Приложение C (справочное). Обучение исследованию подвижности сперматозоидов

Приложение C
(справочное)

Обучение исследованию подвижности сперматозоидов

Обучение исследованию подвижности сперматозоидов является необходимым условием для надлежащего исследования спермы человека. Теоретическое понимание категорий подвижности сперматозоидов должно сочетаться с достаточной практической подготовкой по правильной классификации сперматозоидов с различными классами подвижности (см. рисунок C.1). Для диагностики пациента необходимо определить, содержит ли эякулят достаточное количество сперматозоидов с поступательной подвижностью, необходимой для того, чтобы продвинуться через цервикальную слизь и достигнуть места оплодотворения.

Примечание - Сетка счетной камеры имеет размер стороны ячейки 25 мкм для облегчения визуальной классификации подвижности поступательного движения.

A и B - быстрая поступательная подвижность сперматозоидов; C, D и E - медленная поступательная подвижность сперматозоидов; F - непоступательное круговое движение

Рисунок C.1 - Иллюстрация движения подвижных сперматозоидов, показывающая, как устанавливаются классы подвижности на основе прироста пространства

Цель обучения

Стандартизация подходов к классификации сперматозоидов в зависимости от их подвижности в один из четырех классов:

a) быстрая поступательная подвижность сперматозоида (активные движения хвоста сперматозоида, скорость поступательного движения не менее 25 мкм/с);

b) медленная поступательная подвижность сперматозоида (активные движения хвоста сперматозоида, скорость поступательного движения от 5 до 24 мкм/с);

c) непоступательная подвижность сперматозоида (активные движения хвоста сперматозоида со скоростью движения от 0 до 4 мкм/с);

d) отсутствие подвижности сперматозоида (без активных движений хвоста сперматозоида).

Примечание - Это не означает, что оценивают точную скорость каждого сперматозоида. В рамках исследования каждый сперматозоид классифицируют к конкретному классу подвижности.

Учебные материалы

Образцы спермы, микроскоп с видеокамерой и дисплеем:

- для первоначального ознакомления рекомендуется проводить обучение вместе с опытным специалистом;

- рекомендуется иметь на дисплее сетку счетной камеры с квадратами, откалиброванными в соответствии с размерами 25  25 мкм, чтобы облегчить различие между сперматозоидами с быстрой поступательной подвижностью и сперматозоидами с медленной поступательной подвижностью (см. рисунок C.2).

Изображения видеопоследовательностей:

- эякуляты с широким диапазоном концентрации сперматозоидов и распределения подвижности;

- не менее чем с пятью различными полями микроскопа, позволяющими оценить в общей сложности не менее 200 сперматозоидов;

- рекомендуется иметь сетку счетной камеры с квадратами либо на дисплее (например, см. рисунок C.2), либо наложенную на изображение видеопоследовательности и откалиброванную в соответствии с размерами 25  25 мкм, чтобы облегчить различие между быстрой и медленной поступательными подвижностями сперматозоидов.

Рисунок C.2 - Пример наложения для видеомонитора, используемого для определения подвижности сперматозоидов пациента (адаптировано из [14])

Окружность изображает поле зрения, сравнимое с полем зрения под микроскопом, а центральная группа из четырех прямоугольников, обозначенная утолщенной линией, используется для определения меньшей площади поля для облегчения подсчета при высокой концентрации сперматозоидов. Линии сетки счетной камеры располагают на расстоянии 25 мкм друг от друга после калибровки (с помощью предметного микрометра), поэтому, если сперматозоид пересекает расстояние за 1 с, его можно классифицировать как имеющий скорость движения не менее 25 мкм/с, т.е. этот сперматозоид относится к классу с "быстрой поступательной подвижностью".

Наложение зависит от конкретной комбинации оптических элементов (модель микроскопа, объектив, промежуточное увеличение, коэффициент увеличения, если оптика не имеет коррекции на бесконечность, адаптер камеры, окуляр камеры, если используется, и модель видеокамеры). Если в лаборатории применяют несколько комбинаций, то для каждой комбинации требуется собственное откалиброванное наложение.

Учебный процесс

Базовое введение в принципы подвижности сперматозоидов:

- теоретические занятия: объяснение классов подвижности сперматозоидов;

- практические занятия: просмотр нескольких изображений видеопоследовательностей эякулята вместе с опытным специалистом для определения класса в зависимости от подвижности сперматозоидов.

Целенаправленное обучение [14], [12]:

- дают неопытному специалисту серию зарегистрированных образцов спермы (первоначально может быть меньшее количество, например восемь образцов, позже до 20 образцов) с известными целевыми значениями, полученными опытными специалистами, регулярно участвующими в межлабораторных сличениях, которые подтвердили квалификацию, получив точный результат исследования подвижности сперматозоидов на материале с валидированными контрольными значениями;

- когда оценка серии зарегистрированных образцов спермы завершена, результаты каждого образца сравнивают с известными целевыми значениями для определения процента подвижных сперматозоидов (a + b + c), процента сперматозоидов с поступательной подвижностью (a + b) и процента сперматозоидов с быстрой поступательной подвижностью (a) соответственно;

- разницу результатов исследования вычисляют как результат неопытного специалиста, вычтенный из результата опытных специалистов.

Примечание - Отрицательная разница указывает на то, что неопытный специалист неправильно классифицировал класс сперматозоидов;

- вычисляют среднее значение разности результатов, стандартное отклонение и 95 %-ный доверительный интервал среднего значения;

- после оценки каждой серии зарегистрированных образцов неопытного специалиста дается обратная связь с опытным специалистом для разъяснения заниженных и завышенных результатов;

- обучение выполняют путем повторения серии зарегистрированных образцов до тех пор, пока неопытный специалист не получит среднюю разницу результатов 0 % ( 1 %) с погрешностью измерения (95 %-ный доверительный интервал) менее  10 %, а для исследования сперматозоидов с быстрой поступательной подвижностью и медленной поступательной подвижностью -  5 %.

Переподготовка

Сотрудникам, возвращающимся к работе в лаборатории после продолжительного перерыва (например, более 6 мес) или после получения результатов внутреннего контроля качества, не соответствующих стандартам лаборатории, настоятельно рекомендуют пройти переподготовку путем изучения 20 комплектов, состоящих из 30 зарегистрированных образцов спермы (архивный материал с известными целевыми значениями), для достижения такой же цели, как и для начального процесса обучения.