купить систему ГАРАНТ
Получить демо-доступ
Узнать стоимость
Информационный банк
Подобрать комплект
Семинары
- Главная
- Межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2022 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 октября 2022 г. N 1133-ст) (с изменениями и дополнениями)
- Приложение Б (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов
Приложение Б (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов
Приложение Б
(обязательное)
Состав
и приготовление питательных сред и реактивов
Б.1 Селективные среды первичного обогащения
Б.1.1 Полуконцентрированный бульон Фразера (Half Fraser broth)
Б.1.1.1 Основа среды
Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани) ... 5,0 г
триптон (ферментативный гидролизат казеина) ... 5,0 г
мясной экстракт ... 5,0 г
дрожжевой экстракт ... 5,0 г
хлорид натрия ... 20,0 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный ... 12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г
эскулин ... 1,0 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве, необходимом для проведения анализа (см. Б.10.1), и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Примечание - Раствор хлорида лития и раствор налидиксовой кислоты могут быть добавлены в основу до стерилизации.
Б.1.1.2 Растворы селективных добавок
Б.1.1.2.1 Раствор хлорида лития
Состав:
хлорид лития ... 3,0 г
дистиллированная вода ... 10,0 см 3
Приготовление
Хлорид лития растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Предупреждение - Необходимо принимать все меры предосторожности при растворении хлорида лития в воде, так как реакция является экзотермической. Раствор хлорида лития раздражает слизистую оболочку.
Б.1.1.2.2 Раствор натриевой соли налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,1 г
0,05 моль/дм 3 раствора гидроксида натрия ... 10,0 см 3
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в растворе гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид ... 0,25 г
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Акрифлавин гидрохлорид растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.4 Раствор цитрата аммонийного железа (III)
Состав:
цитрат аммонийного железа (III) ... 5,0 г
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Цитрат аммонийного железа (III) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.1.1.1) ... 100 см 3
раствор хлорида лития (см. Б.1.1.2.1) ... 1,0 см 3
раствор натриевой соли налидиксовой кислоты (см. Б.1.1.2.2) ... 0,1 см 3
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.1.1.2.3) ... 0,5 см 3
раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.1.1.2.4) ... 1,0 см 3
Приготовление
В основу среды добавляют четыре раствора селективных добавок непосредственно перед использованием.
Б.1.2 Селективный накопительный бульон (UVM)
Состав:
триптоза ... 10,0 г
мясной экстракт ... 5,0 г
дрожжевой экстракт ... 5,0 г
хлористый натрий ... 20,0 г
фосфорнокислый натрий двузамещенный ... 12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г
эскулин ... 1,0 г
налидиксовая кислота ... 20,0 мг
акрифлавин гидрохлорид ... 12,0 мг
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH. Разливают среду в колбы или во флаконы соответствующего объема в количестве 225 см 3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I)
Б.1.3.1 Основа среды
Состав:
гидролизат казеина ферментативный ... 10,0 г
пептон мясной ферментативный ... 15,0 г
гидролизат дрожжей автолизованных ... 2,0 г
хлорид натрия ... 3,5 г
хлорид лития ... 3,0 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают среду в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота ... 10 мг
акрифлавин ... 5 мг
полимиксин В сульфат ... 5 мг
стерильная дистиллированная вода ... 10 см 3
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.2 Селективные среды вторичного обогащения
Б.2.1 Бульон Фразера (Fraser broth)
Б.2.1.1 Основа среды
Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани) ... 5,0 г
триптон (ферментативный гидролизат казеина) ... 5,0 г
мясной экстракт ... 5,0 г
дрожжевой экстракт ... 5,0 г
хлорид натрия ... 20,0 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный ... 12,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г
эскулин ... 1,0 г
хлорид лития ... 3,0 г
натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,1 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая ее при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве необходимом для проведения анализа и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.2.2 Селективный накопительный бульон (UVM II)
Б.2.2.1 Основа среды
Согласно Б.1.2.
Б.2.2.2 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид ... 13 мг
стерильная дистиллированная вода ... 10 см 3
Приготовление
Акрифлавин гидрохлорид растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II)
Б.2.3.1 Основа среды
Согласно Б.1.3.
Б.2.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота ... 10 мг
акрифлавин гидрохлорид ... 5 мг
полимиксин В сульфат ... 5 мг
стерильная дистиллированная вода ... 5 см 3
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорид и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.2.3.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.2.3.1) ... 1000 см 3
раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) ... 4,44 см 3
Приготовление
В основу среды (см. Б.2.3.1) добавляют раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) и разливают в стерильные пробирки по 10 см 3. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.2.4 Бульон для обогащения Listeria monocytogenes (LMX Broth)
Б.2.4.1 Основа среды
Состав:
ферментативный перевар животных тканей (бычьих/свиных) ... 5 г
ферментативный перевар казеина (бычий) ... 5 г
мясной экстракт (бычий/свиной) ... 5 г
дрожжевой экстракт ... 5 г
буфер ... 18,32 г
смесь солей ... 11 г
глюкоза ... 2 г
акрифлавин гидрохлорид ... 0,005 г
налидиксовая кислота ... 0,01 г
очищенная вода ... 1000 см 3
Б.2.4.2 Раствор селективной добавки
Состав:
цефалексин ... 1 %
фосфомицин ... 1 %
смесь антибиотиков/противогрибковых препаратов ... > 2 %
Б.3 Селективные плотные среды для пересева
Б.3.1 Первая среда
Б.3.1.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA)
Б.3.1.1.1 Основа среды
Состав:
ферментативный перевар животного белка ... 18,0 г
панкреатический гидролизат казеина ... 6,0 г
дрожжевой экстракт ... 10,0 г
пируват натрия ... 2,0 г
глюкоза ... 2,0 г
глицерофосфат магния ... 1,0 г
сульфат магния (безводный) ... 0,5 г
хлорид натрия ... 5,0 г
хлорид лития ... 10,0 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный) ... 2,5 г
5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид ... 0,05 г
агар ... 12,0-18,0 г *
------------------------------
*В зависимости от плотности среды.
------------------------------
дистиллированная вода ... 930 см 3 **
------------------------------
**925 , если используют раствор амфотерицина В.
------------------------------
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.1.1.2 Растворы селективных добавок
Б.3.1.1.2.1 Раствор налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,02 г
0,05 моль/дм 3 раствора гидроксида натрия ... 5,0 см 3
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см 3 0,05 моль/дм 3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.1.1.2.2 Раствор цефтазидима
Состав:
цефтазидим ... 0,02 г
дистиллированная вода ... 5,0 см 3
Приготовление
Цефтазидим растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.2.3 Раствор полимиксина В сульфата
Состав:
полимиксин В сульфат ... 76700,0 е.а.
дистиллированная вода ... 5,0 см 3
Приготовление
Полимиксин В сульфат растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3 Растворы антибиотиков
Б.3.1.1.3.1 Раствор цикпогексимида
Состав:
циклогексимид ... 0,05 г
этанол ... 2,5 см 3
дистиллированная вода ... 2,5 см 3
Приготовление
Циклогексимид растворяют в 2,5 см 3 этанола, затем добавляют 2,5 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3.2 Раствор амфотерицина В (используется как альтернатива для раствора цикпогексимида)
Состав:
амфотерицин В ... 0,01 г
1 моль/дм 3 раствора соляной кислоты ... 2,5 см 3
диметилформамид (DMF) ... 7,5 см 3
Приготовление
Амфотерицин растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.
Б.3.1.1.4 Дифференциальная добавка
Состав:
L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636
) * ... 2,0 г
------------------------------
*Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
------------------------------
холодная дистиллированная вода ... 50 см 3
Приготовление
L--фосфатидилинозитол (Sigma Р 6636
) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автокпавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47
2) °C.
Б.3.1.1.5 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.1.1.1) ... 930,0 см 3 *
------------------------------
*925 , если используют раствор амфотерицина В.
------------------------------
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) ... 5,0 см 3
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) ... 5,0 см 3
раствор полимиксина В сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) ... 5,0 см 3
раствор цикпогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) ... 5,0 см 3
или амфотерицина В (см. Б.3.1.1.3.2) ... 10,0 см 3
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) ... 50,0 см 3
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.
pH готовой среды должен составлять (7,2 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см 3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.1.2 Оценка качества первой среды
Определение селективности и продуктивности питательной среды необходимо проводить согласно ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2 Вторая селективная среда для посева
Б.3.2.1 Оксфорд агар (Oxford agar)
Б.3.2.1.1 Основа среды
Состав:
пептон ... 23,0 г
крахмал ... 1,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
эскулин ... 1,0 г
цитрат аммонийного железа (III) ... 0,5 г
хлорид лития ... 15,0 г
агар ... 9,0-18,0 г **
------------------------------
**В зависимости от плотности среды.
------------------------------
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.1.2 Раствор селективной добавки
Состав:
циклогексимид ... 400,0 мг
сульфат колистина (полимиксин Е) ... 20,0 мг
акрифлавин гидрохлорид ... 5,0 мг
цефотетан ... 2,0 мг
фосфомицин ... 10,0 мг
этанол ... 5,0 см 3
дистиллированная вода ... 5,0 см 3
Приготовление
Компоненты добавки растворяют в смеси этанола и воды. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.1.3 Готовая среда
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 2) °C основу среды (см. Б.3.2.1.1) добавляют, тщательно перемешивая, раствор селективной добавки (см. Б.3.2.1.2).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см 3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2.2 Палкам агар (PALCAM agar)
Б.3.2.2.1 Основа среды
Состав:
пептон ... 23,0 г
крахмал ... 1,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
дрожжевой экстракт ... 3,0 г
D-глюкоза ... 0,5 г
D-маннит ... 10,0 г
эскулин ... 0,8 г
цитрат аммонийного железа (III) ... 0,5 г
феноловый красный ... 0,08 г
хлорид лития ... 15,0 г
агар ... 9,0-18,0 г *
------------------------------
*В зависимости от плотности среды.
------------------------------
дистиллированная вода ... 960,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.2.2 Раствор полимиксина В сульфата
Состав:
полимиксин В сульфат (100000 е.а.) ... 0,1 г
дистиллированная вода 100 см 3
Приготовление
Растворяют полимиксин В сульфат в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид ... 0,05 г
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Растворяют акрифлавин гидрохлорид в дистиллированной воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.4 Раствор пентагидрата цефтазидима натрия
Состав:
пентагидрат цефтазидима натрия ... 0,116 г
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Растворяют пентагидрат цефтазидима натрия в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.5 Готовая среда
Состав:
основа агара ... 960,0 см 3
раствор полимиксин В сульфата ... 10,0 см 3
раствор акрифлавина гидрохлорида ... 10,0 см 3
раствор пентагидрата цефтазидима натрия ... 20,0 см 3
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до (47 2) °C основу среды (см. Б.3.2.2.1), добавляют, тщательно перемешивая, растворы добавок (см. Б.3.2.2.2, Б.3.2.2.3).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см 3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2.3 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ)
Б.3.2.3.1 Основа среды
Состав:
гидролизат казеина панкреатический ... 10,0 г
гидролизат рыбной муки панкреатический ... 15,0 г
гидролизат автолизованных дрожжей ... 2,0 г
хлорид натрия ... 3,5 г
хлорид лития ... 15,0 г
цитрат аммонийного железа ... 0,5 г
эскулин ... 0,8 г
агар ... 13,0 г
дистиллированная вода ... до 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают pH (7,0 0,2) ед. pH и стерилизуют в автоклаве при температуре (121
1) °C в течение 15 мин.
Б.3.2.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота ... 20 мг
акрифлавин гидрохлорид ... 10 мг
полимиксин В сульфат ... 10 мг
стерильная дистиллированная вода ... 10 см 3
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильном физиологическом растворе.
Б.3.2.3.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.2.3.1) ... 1000 см 3
раствор селективной добавки (см. Б.3.2.3.2) ... 4,44 см 3
Приготовление
К расплавленной основе среды добавляют с соблюдением правил асептики раствор селективной добавки. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.3.2.4 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar)
Б.3.2.4.1 Основа среды
Состав:
пептон ... 18,5 г
дрожжевой экстракт ... 4,0 г
хлорид натрия ... 9.5 г
пируват натрия ... 2,0 г
хлорид лития ... 15,0 г
мальтоза ... 4,0 г
5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид ... 0,2 г
агар ... 14,0 г
дистиллированная вода ... 930 см 3 *
------------------------------
*925 , если используют раствор амфотерицина В.
------------------------------
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.4.2 Растворы селективных добавок
Б.3.2.4.2.1 Раствор налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,02 г
0,05 моль/дм 3 раствора гидроксида натрия ... 5,0 см 3
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см 3 0,05 моль/дм 3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.2.4.2.2 Раствор цефтазидима
Состав:
цефтазидим ... 0,02 г
дистиллированная вода ... 5,0 см 3
Приготовление
Цефтазидим растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.2.3 Раствор полимиксина В сульфата
Состав:
полимиксин В сульфат ... 76700,0 е.а.
дистиллированная вода ... 5,0 см 3
Приготовление
Полимиксин В сульфат растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.3 Растворы антибиотиков
Б.3.2.4.3.1 Раствор цикпогексимида
Состав:
циклогексимид ... 0,05 г
этанол ... 2,5 см 3
дистиллированная вода ... 2,5 см 3
Приготовление
Циклогексимид растворяют в 2,5 см 3 этанола, затем добавляют 2,5 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.3.2 Раствор амфотерицина В (используют, как альтернативу для раствора цикпогексимида)
Состав:
амфотерицин В ... 0,01 г
1 моль/дм 3 раствора соляной кислоты ... 2,5 см 3
диметилформамид (DMF) ... 7,5 см 3
Приготовление
Амфотерицин В растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.
Б.3.2.4.4 Дифференциальная добавка
Состав:
L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636
) * ... 2,0 г
------------------------------
*Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
------------------------------
холодная дистиллированная вода ... 50,0 см 3
Приготовление
L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636
) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автокларируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47
2) °C.
Б.3.2.4.5 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.1.1.1) ... 933,0 см 3 *
------------------------------
*925 , если используют раствор амфотерицина В.
------------------------------
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) ... 5,0 см 3
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) ... 5,0 см 3
раствор полимиксина В сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) ... 5,0 см 3
раствор цикпогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) ... 5,0 см 3
или амфотерицина В (см. Б.3.1.1.3.2) ... 10,0 см 3
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) ... 50,0 см 3
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.
pH готовой среды должен составлять (7,2 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см 3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.4 Питательные среды, используемые для изучения культурально-морфологических свойств
Б.4.1 Плотные питательные среды
Б.4.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
Состав:
триптон или панкреатический гидролизат казеина ... 17,0 г
соевый пептон ... 3,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный ... 2,5 г
глюкоза ... 2,5 г
дрожжевой экстракт ... 6,0 г
агар ... 9,0-18,0 г **
------------------------------
**В зависимости от плотности среды.
------------------------------
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,3 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду необходимого объема разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Скашивают агар. Для приготовления чашек с агаром готовую среду разливают в стерильные чашки Петри в объеме, необходимом для проведения теста. Дают агару застыть.
Б.4.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA)
Состав:
триптон ... 15,0 г
соевый пептон ... 5,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
агар ... 5,0 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. Устанавливают pH (7,3 0,2) ед. pH и стерилизуют при температуре (121
1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду разливают в чашки Петри и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.1.3 Мясопептонный агар (МПА)
Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.4.2 Жидкие питательные среды
Б.4.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)
Состав:
триптон или панкреатический гидролизат казеина ... 17,0 г
соевый пептон ... 3,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный ... 2,5 г
глюкоза ... 2,5 г
дрожжевой экстракт ... 6,0 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121
1) °C в течение 15 мин.
Б.4.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB)
Состав:
триптон ... 17,0 г
соевый пептон ... 3,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
калий фосфорнокислый однозамещенный ... 2,5 г
декстроза ... 2,5 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121
1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ)
Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.5 Среда для определения -гемолитической активности
Б.5.1 Кровяной агар
Б.5.1.1 Основа среды (вариант 1)
Состав:
мясной пептон ... 15,0 г
печеночный перевар ... 2,5 г
дрожжевой экстракт ... 5,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
агар ... 9,0-18,0 г *
------------------------------
*В зависимости от плотности среды.
------------------------------
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая на водяной бане. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121
1) °C в течение 15 мин.
Б.5.1.2 Основа среды (вариант 2)
Состав и приготовление согласно ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.5.1.3 Дефибринированная кровь барана
Приготовление.
В стерильную колбу со стеклянными бусами вливают 8 см 3 только что взятой крови барана и непрерывно встряхивают в течение 10-15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться и может храниться при температуре (4 1) °C в течение одной недели.
Б.5.1.4 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) ... 100 см 3
дефибринированная кровь барана ... 5,0-7,0 см 3
Приготовление
В основу среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), охлажденную на водяной бане до температуры (47 2) °C, добавляют дефибринированную кровь барана (см. Б.5.1.3). Среда должна иметь pH (7,2
0,2) ед. pH.
Готовую среду осторожно перемешивают и разливают в чашки Петри (не более 10 см 3 на чашку) и после затвердения агара подсушивают его при температуре (47 2) °C в течение 30 мин или в ламинарном боксе в течение 1-2 ч или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.
Среду в чашках хранят при температуре (4 1) °C не более двух суток.
Слой агара в чашке Петри должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Для посева должна использоваться подсушенная среда.
Б.6 Суспензия из эритроцитов барана для определения гемолитической активности
Приготовление
Кровь из яремной вены барана отбирают в стерильную банку с бусами и дефибринируют (см. Б.5.1.3). Эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 1000-2000 об/мин в течение 5-10 мин соответственно. После последнего центрифугирования надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Красный цвет жидкости (гемолиз) свидетельствует о непригодности эритроцитов к применению. Отмытые эритроциты барана необходимо хранить при температуре (3 2) °C не более двух суток.
Если гемолиз эритроцитов барана не наблюдается, необходимо внести 2 см 3 кровяных телец в 98 см 3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11).
Если гемолиз эритроцитов наблюдается, необходимо внести около 4 см 3 слоя кровяных телец в 10 см 3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и осторожно перемешать, а затем центрифугировать. Если жидкость на поверхности стала четко красного цвета благодаря выраженному гемолизу, не допускается использование такой суспензии эритроцитов, она должна утилизироваться.
Суспензию эритроцитов барана необходимо хранить при температуре (3 2) °C не более пяти суток.
Б.7 Среды для определения ферментативных свойств
Б.7.1 Бульон с бромкрезоловым пурпурным
Б.7.1.1 Основа среды
Состав:
протеозный пептон ... 10,0 г
мясной экстракт ... 1,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
бромкрезоловый пурпурный ... 0,02 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,8 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.7.1.2 Растворы углеводов
Состав:
углевод * ... 5,0 г
------------------------------
*L-рамноза, D-ксилоза.
------------------------------
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Каждый из углеводов отдельно растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.7.2 Среды Гисса
Состав и приготовление в соответствии с ГОСТ 10444.1.
Углеводы: L-рамноза, D-ксилоза.
Б.8 Агар для определения подвижности культуры микроорганизма
Состав:
ферментативный гидролизат казеина ... 20,0 г
пептон ... 6,1 г
агар-агар ... 3,5 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,3 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема в количестве 5 см 3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.9 Среды для проведения КАМП-теста (CAMP)
Для проведения КАМП-теста могут быть использованы чашки Петри с кровяным агаром (см. Б.5.1), но предпочтительнее использовать чашки с двойным слоем: среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) и тонкого слоя кровяного агара (см. Б.5.1).
Среду (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) разливают примерно по 10 см 3 в стерильные чашки Петри и дают застыть. Затем очень тонким слоем заливают кровяной агар (см. Б.5.1), но не более 3 см 3 на чашку. Дают агару застыть.
Если кровяной агар (см. Б.5.1) вносится в заранее приготовленные чашки со средой (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), то перед тем, как внести ее, необходимо прогреть эти чашки в течение 20 мин в термостате при температуре 37 °C.
Б.10 Среда для определения лецитиназной активности
Б.10.1 Лецитин-агар с активированным углем
Б.10.1.1 Основа среды
Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки ... 15,0 г
панкреатический гидролизат казеина ... 10,0 г
экстракт дрожжевой ... 2,0 г
натрий хлорид ... 3,5 г
глюкоза ... 1,0 г
агар ... 10,0 2,0 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.1.2 Активированный уголь
Активированный уголь растирают до порошкообразного состояния.
Б.10.1.3 Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см 3 стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
Б.10.1.4 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.10.1.1) ... 100 см 3
активированный уголь (см. Б.10.1.2) ... 0,5 г
желточная эмульсия (см. Б.10.1.3) ... 5 см 3
Приготовление
Расплавленную основу среды (см. Б.10.1.1) охлаждают до температуры (47 2,0) °C, добавляют активированный уголь (см. Б.10.1.2) и желточную эмульсию (см. Б.10.1.3), тщательно перемешивают и разливают по (20
5) см 3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37
1) °C в течение (40
5) мин.
Б.10.2 Лецитин-агар без угля
Б.10.2.1 Основа среды
Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки ... 15,0 г
панкреатический гидролизат казеина ... 10,0 г
экстракт дрожжевой ... 2,0 г
натрий хлорид ... 3,5 г
глюкоза ... 1,0 г
агар ... (10,0 2,0) г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.2.2 Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см 3 стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
Б.10.2.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.10.2.1) ... 100 см 3
желточная эмульсия (см. Б.10.2.2) ... 5 см 3
Приготовление
Расплавленную основу среды (см. Б.10.2.1) охлаждают до температуры (47 2,0) °C, добавляют желточную эмульсию (см. Б.10.2.2), тщательно перемешивают и разливают по (20
5) см 3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37
1) °C в течение (40
5) мин.
Б.10.3 Среда и реактивы для реакции Фогеса-Проскауэра (VP)
Б.10.3.1 Основа среды
Состав:
протеозный пептон ... 7,0 г
хлорид натрия ... 5,0 г
глюкоза ... 5,0 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,9 0,2) ед. pH при 25 °C. Разливают среду в пробирки по 3 см 3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.3.2 Спиртовой раствор -нафтола
Состав:
-нафтол ... 5,0 г
этанол, 96 % (объемная доля) ... 100 см 3
Приготовление
Растворяют -нафтол в этаноле.
Б.10.3.3 Раствор гидроксида калия
Состав:
гидроксид калия ... 40,0 г
дистиллированная вода ... 100 см 3
Приготовление
Растворяют гидроксид калия в дистиллированной воде.
Б.11 Фосфатно-солевой буфер (PBS)
Состав:
натрий фосфорнокислый двузамещенный ... 8,98 г
натрий фосфорнокислый однозамещенный ... 2,71 г
хлорид натрия ... 8,5 г
дистиллированная вода ... 1000,0 см 3
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.12 Универсальный нейтрализатор
Б.12.1 Основа среды
Состав:
пептон ... 1,0 г
хлорида натрия ... 8,5 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.
Б.12.2 Готовая среда
Состав:
основа среды ... 1000 см 3
сорбитан моноолеат ... 30,0 г
лецитин ... 3,0 г
тиосульфат натрия ... 5,0 г
гистидинт ... 1,0 г
сапонин ... 30,0 г
Приготовление
Компоненты растворяют в основе среды. Готовый раствор разливают в пробирки или бутылки и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 121 °C.
Примечание - Допускается применение других нейтрализаторов или их комбинаций в отношении известного дезинфицирующего средства.
Б.13 Пептонная вода
Состав:
пептон ... 10,0 г
хлористый натрий ... 5,0 г
фосфорнокислый натрий двузамещенный 12-водный ... 9,0 г
фосфорнокислый калий однозамещенный ... 1,5 г
дистиллированная вода ... 1000 см 3
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,0 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.