Методические указания МУ 4.2.3744-22 "Лабораторная диагностика мелиоидоза и сапа. Организация и проведение в лабораториях различного уровня" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 марта 2022 г.)

4.2. Методы контроля. Химические и микробиологические факторы

Методические указания МУ 4.2.3744-22
"Лабораторная диагностика мелиоидоза и сапа. Организация и проведение в лабораториях различного уровня"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 марта 2022 г.)

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) определяют методические основы и алгоритмы лабораторной диагностики мелиоидоза и сапа, а также порядок ее организации и проведения в лабораториях различного уровня при осуществлении санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий, направленных на обеспечение раннего выявления, предупреждения возникновения и распространения мелиоидоза и сапа.

1.2. МУ предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами организаций, осуществляющих работу с возбудителями инфекционных заболеваний I - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹.

------------------------------

¹_{Статья 40 Федерального закона от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".}

------------------------------

II. Общие положения

2.1. Мелиоидоз и сап - инфекции с высокой летальностью, включенные в перечень инфекционных болезней, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации ². Мелиоидоз относится к сапронозам, сап - к антропозоонозам. Для обоих заболеваний характерен первичный или вторичный сепсис и множественные абсцессы внутренних органов. Для обеих инфекций до настоящего времени отсутствуют эффективные средства специфической профилактики, аэрогенное заражение связано с резким повышением уровня летальности, в связи с чем возбудители мелиоидоза и сапа - Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei - относятся к II группе патогенных для человека микроорганизмов ³.

------------------------------

²_{Пункты 22, 23 приложения 11 СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4, зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500 (далее - СанПиН 3.3686-21).}

³_{Приложение 1 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

2.2. Комплекс организационных и санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий, направленных на обеспечение раннего выявления, предупреждения возникновения и распространения мелиоидоза и сапа среди населения Российской Федерации осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴.

------------------------------

⁴_{Пункты 5 - 11 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

2.3. Мелиоидоз эндемичен для Юго-Восточной Азии (страны субрегиона Большого Меконга и Малайского архипелага), Китая, Индостана, Австралии, Папуа - Новой Гвинеи, Западной и Центральной Африки, стран Карибского бассейна, Центральной и Южной Америки. Возбудитель мелиоидоза в естественных условиях является обитателем почвенных, водных, наземных экосистем, где в процесс циркуляции микроба вовлекаются простейшие, разнообразные позвоночные животные, растения и грибы.

Заражение людей мелиоидозом происходит преимущественно при контакте с водой или почвой, содержащими возбудитель, аэрогенно и при употреблении контаминированных возбудителем продуктов и воды. Передача инфекции от человека к человеку является редкой (контакт с кровью и биологическими жидкостями больного, половой и вертикальный пути). Предрасполагающими факторами развития мелиоидоза являются диабет, хронические заболевания почек, хронические легочные патологии, талассемия, онкологические заболевания, алкоголизм. Инкубационный период у человека варьирует от менее 24 часов (при высокой инфицирующей дозе) до нескольких месяцев или лет (в среднем 9 - 21 день).

2.4. Мелиоидоз не имеет выраженных патогномоничных симптомов и является трудно диагностируемым заболеванием. Клинические проявления мелиоидоза многообразны, инфекция может поражать различные системы органов, имитируя многие другие заболевания. Независимо от пути заражения острый мелиоидоз в большинстве случаев проявляется в виде локализованных или множественных абсцессов с пневмонией или без нее и часто осложняется сепсисом. Острый легочный мелиоидоз может возникать как первичная инфекция или распространяться гематогенным путем, тяжесть его колеблется от бронхита до некротической пневмонии. Септическая форма мелиоидоза имеет неуклонно прогрессирующее течение и летальность до 80 %. При хроническом мелиоидозе наблюдаются острые или хронические абсцессы кожи и внутренних органов. Стойкий иммунитет после перенесенного заболевания отсутствует.

В связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и расширением деловых связей в странах, не относящихся к эндемичным регионам, регулярно регистрируются заносные случаи заболевания людей и ввоза инфицированных животных. Высокому риску заражения мелиоидозом подвержены лица, посещающие эндемичные территории с целью экологического туризма, работники добывающей и строительной индустрии, сельского хозяйства или другие лица, имевшие контакт с почвой и водой стоячих водоемов.

2.5. Сап регистрируется на территории 23 стран Африки, Азии, Ближнего и Среднего Востока, Центральной и Южной Америки, среди которых сопредельные с Россией Монголия, Турция, Китай. Наблюдается тенденция к увеличению числа вспышек сапа среди породистых лошадей и других сельскохозяйственных и диких животных в Азии (Турция, Иран, Ирак, Ливан, Сирия, ОАЭ, Кувейт, Бахрейн, Монголия, Индия, Пакистан), Африке (Эфиопия), Центральной и Латинской Америке (Мексика, Бразилия).

2.6. Основным резервуаром и источником инфекции для человека являются больные животные с острыми формами болезни, сопровождающимися обильным выделением гноя из открытых язв. Восприимчивость людей к сапу высокая. Заражение человека чаще происходит контактным путем при попадании гноя и слизи на поврежденные кожные покровы и слизистые, реже алиментарным путем, через инфицированную воду или аэрогенно. Не исключена передача инфекции от человека к человеку (при уходе за больными людьми без специальных мер предосторожности).

2.7. Клинические формы заболевания - острая кожная, острая легочная, септическая, хроническая и латентная. В месте внедрения микроба в кожу обычно образуется гранулема и развивается лимфангит. В дальнейшем возникает сапная язва. Характерны септикопиемия, поражения кожи, мышц и внутренних органов, слизистых с образованием изъязвляющихся гранулем и гнойно-слизистым отделяемым. Для острой легочной формы сапа характерна клиническая картина пневмонии, увеличение лимфоузлов, спленомегалия. На рентгенограмме грудной клетки очаговые тени, полости (при абсцедировании), иногда - картина бронхопневмонии или затемнение целой доли. При хронической форме сапа наблюдаются множественные абсцессы в подкожной клетчатке и мышцах, абсцессы внутренних органов. Для септической формы характерны папулезная и пустулезная сыпь, тяжелые нарушения общего состояния.

III. Характеристика возбудителей мелиоидоза и сапа

3.1. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (В. mallei) относятся к -протеобактериям, семейству Burkholderiaceae, роду Burkholderia. Представляют собой грамотрицательные тонкие палочки с закругленными концами (могут встречаться также коккобациллярные и нитевидные формы), спор не образуют, имеют полисахаридную капсулу (при световой микроскопии не видна). В. pseudomallei подвижна за счет наличия нескольких жгутиков на одном конце клетки (лофотрих), В. mallei - неподвижна.

3.2. В. pseudomallei является сапрофитом, В. mallei - облигатным патогеном теплокровных. Оба микроорганизма способны к внутриклеточному паразитированию, что в сочетании с их высокой естественной резистентностью к большинству антибиотиков обуславливает сложность антибактериальной терапии вызываемых ими инфекций.

3.3. Мелиоидозный и сапной микробы на плотных питательных средах образуют различные типы колоний. Морфологическая диссоциация (образование R-, S-, М-форм колоний, а также I-диссоциация - одновременный рост колоний разного типа) наиболее характерна для В. pseudomallei. В. mallei растет преимущественно в S-форме.

На селективных средах, содержащих кристаллвиолет и нейтральный красный, В. pseudomallei формирует колонии разных оттенков фиолетового и пурпурного цветов с преобладанием гладких форм в начальной фазе инкубации, через 48 - 72 часа - сухие и морщинистые колонии с зоной просветления агара вокруг. На плотных питательных средах без красителей также отмечается морфологическая диссоциация колоний. S-форма: колонии вначале круглые, прозрачные, выпуклые, с ровными краями, к 48 часам они достигают диаметра 1 - 3 мм и начинают диссоциировать (теряют прозрачность, становятся серовато-белыми с металлическим блеском, шероховатой поверхностью). В отдельных случаях появляются мукоидные колонии, возможен рост в виде микроколоний.

В. pseudomallei - облигатный аэроб, но способна расти в анаэробных условиях в присутствии нитратов. Оптимальная температура роста возбудителей сапа и мелиоидоза плюс 37 °С, оптимальный рН среды 6,8 - 7,2. В отличие от возбудителя сапа, В. pseudomallei хорошо растет при температуре плюс 42 °С. В жидкой питательной среде В. pseudomallei и В. mallei формируют поверхностную пленку, уплотняющуюся по мере роста. Возбудители сапа и мелиоидоза окисляют, но не ферментируют глюкозу, обладают цитохромоксидазной и каталазной активностью, продуцируют аргининдигидролазу; тесты на лизин- и орнитиндекарбоксилазу отрицательные; не ассимилируют L-арабинозу (Ara). Оба возбудителя устойчивы к полимиксину, В. pseudomallei устойчива к гентамицину (отдельные штаммы чувствительны), В. mallei к гентамицину чувствительна.

3.4. В. pseudomallei при положительной температуре длительно сохраняется в воде и почве. При температуре плюс 58 °С погибает в течение 15 мин, при температуре плюс 4 °С сохраняет жизнеспособность не менее года, при отрицательных температурах - не менее месяца. В. mallei относительно устойчива в окружающей среде: в подсохших выделениях больных микроб сохраняет жизнеспособность до трех месяцев, в воде и различных гниющих субстратах - до нескольких месяцев.

Возбудители мелиоидоза и сапа погибают при воздействии 3 %-го раствора перекиси водорода через 5 минут; 3 %-го раствора хлорамина Б и 3 %-го гипохлорита натрия - через 10 минут; 0,025 %-й раствор алкилдиметилбензиламмония хлорида вызывает гибель В. pseudomallei и В. mallei через 3 часа.

IV. Основные методы лабораторной диагностики мелиоидоза и сапа

4.1. В схему лабораторной диагностики мелиоидоза и сапа входит проведение ускоренных тестов, направленных на выявление специфических антигенов и ДНК возбудителей, а также определение специфических антител в крови больных (подозрительных на заболевание) и выделение чистой культуры с последующим определением видовой принадлежности.

4.2. Проведение экспресс- и ускоренной диагностики клинического материала с использованием микроскопии нативных образцов, метода флуоресцирующих антител (далее - МФА), реакции непрямой гемагглютинации (далее - РНГА) и постановки полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) обеспечивает получение предварительного ответа в течение 2 - 6 часов от момента поступления проб на исследование.

4.3. Процесс выделения возбудителей из объектов исследования и их окончательной идентификации может потребовать от 72 часов до 14 суток с момента поступления материала на исследование.

4.4. Идентификацию выделенных чистых культур, подозрительных на принадлежность к возбудителям мелиоидоза и сапа, проводят в два этапа. Последовательно определяют род и вид исследуемой культуры бактерий методами классической бактериологии или с использованием автоматических и полуавтоматических биохимических анализаторов с применением идентификационных наборов для грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов. Использование анализаторов проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями по безопасности работ с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) ⁵.

------------------------------

⁵_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

4.5. Для окончательного отнесения исследуемой культуры к виду В. pseudomallei или В. mallei требуется подтверждение с использованием молекулярно-генетических тестов.

4.6. Для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза используются диагностические препараты, зарегистрированные в установленном порядке ⁶, согласно инструкции производителя. В референс-центре по мониторингу за сапом и мелиоидозом и центрах верификации диагностической деятельности, осуществляющих функции государственных коллекций Роспотребнадзора, могут использоваться экспериментальные серии диагностических препаратов ⁷.

------------------------------

⁶_{Статья 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ).}

⁷_{Пункт 2.9 приложения 7, пункт 2.5.1 приложения 8 приказа Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации" (далее - приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116).}

------------------------------

4.7. Вирулентность штаммов определяют с использованием золотистых хомяков. Типичные штаммы возбудителей мелиоидоза и сапа при внутрибрюшинном заражении в дозе менее 10 ² микробных клеток (далее - м.к.) вызывают гибель животных в течение 10 суток с выделением культуры возбудителя из органов павших животных (селезенка, печень, легкие).

4.8. Для определения антибиотикочувствительности штаммов В. mallei и В. pseudomallei используют такие действующие вещества, как цефтазидим, меропенем (или имипенем), триметоприм/сульфаметоксазол, амоксициллин/клавулановую кислоту, доксициклин, некоторые фторхинолоны (ципрофлоксацин, спарфлоксацин).

4.9. Основными методами серологической диагностики мелиоидоза и сапа являются РНГА и непрямой вариант МФА. При поиске специфических антител в сыворотках больных людей и животных исследуют парные сыворотки. Нарастание титра антител в случае исследования парных сывороток расценивают как свидетельство прогрессирования заболевания. Относительно невысокие, но сохраняющиеся в течение времени титры антител трактуют как ретроспективное подтверждение факта инфицирования.

При постановке окончательного диагноза следует учитывать, что результаты серологической диагностики мелиоидоза и сапа не являются однозначными в связи с возможным отсутствием сероконверсии при тяжелых формах инфекции (в 30 % случаев). Иммунологические методы, направленные на выявление антигенов возбудителя, не обладают достаточной специфичностью. Диагностическая чувствительность бактериологического метода не превышает 60 %, что определяет решающую роль в лабораторной диагностике этих инфекционных болезней молекулярно-генетических методов при обязательном учете данных эпидемиологического анамнеза.

V. Отбор и направление материала для лабораторных исследований

5.1. При подозрении на мелиоидоз или сап с учетом клинических и эпидемиологических данных медицинские организации (далее - МО) осуществляют:

- отбор и направление материала от больных для лабораторных исследований;

- патологоанатомическое вскрытие умерших с целью установления диагноза и взятия материала для лабораторного исследования.

Вскрытие трупа, забор материала от больных проводят с соблюдением требований биологической безопасности при работе с ПБА I - II групп патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями СанПиН 3.3686-21 в части использования рабочей одежды и средств индивидуальной защиты ⁸ и требований к патологоанатомической работе в очагах заболеваний, вызванных микроорганизмами I - II групп патогенности ⁹.

------------------------------

⁸_{Пункт 585 приложения 3 СанПиН 3.3686-21.}

⁹_{Пункты 453 - 460 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

5.1.1. У больных (подозрительных на заболевание), вне зависимости от клинической формы болезни, производят отбор крови, мочи, мазка слизистой зева. Дополнительно, в зависимости от клинической формы болезни, должен быть проведен отбор содержимого абсцессов, пунктатов лимфоузлов, мокроты, гнойного отделяемого язв, рвотных масс, полостных экссудатов, цереброспинальной жидкости.

5.1.2. От умерших с подозрением на мелиоидоз или сап производят отбор материала кожных поражений, увеличенных лимфатических узлов, измененных участков легких, печени и селезенки, мозга и кровь.

5.1.3. Забор крови для исследований проводят с соблюдением правил асептики и мер индивидуальной защиты. Кровь забирают из локтевой вены в количестве 20 мл одноразовым шприцем, 5 мл засевают в 50 мл жидкой питательной среды. Оставшуюся часть крови распределяют по двум пробиркам: 10 мл в пробирку с антикоагулянтом - 6 %-м раствором ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови (гепарин использовать нельзя!); 5 мл - для получения сыворотки для постановки серологических реакций.

5.1.4. Отделяемое из зева забирают натощак или через 3 - 4 часа после еды. Аккуратно прижимая язык шпателем, вводят тампон между дужками миндалин и язычком (нельзя касаться тампоном губ, щек, языка) и собирают материал с задней поверхности глотки, миндалин и участков воспаления или изъязвления слизистой. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или пробирку с транспортной или питательной средой.

5.1.5. Перед взятием отделяемого язв осторожно очищают кожу вокруг пораженного места, при необходимости удаляют некротические массы, гной. Прокатывая тампон по раневой поверхности от центра к периферии в течение 5 - 10 с, абсорбируют материал на тампон.

5.1.6. Моча берется с соблюдением правил асептики - средняя порция или моча из катетера.

5.1.7. Отбор проб всех видов материала осуществляют в стерильную пластиковую посуду, соответствующую объему проб. Емкости с пробами маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и помещают в контейнер для транспортировки биологического материала. Поверхность стола после упаковки проб обрабатывают дезинфицирующим раствором. Контейнер с упакованным материалом опечатывают и отправляют в лабораторию с нарочным на специально выделенном транспорте с соблюдением температурного режима в интервале от плюс 8 °С до плюс 15 °С.

Отобранный материал должен быть доставлен на лабораторное исследование в течение 2 часов. При длительной транспортировке материала в лаборатории необходимо использовать транспортные среды.

5.1.8. Упаковку и транспортирование клинического (секционного) материала осуществляют в соответствии с требованиями к порядку передачи и транспортирования (в части безопасной упаковки, маркировки и оформления документации) ПБА I - IV групп ¹⁰. На отправляемые для лабораторного исследования пробы клинического или секционного материала оформляют направления в соответствии с рекомендуемыми образцами (приложения 1, 2 к настоящим МУ). Направление заполняется в 2 экземплярах. Один экземпляр вкладывается в контейнер, второй - передается с нарочным.

------------------------------

¹⁰_{Пункты 520 - 530, приложения 9, 10 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

5.2. Отбор и направление материала от животных. Отбор материала от животных производится специалистами в области ветеринарии ¹¹. Порядок диагностических мероприятий регламентирован Ветеринарными правилами ¹².

------------------------------

¹¹_{Статья 1.1 Федерального закона от 14.05.1993 N 4979-1 "О ветеринарии".}

¹²_{Приказ Минсельхоза России от 28.06.2017 N 311 "Об утверждении ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов сапа" (зарегистрирован Минюстом России 31.07.2017, регистрационный N 47585).}

------------------------------

У больных (подозрительных на заболевание) мелиоидозом животных возбудитель может быть выделен из содержимого абсцессов, мокроты, гнойного отделяемого язв, рвотных масс. При острой септической форме возбудитель обнаруживается в крови, моче, цереброспинальной жидкости и полостных экссудатах.

Материал для исследования от животных с подозрением на сап - выделения из носовой полости, отделяемое язв, пунктаты лимфоузлов, мокрота, испражнения.

При вскрытии трупов животных для исследования на оба возбудителя забирают фрагменты органов (селезенка, печень, легкое), лимфатических узлов, кровь, костный мозг.

Порядок и температурные режимы направления проб на исследование соответствуют описанным в п.п. 5.1.7 - 5.1.8.

5.3. Отбор и направление материала из объектов окружающей среды осуществляются в соответствии с требованиями к проведению мероприятий по предупреждению распространения инфекционных болезней на территории Российской Федерации ¹³.

------------------------------

¹³_{Пункты 582, 586 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

Отбор проб объектов окружающей среды, представляющих собой твердые субстраты (почва, подстилочный материал, продукты растениеводства), осуществляют в стерильные контейнеры или пакеты с застежкой-молнией объемом не менее 25 мл. Инструмент для отбора проб очищается и обрабатывается 70 %-м этанолом после отбора каждого образца.

Отбор проб воды осуществляют в стерильные герметично закрывающиеся контейнеры объемом не менее 250 мл.

Порядок и температурные режимы направления проб на исследование соответствуют описанным в п.п. 5.1.7 - 5.1.8.

VI. Методы индикации и экспресс-диагностики

6.1. Все работы с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями мелиоидоза и сапа, проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями к обеспечению безопасности при работе с ПБА ¹⁴.

------------------------------

¹⁴_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

6.2. Световая микроскопия мазков и мазков-отпечатков исследуемого материала проводится с использованием окраски по Граму.

6.3. МФА используют при индикации возбудителей мелиоидоза и сапа в нативном материале и после "подращивания" материала на средах обогащения. Приготовление, окрашивание иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими мелиоидозными или сапными, просмотр мазков и оценку результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению препарата.

При работе с чистыми культурами типичных штаммов возбудителей мелиоидоза или сапа метод позволяет выявлять 5 х 10 ⁴ м.к./мл, в бактериальных смесях - от 5 х 10 ⁵ до 1 х 10 ⁶ м.к./мл, в объектах внешней среды - от 5 х 10 ⁵ до 5 х 10 ⁶ м.к./мл в зависимости от характера исследуемого объекта, его обсемененности посторонней микрофлорой.

На этапе экспресс-анализа используют МФА с контрастированием неспецифического свечения микрообъектов. При идентификации чистых культур микроорганизмов контрастирование не применяют.

6.4. Для выявления специфических антител к возбудителям мелиоидоза и сапа в сыворотке крови больных (подозрительных на заболевание) мелиоидозом и сапом используют непрямые варианты МФА и РНГА. Исследования проводят в соответствии с инструкциями по применению диагностических препаратов.

6.5. ПЦР. Исследования проводят в соответствии с инструкциями по применению диагностических препаратов.

VII. Выделение возбудителей мелиоидоза и сапа из исследуемого материала

7.1. Все работы с культурами, подозрительными на принадлежность к видам В. pseudomallei и В. mallei, проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями к обеспечению безопасности при работе с ПБА ¹⁵.

------------------------------

¹⁵_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

7.2. Для бактериологического исследования на мелиоидоз и сап используют питательные среды и их компоненты, зарегистрированные в установленном порядке ¹⁶ (приложение 3 к настоящим МУ). Каждая серия питательных сред должна быть проверена на ростовые свойства ¹⁷.

------------------------------

¹⁶_{Статья 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ.}

¹⁷_{МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008.}

------------------------------

7.2.1. Для выделения возбудителей используют плотные и жидкие полноценные питательные среды с добавлением 4 % глицерина. При выделении возбудителя мелиоидоза в качестве ингибиторов посторонней микрофлоры используют полимиксин В (50 ЕД/мл) и гентамицин (4 мкг/мл). При выделении возбудителя сапа в качестве ингибитора посторонней микрофлоры используют только полимиксин В (30 ЕД/мл).

7.2.2. Оптимальной средой для выделения возбудителя мелиоидоза из нестерильных в норме проб является агар Эшдауна (триптиказо-соевый агар, содержащий 4 % глицерина, 4 мг/л гентамицина, 5 мг/л кристаллвиолета и 50 мг/л нейтрального красного) (приложение 4 к настоящим МУ). В связи с наличием отдельных штаммов B. pseudomallei, чувствительных к гентамицину, посев исследуемого материала следует проводить параллельно на среду Эшдауна с гентамицином и без него.

7.3. Выделение возбудителей мелиоидоза и сапа из проб клинического (секционного) материала.

7.3.1. Гемокультура. Асептически полученную кровь (2 мл) засевают в триптиказо-соевый бульон с 4 % глицерина, одновременно делая посев на триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина и агар Эшдауна (только для возбудителя мелиоидоза). Бульонные посевы инкубируют при плюс 37 °С в течение 48 часов. Поверхностный бактериальный рост (захватывая поверхностную пленку) по 0,1 мл пересевается на триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина и агар Эшдауна (только для возбудителя мелиоидоза). Посевы инкубируют при плюс 37 °С в течение 96 часов, ежедневно контролируя рост.

7.3.2. Респираторные выделения, мазки, гной, отделяемое язв. Производят посев растиранием небольшого количества исследуемого образца на триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина и полимиксином, для возбудителя мелиоидоза дополнительно производят высев на агар Эшдауна (с добавлением и без гентамицина) и селективный бульон Эшдауна. Посевы инкубируют при плюс 37 °С в течение 48 часов (триптиказо-соевый агар) и 96 часов (агар Эшдауна) с ежедневным контролем роста.

Посевы на селективный бульон Эшдауна инкубируют при плюс 37 °С в течение 48 часов, затем 0,01 мл с поверхности бульона рассевают на агар Эшдауна, далее инкубируют при 37 °С в течение 48 - 96 часов с ежедневным контролем роста.

7.3.3. Моча. Бактериологическое исследование мочи проводят для выделения возбудителя мелиоидоза. Нативную мочу в объеме 0,1 мл высевают растиранием на 2 чашки агара Эшдауна (с добавлением и без гентамицина). Концентрированную мочу (центрифугировать 5 мин при 3 000 об./мин, супернатант удаляют, осадок суспендируют в остатке жидкости) в объеме 0,05 мл высевают растиранием на 2 чашки агара Эшдауна (с добавлением и без гентамицина). Посевы инкубируют при плюс 37 °С в течение 96 часов с ежедневным контролем роста.

7.3.4. Секционный материал. Посевы секционного материала осуществляют методом мазков-отпечатков с последующим рассевом на триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина и полимиксином, для возбудителя мелиоидоза дополнительно производят высев на агар Эшдауна (с добавлением и без гентамицина) и селективный бульон Эшдауна. Посевы инкубируют при плюс 37 °С в течение 48 часов (триптиказо-соевый агар) и 96 часов (агар Эшдауна) с ежедневным контролем роста.

Посевы на селективный бульон Эшдауна инкубируют при плюс 37 °С в течение 48 часов, затем 0,05 мл с поверхности бульона рассевают на агар Эшдауна, далее инкубируют при плюс 37 °С в течение 96 часов с ежедневным контролем роста.

7.4. Выделение возбудителя мелиоидоза из объектов окружающей среды.

7.4.1. Почва, подстилка, твердое растительное сырье. К образцу массой около 10 г добавляют 10 мл стерильного физиологического раствора с полимиксином В (50 ЕД/мл), тщательно перемешивают на встряхивателе в течение 30 с и инкубируют при плюс 42 °С в течение 48 часов. По окончании инкубации калиброванной петлей на 0,01 мл осторожно снимают пленку с поверхности жидкости и рассевают на 2 чашки с агаром Эшдауна (с гентамицином и без гентамицина). Инкубируют при плюс 42 °С в течение 7 суток с ежедневным контролем роста.

7.4.2. Вода. Проводят предварительное обогащение исследуемой пробы, для чего к 2 мл образца добавляют 10 мл бульона Эшдауна с полимиксином В (50 ЕД/мл), инкубируют при плюс 42 °С в течение 48 часов. Параллельно производят высев 0,2 мл исследуемой пробы на 2 чашки с агаром Эшдауна (с гентамицином и без гентамицина), инкубируют при плюс 42 °С в течение 7 суток с ежедневным контролем роста.

При инкубации пробы с обогащением необходимо обеспечить доступ воздуха (если крышка завинчивающаяся, она должна быть закрыта неплотно, либо используется корковая или ватно-марлевая пробка). По окончании инкубации калиброванной петлей на 0,01 мл осторожно снимают пленку с поверхности среды обогащения и рассевают на 2 чашки с агаром Эшдауна (с гентамицином и без гентамицина). Инкубируют при плюс 42 °С в течение 7 суток с ежедневным контролем роста.

7.5. Выделение возбудителя мелиоидоза методом биопроб.

7.5.1. При выделении возбудителя мелиоидоза исследуемые кровь, цереброспинальную жидкость, экссудат из серозных полостей вводят в объеме 0,5 - 1,0 мл двум золотистым хомякам подкожно. Материал из абсцессов, отделяемого ран, рвотных масс, измельченные кусочки внутренних органов (печень, селезенка, почки, легкие) суспендируют в 2 - 3 мл 0,85 %-го раствора NaCl, после отстаивания надосадочную жидкость вводят животным подкожно по 0,5 - 1,0 мл.

7.5.2. Исследуемую воду вводят по 2,0 мл внутрибрюшинно пяти золотистым хомякам. При анализе сильно загрязненной воды и почвы (надосадочная жидкость) объем инъекции составляет 1,0 мл. Заражение проводят подкожно.

7.5.3. Мелиоидоз у золотистых хомяков протекает в острой септицемической форме, заканчивающейся к 4 - 5-му дню летально. Культуру возбудителя мелиоидоза выделяют посевом внутренних органов павших животных (измененные части тканей легких, селезенки, печени, кровь, лимфатические узлы) на плотные питательные среды с 4 % глицерина. За выжившими животными наблюдают не менее 20 суток, после чего их забивают, вскрывают и исследуют бактериологически (посев из паренхиматозных органов и крови на плотные питательные среды с 4 % глицерина). Отбор подозрительных колоний производят после 48 - 72 часов инкубации при температуре плюс 37 °С.

7.6. Выделение возбудителя сапа методом биопроб.

7.6.1. Биологический метод высокоэффективен для диагностики острого сапа и малоэффективен при хроническом сапе.

7.6.2. Для постановки биопробы при диагностике сапа используют золотистых хомяков или морских свинок.

7.7. Кусочки органов животных или людей измельчают в физиологическом растворе (см. п. 7.5.1 МУ). Экстракт в объеме 0,5 мл вводят биопробным животным подкожно в область бедра. При исследовании подозрительных культур животных заражают внутрибрюшинно. Срок наблюдения за биопробными животными до 21 суток, в типичных случаях падеж биопроб происходит в первые 10 суток после инфицирования.

7.8. Павших или забитых биопробных животных вскрывают и исследуют бактериологически для выделения культуры возбудителя. С этой целью из органов делают высевы на полноценные питательные среды с добавлением 4 % глицерина и полимиксина В (30 ЕД/мл).

VIII. Идентификация возбудителей мелиоидоза и сапа

8.1. Все работы с культурами В. pseudomallei и В. mallei проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями к обеспечению безопасности при работе с ПБА ¹⁸.

------------------------------

¹⁸_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

8.2. Характер роста возбудителя мелиоидоза на плотных питательных средах. В. pseudomallei на кровяном агаре, агаре Мюллера-Хинтона, триптиказо-соевом агаре образует небольшие, гладкие полупрозрачные кремовые колонии (S-форма); к 48 часам они достигают диаметра 1 - 3 мм и начинают диссоциировать (теряют прозрачность, становятся серовато-белыми с металлическим блеском, поверхность шероховатая). R-форма: серовато-желтые или серовато-белые непрозрачные колонии диаметром 2 - 4 мм с морщинистой поверхностью и неровным зубчатым краем. Гемолиз отсутствует. В отдельных случаях появляются мукоидные колонии, иногда образуются микроколонии. Для В. pseudomallei характерно присутствие на одной чашке разных типов колоний. При сливном росте наблюдается непрозрачный с металлическим блеском налет, приподнимающийся над поверхностью агара. Растет на агаре МакКонки. На селективном агаре Эшдауна В. pseudomallei через 24 часа образует мелкие бледно-розовые колонии; на вторые сутки розовато-фиолетовые плоские; на третьи - четвертые сутки (иногда раньше) наблюдается прогрессия к образованию R-форм (сухие, морщинистые колонии причудливой формы разных оттенков фиолетового или пурпурного цветов). Возможно также образование других типов колоний В. pseudomallei - гладкие и блестящие, слизистые или мукоидные с различными оттенками фиолетового цвета. Характерным признаком колоний возбудителя мелиоидоза является наличие металлического блеска. Часто присутствует характерный землистый запах.

8.3. В. pseudomallei представляет собой прямые или слегка изогнутые грамотрицательные биполярные палочки с закругленными концами размером 2 - 6 х 0,5 - 0,8 мкм, могут встречаться также коккобациллярные и нитевидные формы микроба. Биполярность может быть не выражена или отсутствовать у клеток молодых или старых культур, культивированных при дефиците питательных веществ.

8.4. Характер роста возбудителя сапа на плотных питательных средах. В. mallei на кровяном агаре, агаре Мюллера-Хинтона, триптиказо-соевом агаре на вторые сутки образует гладкие, серые, полупрозрачные колонии без пигмента. На средах с желчными кислотами, например, МакКонки, в большинстве случаев рост отсутствует; к концу вторых суток могут образоваться очень мелкие микроколонии.

8.5. В. mallei представляет собой небольшие прямые или слегка изогнутые грамотрицательные палочки размером от 1,5 - 3 х 0,5 - 1 мкм с закругленными концами. В старых культурах могут присутствовать кокковидные и нитевидные формы клеток.

8.6. Родо- и группоспецифичные диагностические признаки. При отборе культур, подозрительных на принадлежность к видам В. pseudomallei и В. mallei, учитывают их агглютинацию агглютинирующими сыворотками в титре не менее 1:200, отсутствие способности к образованию диффундирующего пигмента на плотных питательных средах, положительную каталазную активность, положительную цитохромоксидазную активность (может варьировать у В. mallei), способность к окислению глюкозы без ферментации, наличие аргининдегидролазы, отсутствие лизин- и орнитиндекарбоксилазы, отсутствие признака ассимиляции L-арабинозы.

8.7. Видоспецифические диагностические признаки. При дифференциа