Приложение 5. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического секционного материала для лабораторной диагностики ГЛПС

Приложение 5
к МУ 3.1.3844-23

Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического секционного материала для лабораторной диагностики ГЛПС

1. Забор материала для иммунологической диагностики.

1.1. Материал для исследования. Для иммунологического исследования на наличие антител к хантавирусам используется сыворотка крови (как основной метод) и моча (как дополнительный метод). Для определения антигенов хантавирусов в тканях человека (материалах аутопсии) можно исследовать суспензии органов (почки, печень, легкие, селезенка).

1.2. Методы исследования. Основные - ИФА, МФА.

1.3. Период забора материала. Первый забор крови - при обращении больного за медицинской помощью (желательно до 4 - 7 дней, болезни), параллельно забирают мочу (1,0 мл). Повторный забор крови и мочи проводят через 2 - 3 дня.

При отсутствии антител во второй образце, но сохранении подозрения на ГЛПС, рекомендуется произвести забор третьего образца крови у пациента через 2 - 3 дня после второго.

Кусочки органов забирают при проведении аутопсии. Отбор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного.

1.4. Методика забора материала. Забор крови производят натощак или не менее чем через 3 часа после приема пищи из вены с помощью вакуумной системы для забора крови типа "Vacuett" в пробирку с активатором сгустка. Пробирку аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь перемешалась с реагентом. При отсутствии пробирок с реагентами возможен забор крови одноразовым шприцем с иглой диаметром 0,8 - 1,1 мм в стерильную пробирку без реагента, герметично закрывающуюся.

Мочу собирают в стерильный пластиковый контейнер объемом 30 - 50 мл. Для исследования необходима средняя порция утренней мочи.

Секционный материал. Отбирают кусочки тканей почек, печени, легких, селезенки. Забор проб проводят из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание, обращают на пограничную зону. Кусочки материала объемом не более 1 х 1 х 1 см помещают в одноразовые стерильные контейнеры (емкости) с плотно завинчивающимися крышками.

1.5. Предобработка проб. Для получения сыворотки пробирку с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. Сыворотку переносят с помощью автоматического дозатора отдельным наконечником с фильтром (или пастеровской пипеткой) в стерильную пробирку. Сыворотка не должна быть гемолизированной.

Образец мочи объемом 1,0 мл центрифугируют в пробирке тина "Эппендорф" при 8000 об/мин в течение 10 мин. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле:

g = 0,00001118 х r х (об/мин) ²,

где r - радиус ротора центрифуги в мм.

Осторожно удаляют 0,9 мл верхней части надосадочной жидкости в емкость с дезинфицирующим раствором. Осадок ресуспендируют в оставшихся 100 мкл надосадочной жидкости и используют (в неразведенном виде) для выявления специфических антител к хантавирусам.

Кусочки органов растирают в стерильных фарфоровых ступках или с помощью гомогенизатора и готовят 10 %-ю суспензию в стерильном 0,9 %-м растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 секунд. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ. Супернатант используют для постановки ИФА.

2. Забор материала для молекулярно-биологического исследования.

2.1. Материал для исследования.

Материалом для исследования служат образцы цельной крови, сыворотки и/или плазмы крови, мочи, пробы секционного материала (почки, печень, легкие, селезенка).

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

2.1. Методы исследования.

Основные - ОТ-ПЦР, РТ-ПЦР, секвенирование.

2.2. Период забора материала.

Кровь - забирают при обращении больного за медицинской помощью (желательно не позднее 5-го дня от начала заболевания). Мочу забирают в острый период заболевания. Кусочки органов забирают при проведении аутопсии. Отбор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного.

2.3. Методика забора материала.

Кровь для получения сыворотки или плазмы для исследования методами ОТ-ПЦР или РТ-ПЦР забирают, как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

Для исследования цельной крови и плазмы кровь забирают натощак или не менее чем через 3 часа после приема пищи из вены с помощью вакуумной системы для забора крови типа "Vacuett" в пробирку с антикоагулянтом (с ЭДТА или с раствором натрия цитрата. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!). Пробирку аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь перемешалась с реагентом.

Мочу собирают в стерильный пластиковый контейнер объемом 30 - 50 мл. Для исследования необходима средняя порция утренней мочи.

Секционный материал забирают, как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

2.4. Предобработка проб. Для получения сыворотки кровь обрабатывают, как указано в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.

Для работы с цельной кровью переносят необходимый объем материала с помощью автоматического дозатора отдельным наконечником с фильтром (или пастеровской пипеткой) в пробирку объемом 1,5 мл.

Для получения плазмы пробирку с кровью центрифугируют в течение 10 минут при величине центробежного ускорения g, соответствующей скорости вращения 2000 об/мин. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.

После центрифугирования плазму крови отбирают в пробирку объемом 1,5 мл.

Моча. При наличии центрифуги с охлаждением до плюс 4 °C для центрифужных пробирок типа "Фалькон" объемом 50 мл и ускорением 10000 об/мин образец мочи в объеме 10,0 мл центрифугируют при g, соответствующей 10000 об/мин, в течение 10 мин (величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ). После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок и 1 мл надосадочной жидкости над ним переносят в пробирку типа "Эппендорф". Затем снова концентрируют пробу при g, соответствующей 10000 об/мин, в течение 10 мин (величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ). Верхнюю часть надосадочной жидкости удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок ресуспендируют в нижней части надосадочной жидкости (100 - 200 мкл) и используют для экстракции РНК. Для экстракции РНК, в случае наличия большого количества солей, в отдельную пробирку типа "Эппендорф" переносят нижнюю часть надосадочной жидкости и используют ее для исследования. При отсутствии центрифуги с указанными выше параметрами проводят концентрирование только из 1 мл мочи, как описано выше. Экстракцию РНК также проводят из осадка и нижней части надосадочной жидкости.

Кусочки органов подготавливают, как указано в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.

3. Забор материала для вирусологического исследования.

3.1. Материал для исследования. Материалом для выделения возбудителей ГЛПС являются цельная кровь, плазма, сгусток крови, секционный материал (почки, печень, легкие, селезенка).

3.2. Метод исследования. Выделение вирусов на чувствительной биологической модели.

3.3. Период забора материала. Согласно п. 2.3 приложения 5 к настоящим МУ.

3.4. Методика забора материала. Кровь для исследования цельной крови и плазмы забирают, как указано в п. 2.4 приложения 5 к настоящим МУ; для исследования сгустка - как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

Секционный материал отбирают, как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

3.5. Предобработка проб. Согласно пп. 1.5 и 2.5 приложения 5 к настоящим МУ.

Для вирусологического исследования недопустимо внесение в пробы консерванта и проведение инактивации материала.

4. Условия хранения проб. Плазму и сыворотку крови хранят при температуре от плюс 2 °C до плюс 8 °C не более 2 суток, при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C - не более одного месяца, при температуре не выше минус 70 °C или в жидком азоте - длительно. Образцы тканей хранят при температуре не выше минус 18 °C до месяца, при температуре не выше минус 70 °C или в жидком азоте - длительно.

Мочу для исследования на наличие антител к хантавирусам с помощью МФА хранят при температуре от плюс 2 °C до плюс 8 °C не более 2 - 3 суток, при температуре от минус 18 °C до минус 20 °C - длительно.

Мочу для исследования методом ПЦР, если нет возможности для ее транспортировки и исследования в течение 1 суток после взятия, переносят в центрифужную пробирку типа "Фалькон" или пробирку типа "Эппендорф", затем в нее вносят глицерин (10 % от объема пробы), перемешивают для равномерного распределения глицерина и замораживают при минус 18 °C для хранения в течение 1 недели, для более длительного хранения - при минус 70 °С.

Не допускается оттаивание материала до проведения исследования.

Цельная кровь замораживанию не подлежит. Необходимо отделить сыворотку крови от сгустка.

Все виды (аликвоты) материала, предназначенные для вирусологического исследования, хранят при температуре не выше минус 70 °C.

5. Условия транспортировки материала в лабораторию.

Материал должен быть транспортирован в лабораторию в максимально короткие сроки с момента забора. Если время транспортировки материала в лабораторию не превышает 4 ч, то возможно использование термоконтейнера с хладагентами; в этом случае материал до транспортировки не подлежит замораживанию.

При замораживании клинического материала его транспортировка также должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только однократное замораживание-оттаивание образцов.

При невозможности быстрой доставки материал для вирусологического исследования следует транспортировать в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом или в емкости с сухим льдом.