Приложение 2. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM и IgG к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов

Приложение 2
к МР 4.2.0287-22

Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM и IgG к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов

1. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов включает в себя следующие этапы:

1.1. Лиофилизированный контрольный препарат ВКП-IgM необходимо восстановить добавлением 200 мкл дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

1.2. Приготовить 2-кратные разведения контрольного препарата ВКП-IgM от 1:2 до 1:128 с использованием ОДС для исследования в 4 параллелях. Разведения тщательно перемешать на вортексе.

1.3. Провести ИФА с применением полученных разведений контрольного препарата ВКП-IgM, согласно инструкции к используемой тест-системе.

1.4. Используя полученные данные, вычислить средний показатель ОП для 4 значений каждого из разведений ВКП-IgM.

1.5. По результатам построить график, где на оси ординат (Y) откладывают средние значения ОП разведений контрольного препарата ВКП-IgM, на оси абсцисс (X) - разведения контрольного препарата ВКП-IgM.

1.6. Определить рабочее разведение контрольного препарата ВКП-IgM, которое устанавливается с помощью построенного графика. Для этого вычисляют значение ОП, равное 2 - 3 значениям cut off. Любое разведение контрольного препарата, находящееся в данном диапазоне ОП, может быть определено как рабочее.

Пример определения разведений препарата ВКП-IgM с использованием тест-систем двух форматов - "indirect" и "capture" - указан на рисунке 2.1.

Для тест-системы "indirect"-формата разведение контрольного препарата ВКП-IgM 1:10 (ОП = 0,96 о.е.), специфическая активность которого находится в диапазоне 2 - 3 х ОП _пор. (0,76 - 1,14 о.е.), является рабочим разведением (далее - рабочий раствор).

Для тест-системы "capture"-формата разведение контрольного препарата ВКП-IgM 1:2 (ОП = 0,56 о.е.), специфическая активность которого находится в диапазоне 2 - 3 х cut off (0,4 - 0,6 о.е.), является рабочим разведением (далее - рабочий раствор).

Рис. 2.1. Пример определение рабочего разведения контрольного препарата ВКП-IgM в тест-системах двух форматов: "indirect" (А) и "capture" (В)

Примечание: пунктирные линии, пересекающие кривую линию зависимости активности контрольного препарата от его разведения, на оси ординат (Y) показывают значение ОП разведения контрольного препарата, а на оси абсцисс (X) - разведение.

1.7. Провести оценку внутрисерийной сходимости результатов путем анализа 10 проб каждого подобранного рабочего разведения для каждой тест-системы.

1.8. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV ₁₀ по формуле (см. приложение 3 к настоящим МР).

Пример результатов определения сходимости значений рабочего раствора ВКП-IgM, полученных с помощью тест-систем разных форматов: "indirect" - CV = S/Xcp х 100 % = 4,616 %; "capture" - CV = S/Xcp x 100 % = 7,009 % указан в таблице 2.1.

Таблица 2.1

Пример результатов определения сходимости значений рабочего раствора ВКП-IgM, полученных с помощью тест-систем разных форматов

Формат тест-систем	Оптическая плотность (о.е.)
"indirect"	0,91	0,86	0,99	0,93	0,91	0,95	0,91	0,94	0,84	0,91
"capture"	0,53	0,6	0,52	0,58	0,5	0,49	0,53	0,51	0,57	0,5

1.9. Определить воспроизводимость значения путем анализа результатов 20 проб рабочего разведения ВКП-IgM. Варианты получения значений 20 проб (см. подпункт 4 пункта 3.6).

В качестве примера приведем данные, полученные с помощью тест-систем двух форматов: "indirect" и "capture" (табл. 2.2).

Таблица 2.2

Пример результатов определения воспроизводимости значений 20 проб рабочего раствора ВКП-IgM

Формат тест-систем	Оптическая плотность (о.е.)
"indirect"	1,23	1,14	0,99	1,16	0,91	0,95	1,25	0,94	1,15	0,91
	0,91	0,86	1,19	0,93	1,25	0,96	0,91	1,23	0,84	1,12
"capture"	0,46	0,6	0,49	0,58	0,63	0,49	0,69	0,51	0,57	0,66
	0,53	0,61	0,52	0,6	0,5	0,68	0,53	0,48	0,59	0,5

1.10. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV ₂₀ по формуле (приложение 3 к настоящим МР).

Пример: показатели CV ₂₀ рабочего раствора контрольного препарата ВКП-IgM по результатам, полученным с помощью тест-систем "indirect"- и "capture"-формата, составляют 13,87 % и 12,595 %, соответственно, и не превышают 14,2 %, что позволяет приступить к построению контрольной карты.

1.11. Рассчитать среднюю арифметическую величину Хср, среднеквадратическое отклонение S, контрольные пределы: Хср1S, Хср2S и Хср3S.

Пример рассчитанных значений контрольных показателей рабочего раствора ВКП-IgM для тест-систем "indirect"- и "capture"-формата, необходимых для построения контрольной карты Леви-Дженнингса, указан в таблице 2.3.

Таблица 2.3

Пример значений контрольных показателей рабочего раствора ВКП-IgM для тест-систем "indirect"- и "capture"-формата

Показатель	"indirect", ОП (о.е.)	"capture", ОП (о.е.)
Хср.	1,044	0,56
Ст. откл. (S)	0,145	0,071
X + 1S	1,189	0,631
X - 1S	0,899	0,489
X + 2S	1,334	0,702
X - 2S	0,754	0,418
X + 3S	1,479	0,773
X - 3S	0,609	0,347

1.12. Построить контрольные карты Леви-Дженнингса (приложение 4 к настоящим МР).

Пример: на рис. 2.2 представлена контрольная карта и результаты оперативного контроля ВКП-IgM в разведении 1:10, который подвергался процедурам, предусмотренным инструкцией для исследуемых образцов при постановке тест-системы "indirect"-формата.

Рис. 2.2. Результаты оперативного КК исследований при определении IgM-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольного препарата ВКП-IgM

Показатели ОП рабочего раствора ВКП-IgM нанести на карту, на оси абсцисс (X) которой находится номер исследования (в реальном режиме - дата исследования), а на оси ординат (Y) - значения определяемого контрольного раствора ОП (о.е.).

1.13. Результаты работы аналитической системы оценить в соответствии с правилами Вестгарда (см. приложение 5 к настоящим МР).

1.14. В результате при использовании контрольного препарата ВКП-IgM, предлагаемого в данном примере, для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса М к вирусу кори рекомендовано рабочее разведение 1:10 для тест-системы "indirect"-формата и разведение 1:2 для тест-системы "capture"-формата.

2. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgG-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов включает в себя следующие этапы:

2.1. Лиофильно высушенный препарат ВКП-IgG, содержащий IgG к вирусу кори, восстановить добавлением 200 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешать.

2.2. Приготовить 2-кратные разведения контрольного препарата с 1:2 до 1:8 с использованием ОДС, тщательно перемешать на вортексе.

2.3. Осуществить тестирование в ИФА приготовленных разведений, включая исходный цельный препарат в трех повторах.

2.4. Используя полученные данные, вычислить средний показатель ОП для 3 повторов исходного препарата и каждого разведения, после чего построить график, где ось ординат (Y) - средние значения ОП; ось абсцисс (X) - степень разведения образца.

2.5. Далее выбрать рабочее разведение контрольного препарата.

В качестве примера: результаты исследования ВКП-IgG с использованием тест-системы 1 и тест-системы 2, сертифицированных в Российской Федерации (рис. 2.3) показали, что поскольку в тест-системе 1 за величину cut-off принято значение калибратора 0,15 МЕ/мл, соответствующее ОП = 0,108 о.е., то условиям, принятым для контрольного материала на IgM в 2 - 3 cut-off, удовлетворяет разведение 1:2 (ОП = 0,312 о.е.). Данное значение находится в нелинейном участке калибровочной кривой, в котором резко возрастает погрешность измерения, и не удовлетворяет условию нахождения в диапазоне ОП 0,5 - 1,5 о.е., принятом для контрольных препаратов на IgG [17]. Этому условию удовлетворяет цельный контрольный образец (ОП = 0,814 о.е.), так как определяемые значения оказываются в линейной области калибровочной кривой.

Рис. 2.3. Зависимость изменений ОП образца ВКП-IgG от его разведения в разных тест-системах

Рассчитанная концентрация контрольного препарата для исследования IgG-антител не должна находиться в зоне значений (точек) калибровочных образцов, входящих в состав набора реагентов, по которым строится калибровочный график от точки к точке. Было доказано, что попадание значения контрольного образца в область точки калибратора резко повышает значение коэффициента вариации [20]. При тестировании ВКП-IgG получили ОП = 0,814 о.е., что соответствует 0,810,13 МЕ/мл, следовательно он не попадает на точки калибраторов с концентрацией 0,5 и 1 МЕ/мл, что важно при проведении исследования количественным способом. В тест-системе 2 за величину. cut-off принято значение калибратора 0,15 МЕ/мл, соответствующее ОП = 0,433 о.е.

Условиям, принятым для контрольного материала на IgM в 2 - 3 cut-off, не удовлетворяет даже цельный контрольный образец, так как в этой тест-системе его ОП = 0,765 о.е., что составляет лишь 1,8 cut-off. ОП цельного контрольного образца удовлетворяет условию нахождения в диапазоне ОП 0,5 - 1,5 о.е., а рассчитанная концентрация ВКП-IgG составляет в этой тест-системе 0,72 МЕ/мл, следовательно он не попадает на точки калибраторов. В результате проведенных исследований было показано, что для оценки сходимости результатов, построения контрольных карт и проведения оперативного контроля при исследовании IgG-антител критерий в 2 - 3 cut-off не подходит. Следует ориентироваться на критерий попадания ОП контрольного препарата (цельного или его разведения) в диапазон 0,5 - 1,5 о.е. и непопадания на точки калибраторов при количественном методе оценки результатов.

В качестве примера представлены исследования с применением ВКП-IgG в тест-системе 1, зарегистрированной в Российской Федерации. В данном случае цельный препарат ВКП-IgG удовлетворяет критерию попадания измеренной ОП в интервал 0,5 - 1,5 о.е. и не попадает в зону точек калибратора.

2.6. Оценить внутрисерийную сходимость результатов 10 измерений контрольного препарата ВКП-IgG в одной аналитической серии методом ИФА.

2.7. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV ₁₀ по формуле (приложение 3 к настоящим МР). Результаты можно учитывать двумя способами: качественным в ОП (о.е.) и количественным (МЕ/мл).

В таблице 2.4 представлен пример 10 измерений контрольного препарата ВКП-IgG.

Таблица 2.4

Результаты определения сходимости значений контрольного препарата

N	ОП (о.е.)	МЕ/мл
1	0,818	0,73
2	0,795	0,71
3	0,851	0,76
4	0,941	0,84
5	0,739	0,66
6	0,818	0,73
7	0,795	0,71
8	0,840	0,75
9	0,806	0,72
10	0,739	0,66
Хср.	0,814	0,73
Ст. откл. (S)	0,058	0,05

2.8. Результаты расчетов определения сходимости значений ВКП занести в таблицу. Шаблон таблицы для внесения результатов сходимости измерений ВКП представлен в приложении 6 к настоящим МР.

Показатели CV ₁₀ контрольного препарата не должны превышать 8 % (см. подпункт 2 пункта 3.6). В рассматриваемом примере CV ₁₀ для качественного учета ОП (о.е.) оказался равным 7,1 %, а для количественного учета (МЕ/мл) 7,15 %. Рассчитанные характеристики удовлетворяют заданному критерию в 8 %, что позволяет перейти к следующему этапу. Если полученное значение CV ₁₀ превышает 8 %, следует найти причину и устранить ее.

2.9. Далее провести оценку воспроизводимости результатов путем анализа тестирования 20 проб цельного контрольного препарата ВКП-IgG методом ИФА (варианты получения значений 20 проб аналогичны указанным для случая ВЛК на IgM-корь, см. подпункт 4 пункта 3.6).

2.10. Используя полученные результаты, рассчитать значения CV ₂₀, среднюю арифметическую величину Хср, среднеквадратическое отклонение S, контрольные пределы: Хср1S, Хср2S и Хср3S по формулам (приложение 3 к настоящим МР).

Рассчитанные параметры рассматриваемого примера, необходимые для построения контрольной карты Леви-Дженнингса, представлены в табл. 2.5.

Таблица 2.5

Параметры для построения контрольной карты Леви-Дженнингса

Показатель	ВКП-IgG
	МЕ/мл	ОП
Хср ВЛК	0,810	0,896
Ст. откл. (S)	0,136	0,165
Х + 1S	0,947	1,061
X - 1S	0,675	0,731
X + 2S	1,083	1,226
X - 2S	0,539	0,566
X + 3S	1,218	1,392
X - 3S	0,404	0,401

Значение CV ₂₀ не должно превышать 19 %. В рассмотренном примере полученные значения для качественного способа составили 18,412 %, а для количественного способа определения IgG - 16,74 %, что в обоих случаях удовлетворяет требованию. Следовательно, полученные результаты позволяют построить контрольные карты Леви-Дженнингса для качественного ОП (о.е.) и, при необходимости, количественного (МЕ/мл) способов определения IgG-антител к кори методом ИФА соответственно (см. приложение 4 к настоящим МР).

2.11. Построенные контрольные карты использовать для осуществления оперативного (текущего) контроля качества результатов исследования образцов на предмет выявления IgG-антител к вирусу кори методом ИФА. С этой целью в каждой аналитической серии в одной лунке исследовать препарат ВКП-IgG, который подвергается всем процедурам, предусмотренным инструкцией для исследуемых образцов, и измерить показатель оптической плотности (качественная оценка) или рассчитать концентрацию ВЛК (количественная оценка результатов). Полученные результаты нанести на контрольную карту с указанием даты постановки вручную или используя стандартный пакет программ.

2.12. Стабильность работы аналитической системы оценивать согласно правилам Вестгарда [18] (приложение 5 к настоящим МР).

На рис. 2.4 и 2.5 представлены в качестве примера заполненные контрольные карты по результатам измерения ВКП-IgG количественным и качественным способом методом ИФА.

Рис. 2.4. Оперативный контроль качества для определения концентрации антител класса IgG к вирусу кори количественным методом

Примечание: ось ординат (Y) - результаты тестирования контрольного препарата при каждом эксперименте; ось абсцисс (X) - номер опыта (в реальном режиме следует ставить дату проведения эксперимента).

Рис. 2.5. Оперативный контроль качества для определения уровня антител класса IgG к вирусу кори качественным методом

Примечание: ось ординат (Y) - результаты тестирования контрольного препарата при каждом эксперименте; ось абсцисс (X) - номер опыта (в реальном режиме следует ставить дату проведения эксперимента).

Результаты измерений ВКП-IgG находились в соответствии с контрольными правилами, что свидетельствует о правильности проведения исследования IgG-антител к вирусу кори методом ИФА.

3. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM- и IgG-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов представлен на схеме (рис. 2.6).

Рис. 2.6. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM- и IgG-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов