Приложение I (справочное). Исследование морфологии сперматозоида

Приложение I
(справочное)

Исследование морфологии сперматозоида

Используя аликвоты по 10 мкл из тщательно перемешанного эякулята, готовят мазки на чистых, промаркированных предметных стеклах.

Перед фиксацией и окрашиванием дают мазкам высохнуть на воздухе. Метод окрашивания по Папаниколау, адаптированный для спермы пациента, рекомендуется как приоритетный метод окрашивания [14].

После окрашивания мазков на предметных стеклах их накрывают покрывными стеклами большого размера (например, 24  50 мм).

Необходимость проводить исследование повторной аликвоты отсутствует в случае применения валидированного метода [11].

Для исследования необходимо изучить не менее 200 целых сперматозоидов для определения нормальной морфологии или аномалий головки, шейки/средней части, хвоста сперматозоида или остаточной цитоплазматической массы (ранее "цитоплазматическая капля") (строгие критерии Тайгерберга, см. [10]). Обращают внимание на то, что отнесение сперматозоида к аномальным проводят по наличию по крайней мере одной дефектной области, но сперматозоид может иметь до четырех дефектных областей, и все они должны быть подсчитаны в рамках исследования (см. рисунок I.1). Любую специфическую аномалию, встречающуюся более чем в 20 % сперматозоидов, фиксируют отдельно в протоколе и включают в общий расчет. Если на 100 целых сперматозоидов приходится более 20 свободных головок, то количество свободных головок указывают отдельно как количество свободных головок на 100 целых сперматозоидов и не включают в подсчет аномальных сперматозоидов. В процессе исследования могут быть выявлены артефакты, которые не следует регистрировать как отклонения (см. рисунок I.2).

Примечание - Различные методы фиксации и окрашивания могут вызывать переменное набухание или сморщивание головки сперматозоида. При определении того, является ли головка сперматозоида меньше или больше нормальной формы, необходимо использовать соответствующие размеры головки, установленные для различных методов окраски препаратов, например в препаратах, окрашенных по Папаниколау, нормальная головка сперматозоида имеет размеры 4,3 мкм в длину и 2,7 мкм в ширину [8].

Результаты вычисляют следующим образом:

- как процент нормальных сперматозоидов (результат представляют как целое число);

- распространенность каждого типа аномалий на 100 сперматозоидов (результат представляют как целое число);

- при необходимости, индекс TZI вычисляют как сумму подсчитанных аномальных участков, разделенную на количество аномальных сперматозоидов, из которых они подсчитаны. TZI представляют числовым значением от 1,00 до 4,00 с точностью до двух десятичных знаков.

A - нормальная форма головки сперматозоида: 1 - формы сперматозоидов; 2 - головка нормального размера и формы с несколькими вакуолями (занимающими менее 20 % площади головки нормального размера); 3 - вид сбоку сперматозоида; B - вариации размера/формы головки сперматозоида: 1 - маленькая форма головки; 2 - большая форма головки; 3 - конусовидная форма головки (отношение длины к ширине более 2:1); 4 - грушевидная форма головки; 5 - комбинированная конусовидная и грушевидная форма головки; 6 - суженная задняя область сперматозоида ("сжатая шейка"); 7 - аморфные формы сперматозоида (a - суженные; b - редуцированная акросома; c - плотное окрашивание/отсутствие акросомы); 8 - вакуолизированная форма головки; 9 - кратерный дефект; C - дефекты шейки/средней части сперматозоида: 1 - ассиметричное прикрепление средней части к головке (гетероаксиальность); 2 - невставленный хвост; 3 - отсутствует хвост; 4 - растянутая средняя часть (обычно окрашивается красным цветом по Папаниколау); 5 - аномально тонкая средняя часть (без митохондрий); 6 - соединенная форма (слияние средней части); D - остаточная цитоплазма (ранее называвшаяся "цитоплазматическая капля"), которая составляет более 1/3 площади нормального размера головы (обычно окрашивается зеленым цветом по Папаниколау); E - дефекты хвоста сперматозоида: 1 - скрученный хвост; 2 - множественный хвост (может быть больше двух хвостов); 3 - короткий хвост; 4 - шпилькообразный хвост; 5 - согнутый хвост (угол менее 90°); 6 - хвост с каплеобразным окончанием

Рисунок I.1 - Схемы, иллюстрирующие внешний вид нормального сперматозоида пациента и ряд обычно описываемых морфологических аномалий (адаптировано [14])

1 - вид сверху сперматозоида; 2 - вид сбоку сперматозоида; 3 - усадка в процессе окрашивания может привести к отделению хвоста сперматозоида от головки сперматозоида

Рисунок I.2 - Схемы, показывающие, как происходит усадка при сушке, фиксации и окрашивании мазков для исследования морфологии сперматозоидов, которые могут привести к искусственному отделению хвоста сперматозоида от головки, оставляя небольшой зазор между средней частью и базальной поверхностью головы (адаптировано из [14])