Приложение Б (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение Б
(обязательное)

Состав
и приготовление питательных сред и реактивов

Б.1 Селективные среды первичного обогащения

Б.1.1 Полуконцентрированный бульон Фразера (Half Fraser broth)

Б.1.1.1 Основа среды

Состав:

мясной пептон (пептический перевар животной ткани) ... 5,0 г

триптон (ферментативный гидролизат казеина) ... 5,0 г

мясной экстракт ... 5,0 г

дрожжевой экстракт ... 5,0 г

хлорид натрия ... 20,0 г

натрий фосфорнокислый двузамещенный ... 12,0 г

калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г

эскулин ... 1,0 г

дистиллированная вода ... 1000 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве, необходимом для проведения анализа (см. Б.10.1), и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Примечание - Раствор хлорида лития и раствор налидиксовой кислоты могут быть добавлены в основу до стерилизации.

Б.1.1.2 Растворы селективных добавок

Б.1.1.2.1 Раствор хлорида лития

Состав:

хлорид лития ... 3,0 г

дистиллированная вода ... 10,0 см ³

Приготовление

Хлорид лития растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Предупреждение - Необходимо принимать все меры предосторожности при растворении хлорида лития в воде, так как реакция является экзотермической. Раствор хлорида лития раздражает слизистую оболочку.

Б.1.1.2.2 Раствор натриевой соли налидиксовой кислоты

Состав:

натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,1 г

0,05 моль/дм ³ раствора гидроксида натрия ... 10,0 см ³

Приготовление

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в растворе гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Состав:

акрифлавин гидрохлорид ... 0,25 г

дистиллированная вода ... 100 см ³

Приготовление

Акрифлавин гидрохлорид растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.2.4 Раствор цитрата аммонийного железа (III)

Состав:

цитрат аммонийного железа (III) ... 5,0 г

дистиллированная вода ... 100 см ³

Приготовление

Цитрат аммонийного железа (III) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.1.1.3 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.1.1.1) ... 100 см ³

раствор хлорида лития (см. Б.1.1.2.1) ... 1,0 см ³

раствор натриевой соли налидиксовой кислоты (см. Б.1.1.2.2) ... 0,1 см ³

раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.1.1.2.3) ... 0,5 см ³

раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.1.1.2.4) ... 1,0 см ³

Приготовление

В основу среды добавляют четыре раствора селективных добавок непосредственно перед использованием.

Б.1.2 Селективный накопительный бульон (UVM)

Состав:

триптоза ... 10,0 г

мясной экстракт ... 5,0 г

дрожжевой экстракт ... 5,0 г

хлористый натрий ... 20,0 г

фосфорнокислый натрий двузамещенный ... 12,0 г

калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г

эскулин ... 1,0 г

налидиксовая кислота ... 20,0 мг

акрифлавин гидрохлорид ... 12,0 мг

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH. Разливают среду в колбы или во флаконы соответствующего объема в количестве 225 см ³ и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.1.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I)

Б.1.3.1 Основа среды

Состав:

гидролизат казеина ферментативный ... 10,0 г

пептон мясной ферментативный ... 15,0 г

гидролизат дрожжей автолизованных ... 2,0 г

хлорид натрия ... 3,5 г

хлорид лития ... 3,0 г

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0  0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают среду в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.1.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:

налидиксовая кислота ... 10 мг

акрифлавин ... 5 мг

полимиксин В сульфат ... 5 мг

стерильная дистиллированная вода ... 10 см ³

Приготовление

Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.1.3.3 Готовая среда

Состав:

основа среды (см Б.1.3.1) ... 1000 см ³

раствор селективной добавки (см. Б.1.3.2) ... 4,44 см ³

Приготовление

В основу среды добавляют раствор селективной добавки. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.

Б.2 Селективные среды вторичного обогащения

Б.2.1 Бульон Фразера (Fraser broth)

Б.2.1.1 Основа среды

Состав:

мясной пептон (пептический перевар животной ткани) ... 5,0 г

триптон (ферментативный гидролизат казеина) ... 5,0 г

мясной экстракт ... 5,0 г

дрожжевой экстракт ... 5,0 г

хлорид натрия ... 20,0 г

натрий фосфорнокислый двузамещенный ... 12,0 г

калий фосфорнокислый однозамещенный ... 1,35 г

эскулин ... 1,0 г

хлорид лития ... 3,0 г

натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,1 г

дистиллированная вода ... 1000 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая ее при необходимости. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве необходимом для проведения анализа и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.2.1.2 Растворы селективных добавок

Б.2.1.2.1 Раствор акрифлавина гидрохлорида - по Б.1.1.2.3.

Б.2.1.2.2 Раствор цитрата аммонийного железа (III) - по Б.1.1.2.4.

Б.2.1.3 Готовая среда

Приготовление

В пробирки с 10 см ³ основы среды (см. Б.2.1.1) добавляют по 0,1 см ³ раствора акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.1.2.1) и раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.2.1.2.2) непосредственно перед использованием.

Б.2.2 Селективный накопительный бульон (UVM II)

Б.2.2.1 Основа среды

Согласно Б.1.2.

Б.2.2.2 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Состав:

акрифлавин гидрохлорид ... 13 мг

стерильная дистиллированная вода ... 10 см ³

Приготовление

Акрифлавин гидрохлорид растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.2.2.3 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.2.2.1) ... 1000 см ³

раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2) ... 4,44 см ³

Приготовление

К 1000,0 см ³ основы среды (см. Б.2.2.1) добавляют раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2).

Б.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II)

Б.2.3.1 Основа среды

Согласно Б.1.3.

Б.2.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:

налидиксовая кислота ... 10 мг

акрифлавин гидрохлорид ... 5 мг

полимиксин В сульфат ... 5 мг

стерильная дистиллированная вода ... 5 см ³

Приготовление

Налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорид и полимиксин В сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Б.2.3.3 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.2.3.1) ... 1000 см ³

раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) ... 4,44 см ³

Приготовление

В основу среды (см. Б.2.3.1) добавляют раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) и разливают в стерильные пробирки по 10 см ³. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.

Б.2.4 Бульон для обогащения Listeria monocytogenes (LMX Broth)

Б.2.4.1 Основа среды

Состав:

ферментативный перевар животных тканей (бычьих/свиных) ... 5 г

ферментативный перевар казеина (бычий) ... 5 г

мясной экстракт (бычий/свиной) ... 5 г

дрожжевой экстракт ... 5 г

буфер ... 18,32 г

смесь солей ... 11 г

глюкоза ... 2 г

акрифлавин гидрохлорид ... 0,005 г

налидиксовая кислота ... 0,01 г

очищенная вода ... 1000 см ³

Б.2.4.2 Раствор селективной добавки

Состав:

цефалексин ...  1 %

фосфомицин ...  1 %

смесь антибиотиков/противогрибковых препаратов ... > 2 %

Б.3 Селективные плотные среды для пересева

Б.3.1 Первая среда

Б.3.1.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA)

Б.3.1.1.1 Основа среды

Состав:

ферментативный перевар животного белка ... 18,0 г

панкреатический гидролизат казеина ... 6,0 г

дрожжевой экстракт ... 10,0 г

пируват натрия ... 2,0 г

глюкоза ... 2,0 г

глицерофосфат магния ... 1,0 г

сульфат магния (безводный) ... 0,5 г

хлорид натрия ... 5,0 г

хлорид лития ... 10,0 г

натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный) ... 2,5 г

5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид ... 0,05 г

агар ... 12,0-18,0 г ^*

------------------------------

^*_{В зависимости от плотности среды.}

------------------------------

дистиллированная вода ... 930 см ^3 **

------------------------------

^**_{925 , если используют раствор амфотерицина В.}

------------------------------

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.

Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.3.1.1.2 Растворы селективных добавок

Б.3.1.1.2.1 Раствор налидиксовой кислоты

Состав:

натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,02 г

0,05 моль/дм ³ раствора гидроксида натрия ... 5,0 см ³

Приготовление

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см ³ 0,05 моль/дм ³ раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.3.1.1.2.2 Раствор цефтазидима

Состав:

цефтазидим ... 0,02 г

дистиллированная вода ... 5,0 см ³

Приготовление

Цефтазидим растворяют в 5 см ³ дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.2.3 Раствор полимиксина В сульфата

Состав:

полимиксин В сульфат ... 76700,0 е.а.

дистиллированная вода ... 5,0 см ³

Приготовление

Полимиксин В сульфат растворяют в 5 см ³ дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.3 Растворы антибиотиков

Б.3.1.1.3.1 Раствор цикпогексимида

Состав:

циклогексимид ... 0,05 г

этанол ... 2,5 см ³

дистиллированная вода ... 2,5 см ³

Приготовление

Циклогексимид растворяют в 2,5 см ³ этанола, затем добавляют 2,5 см ³ дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.1.1.3.2 Раствор амфотерицина В (используется как альтернатива для раствора цикпогексимида)

Состав:

амфотерицин В ... 0,01 г

1 моль/дм ³ раствора соляной кислоты ... 2,5 см ³

диметилформамид (DMF) ... 7,5 см ³

Приготовление

Амфотерицин растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.

Б.3.1.1.4 Дифференциальная добавка

Состав:

L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636 ) ^* ... 2,0 г

------------------------------

^*_{Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.}

------------------------------

холодная дистиллированная вода ... 50 см ³

Приготовление

L--фосфатидилинозитол (Sigma Р 6636 ) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автокпавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47  2) °C.

Б.3.1.1.5 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.3.1.1.1) ... 930,0 см ^3 *

------------------------------

^*_{925 , если используют раствор амфотерицина В.}

------------------------------

раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) ... 5,0 см ³

раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) ... 5,0 см ³

раствор полимиксина В сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) ... 5,0 см ³

раствор цикпогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) ... 5,0 см ³

или амфотерицина В (см. Б.3.1.1.3.2) ... 10,0 см ³

дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) ... 50,0 см ³

Приготовление

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47  2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.

pH готовой среды должен составлять (7,2  0,2) ед. pH.

Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см ³ и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.

Б.3.1.2 Оценка качества первой среды

Определение селективности и продуктивности питательной среды необходимо проводить согласно ГОСТ ISO 11133.

Б.3.2 Вторая селективная среда для посева

Б.3.2.1 Оксфорд агар (Oxford agar)

Б.3.2.1.1 Основа среды

Состав:

пептон ... 23,0 г

крахмал ... 1,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

эскулин ... 1,0 г

цитрат аммонийного железа (III) ... 0,5 г

хлорид лития ... 15,0 г

агар ... 9,0-18,0 г ^**

------------------------------

^**_{В зависимости от плотности среды.}

------------------------------

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.

Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0  0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.3.2.1.2 Раствор селективной добавки

Состав:

циклогексимид ... 400,0 мг

сульфат колистина (полимиксин Е) ... 20,0 мг

акрифлавин гидрохлорид ... 5,0 мг

цефотетан ... 2,0 мг

фосфомицин ... 10,0 мг

этанол ... 5,0 см ³

дистиллированная вода ... 5,0 см ³

Приготовление

Компоненты добавки растворяют в смеси этанола и воды. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.1.3 Готовая среда

Приготовление

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47  2) °C основу среды (см. Б.3.2.1.1) добавляют, тщательно перемешивая, раствор селективной добавки (см. Б.3.2.1.2).

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см ³ и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.

Б.3.2.2 Палкам агар (PALCAM agar)

Б.3.2.2.1 Основа среды

Состав:

пептон ... 23,0 г

крахмал ... 1,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

дрожжевой экстракт ... 3,0 г

D-глюкоза ... 0,5 г

D-маннит ... 10,0 г

эскулин ... 0,8 г

цитрат аммонийного железа (III) ... 0,5 г

феноловый красный ... 0,08 г

хлорид лития ... 15,0 г

агар ... 9,0-18,0 г ^*

------------------------------

^*_{В зависимости от плотности среды.}

------------------------------

дистиллированная вода ... 960,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.

Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.3.2.2.2 Раствор полимиксина В сульфата

Состав:

полимиксин В сульфат (100000 е.а.) ... 0,1 г

дистиллированная вода 100 см ³

Приготовление

Растворяют полимиксин В сульфат в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида

Состав:

акрифлавин гидрохлорид ... 0,05 г

дистиллированная вода ... 100 см ³

Приготовление

Растворяют акрифлавин гидрохлорид в дистиллированной воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.4 Раствор пентагидрата цефтазидима натрия

Состав:

пентагидрат цефтазидима натрия ... 0,116 г

дистиллированная вода ... 100 см ³

Приготовление

Растворяют пентагидрат цефтазидима натрия в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.

Б.3.2.2.5 Готовая среда

Состав:

основа агара ... 960,0 см ³

раствор полимиксин В сульфата ... 10,0 см ³

раствор акрифлавина гидрохлорида ... 10,0 см ³

раствор пентагидрата цефтазидима натрия ... 20,0 см ³

Приготовление

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до (47  2) °C основу среды (см. Б.3.2.2.1), добавляют, тщательно перемешивая, растворы добавок (см. Б.3.2.2.2, Б.3.2.2.3).

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см ³ и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.

Б.3.2.3 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ)

Б.3.2.3.1 Основа среды

Состав:

гидролизат казеина панкреатический ... 10,0 г

гидролизат рыбной муки панкреатический ... 15,0 г

гидролизат автолизованных дрожжей ... 2,0 г

хлорид натрия ... 3,5 г

хлорид лития ... 15,0 г

цитрат аммонийного железа ... 0,5 г

эскулин ... 0,8 г

агар ... 13,0 г

дистиллированная вода ... до 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают pH (7,0  0,2) ед. pH и стерилизуют в автоклаве при температуре (121  1) °C в течение 15 мин.

Б.3.2.3.2 Раствор селективной добавки

Состав:

налидиксовая кислота ... 20 мг

акрифлавин гидрохлорид ... 10 мг

полимиксин В сульфат ... 10 мг

стерильная дистиллированная вода ... 10 см ³

Приготовление

Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин В сульфат растворяют в стерильном физиологическом растворе.

Б.3.2.3.3 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.3.2.3.1) ... 1000 см ³

раствор селективной добавки (см. Б.3.2.3.2) ... 4,44 см ³

Приготовление

К расплавленной основе среды добавляют с соблюдением правил асептики раствор селективной добавки. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.

Б.3.2.4 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar)

Б.3.2.4.1 Основа среды

Состав:

пептон ... 18,5 г

дрожжевой экстракт ... 4,0 г

хлорид натрия ... 9.5 г

пируват натрия ... 2,0 г

хлорид лития ... 15,0 г

мальтоза ... 4,0 г

5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид ... 0,2 г

агар ... 14,0 г

дистиллированная вода ... 930 см ^3 *

------------------------------

^*_{925 , если используют раствор амфотерицина В.}

------------------------------

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2  0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Б.3.2.4.2 Растворы селективных добавок

Б.3.2.4.2.1 Раствор налидиксовой кислоты

Состав:

натриевая соль налидиксовой кислоты ... 0,02 г

0,05 моль/дм ³ раствора гидроксида натрия ... 5,0 см ³

Приготовление

Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см ³ 0,05 моль/дм ³ раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.

Б.3.2.4.2.2 Раствор цефтазидима

Состав:

цефтазидим ... 0,02 г

дистиллированная вода ... 5,0 см ³

Приготовление

Цефтазидим растворяют в 5 см ³ дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.2.4.2.3 Раствор полимиксина В сульфата

Состав:

полимиксин В сульфат ... 76700,0 е.а.

дистиллированная вода ... 5,0 см ³

Приготовление

Полимиксин В сульфат растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.2.4.3 Растворы антибиотиков

Б.3.2.4.3.1 Раствор цикпогексимида

Состав:

циклогексимид ... 0,05 г

этанол ... 2,5 см ³

дистиллированная вода ... 2,5 см ³

Приготовление

Циклогексимид растворяют в 2,5 см ³ этанола, затем добавляют 2,5 см ³ дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Б.3.2.4.3.2 Раствор амфотерицина В (используют, как альтернативу для раствора цикпогексимида)

Состав:

амфотерицин В ... 0,01 г

1 моль/дм ³ раствора соляной кислоты ... 2,5 см ³

диметилформамид (DMF) ... 7,5 см ³

Приготовление

Амфотерицин В растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.

Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.

Б.3.2.4.4 Дифференциальная добавка

Состав:

L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636 ) ^* ... 2,0 г

------------------------------

^*_{Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.}

------------------------------

холодная дистиллированная вода ... 50,0 см ³

Приготовление

L--фосфатидилинозитал (Sigma Р 6636 ) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автокларируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47  2) °C.

Б.3.2.4.5 Готовая среда

Состав:

основа среды (см. Б.3.1.1.1) ... 933,0 см ^3 *

------------------------------

^*_{925 , если используют раствор амфотерицина В.}

------------------------------

раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) ... 5,0 см ³

раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) ... 5,0 см ³

раствор полимиксина В сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) ... 5,0 см ³

раствор цикпогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) ... 5,0 см ³

или амфотерицина В (см. Б.3.1.1.3.2) ... 10,0 см ³

дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) ... 50,0 см ³

Приготовление

В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47  2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.

pH готовой среды должен составлять (7,2  0,2) ед. pH.

Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.

В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15-20 см ³ и дают агару затвердеть.

Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.

Б.4 Питательные среды, используемые для изучения культурально-морфологических свойств

Б.4.1 Плотные питательные среды

Б.4.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)

Состав:

триптон или панкреатический гидролизат казеина ... 17,0 г

соевый пептон ... 3,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

калий фосфорнокислый двузамещенный ... 2,5 г

глюкоза ... 2,5 г

дрожжевой экстракт ... 6,0 г

агар ... 9,0-18,0 г ^**

------------------------------

^**_{В зависимости от плотности среды.}

------------------------------

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,3  0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду необходимого объема разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Скашивают агар. Для приготовления чашек с агаром готовую среду разливают в стерильные чашки Петри в объеме, необходимом для проведения теста. Дают агару застыть.

Б.4.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA)

Состав:

триптон ... 15,0 г

соевый пептон ... 5,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

агар ... 5,0 г

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. Устанавливают pH (7,3  0,2) ед. pH и стерилизуют при температуре (121  1) °C в течение 15 мин.

Приготовленную среду разливают в чашки Петри и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.

Б.4.1.3 Мясопептонный агар (МПА)

Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).

Б.4.2 Жидкие питательные среды

Б.4.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)

Состав:

триптон или панкреатический гидролизат казеина ... 17,0 г

соевый пептон ... 3,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

калий фосфорнокислый двузамещенный ... 2,5 г

глюкоза ... 2,5 г

дрожжевой экстракт ... 6,0 г

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3  0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121  1) °C в течение 15 мин.

Б.4.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB)

Состав:

триптон ... 17,0 г

соевый пептон ... 3,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

калий фосфорнокислый однозамещенный ... 2,5 г

декстроза ... 2,5 г

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3  0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121  1) °C в течение 15 мин.

Приготовленную среду хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.

Б.4.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ)

Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).

Б.5 Среда для определения -гемолитической активности

Б.5.1 Кровяной агар

Б.5.1.1 Основа среды (вариант 1)

Состав:

мясной пептон ... 15,0 г

печеночный перевар ... 2,5 г

дрожжевой экстракт ... 5,0 г

хлорид натрия ... 5,0 г

агар ... 9,0-18,0 г ^*

------------------------------

^*_{В зависимости от плотности среды.}

------------------------------

дистиллированная вода ... 1000,0 см ³

Приготовление

Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной