Приложение А (обязательное). Приготовление реактивов

Приложение А
(обязательное)

Приготовление реактивов

А.1 Синигрин моногидрат

А.1.1 Синигрин моногидрат, раствор концентрацией 5 ммоль/л

В мерной колбе вместимостью 100 см ³ растворяют 207,7 мг моногидрата аллилглюкозинолата калия в воде и доводят до метки водой.

Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неделю при температуре примерно 4 °С или в морозильной камере при минус 18 °С в течение 6 мес.

А.1.2 Синигрин моногидрат, раствор концентрацией 20 ммоль/л

В мерной колбе вместимостью 100 см ³ растворяют 831,0 мг моногидрата аллилглюкозинолата калия в воде и доводят до метки.

Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неделю при температуре примерно 4 °С или в морозильной камере при минус 18 °С в течение 6 мес.

А.1.3 Контроль чистоты

Используется один или несколько из приведенных ниже тестов:

- ВЭЖХ с применением метода, приведенного в ISO 9167-1;

- анализ неизменного синигрина посредством ВЭЖХ (метод ионной пары);

- анализ десульфатированного и силилированного синигрина газовой хроматографией.

Для каждого теста хроматограмма должна показывать только один основной пик, составляющий не менее 98 % от общей площади пиков компонентов.

Для подтверждения чистоты проводят определение количества глюкозы, высвободившейся в результате гидролиза при участии мирозиназы (тиоглюкозид глюкогидролазы; ЕС 3.2.3.1). Количество глюкозы измеряют ферментативным методом с использованием уже готовых коммерчески доступных тестовых наборов. Учитывают все количество свободной глюкозы. Это определение проводят тем же способом, но без добавления мирозиназы. Молярная концентрация глюкозы должна быть не менее 98 % от молярной концентрации исследуемого раствора синигрина.

А.2 Глюкотропаеолин

Примечание 8 - Глюкотропаеолин иногда сложно отделить от других природных минорных глюкозинолатов.

А.2.1 Глюкотропаеолин, раствор концентрацией 5 ммоль/л

В мерной колбе вместимостью 100 см ³ растворяют 223,8 мг глюкотропаеолина и доводят до метки водой.

Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неделю при температуре примерно 4 °С или в морозильной камере при минус 18 °С в течение 6 мес.

А.2.2 Глюкотропаеолин, раствор концентрацией 20 ммоль/л

В мерной колбе вместимостью 100 см ³ растворяют 895,0 мг глюкотропаеолина в воде и доводят до метки водой.

Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неделю при температуре примерно 4 °С или в морозильной камере при минус 18 °С в течение 6 мес.

А.2.3 Контроль чистоты

Чистоту проверяют в соответствии с А.1.3.

А.2.4 Фактор отклика

Проверяют соответствие факторов отклика глюкотропаеолина по сравнению с синигрином, указанным в 9.2.

А.3 Сульфатазы

А.3.1 Подготовка ионообменных колонок

Обрезают пять пипеток Пастера (см. 5.9) на 7 см выше конуса сливного отверстия и вкладывают пробку из стекловаты (см. 5.8) в отверстие пипетки. Пипетки устанавливают вертикально в штативе, после чего в каждую приливают достаточное количество ионообменной смолы (см. 4.7.1) так, чтобы после стекания воды объем ионообменной смолы составлял 500 мкл.

В каждую пипетку вносят по 1 см ³ раствора имидазола формиата (см. 4.4) и дважды промывают порциями воды по 1 см ³.

А.3.2 Очистка

С точностью до 0,1 мг взвешивают 25 мг сульфатазы Helix pomatia типа Н1 (см. 4.8) и растворяют в 2,5 см ³ воды, после чего полученный раствор переносят по 0,5 см ³ в каждую из колонок, подготовленных по А.3.1. Каждую колонку промывают 1,5 см ³ воды и промывной элюат отбрасывают. Затем добавляют 1,5 см ³ 0,2 моль/л раствора ацетата натрия (см. 4.3) и собирают элюаты из пяти колонок в пробирку для определения.

Элюаты концентрируют путем фильтрации с использованием иммерсионного фильтра ⁷⁾ до тех пор, пока не останется примерно 0,1 см ³ жидкости (сульфатаза с молярной массой более 5000 не удаляется). Добавляют 2,5 см ³ воды и концентрируют еще раз, пока не останется 0,1 см ³ жидкости. Разводят до 2,5 см ³ водой и хранят очищенную сульфатазу в морозильной камере при минус 18 °С (в небольших количествах, чтобы было удобно размораживать необходимое количество перед непосредственным использованием).

А.3.3 Определение активности сульфатазы

А.3.3.1 Приготовление раствора синигрина 0,15 ммоль/л, с рН 5,8

Готовят три раствора в следующей последовательности:

a) в мерную колбу вместимостью 500 см ³ вносят 1 см ³ уксусной кислоты и доводят водой до метки;

b) в мерную колбу вместимостью 500 см ³ вносят 1 см ³ этилендиамина и доводят водой до метки;

c) смешивают 73 см ³ раствора а) с 40 см ³ раствора b) и доводят рН до значения 5,8, используя растворы а) или b) по мере необходимости.

В мерную колбу на 100 см ³ вносят 3 см ³ раствора синигрина концентрацией 5 ммоль/л (см. А.1.1) и доводят до метки раствором с).

А.3.3.2 Анализ активности

Используя пипетку, перенести 2 см ³ раствора синигрина (см. А.3.3.1) в контрольную и измерительную кюветы двухлучевого спектрометра (см. 5.3), с установленной длиной волны 228 нм и температурой кювет 30 °С. В момент времени t = 0 в измерительную кювету вносят 50 мкл очищенной сульфатазы (см. А.3.2) и сразу же включают регистратор. Регистратор выключают, когда оптическая плотность больше не меняется (А _с), строят касательную к точке t = 0 и измеряют градиент A/t.

Единица активности сульфатазы соответствует образованию 1 мкмоль/мин десульфированного синигрина при температуре 30 °С и рН 5,8.

Активность сульфатазы E, выраженная в единицах активности на кубический сантиметр раствора сульфатазы, вычисляют по формуле

,

(А.1)

где A/t - градиент касательной к точке t = 0, в единицах оптической плотности в минуту;

V - объем реакционной среды (), л;

- (приблизительно 1500 л моль ^-1 см ^-1), разница между молярным коэффициентом поглощения синигрина и десульфосинигрина при 228 нм, то есть

,

(А.2)

где А _е - разница между оптической плотностью десульфированного синигрина в состоянии равновесия и оптической плотностью в момент времени t = 0;

l - длина оптического пути кюветы, см (т.е. 1 см);

с - концентрация десульфированного синигрина при равновесии, моль/дм ³, то есть

,

(A.3)

где 0,95 - выход десульфированного синигрина при равновесии.

В качестве альтернативы активность сульфатазы может быть рассчитана с использованием следующей упрощенной формулы

.

(А.4)

А.3.4 Разведение сульфатазы

Используя пипетку, в мерную колбу вместимостью 10 см ³ пипеткой переносят 1 см ³ очищенной сульфатазы (см. А.3.2). Объем доводят до метки водой и перемешивают.

Раствор делят на небольшие порции и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °С.