Приложение 3. Протокол экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса трикетонов

Приложение 3
к MP 1.2.0301-22

Протокол
экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса трикетонов

Критерий	Соответствие
1. Лаборатория, выполнившая эксперимент, имеет действующую аккредитацию в системе (ГОСТ ISO/IEC 17025, ГОСТ 33044)	ГОСТ ISO/IEC 17025, сертификат аккредитации POCC.RU.0001.510122, дата внесения в Реестр сведений об аккредитованном лице 06.04.2015. Лаборатория имеет опыт работ более 10 лет и имеет историческую базу данных
2. Испытания выполнены в соответствии с методиками (методами) (например, ГОСТ, МУ, руководство)	1. Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях	ГОСТ 32376 МУ 1.2.3364-16
	2. Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих	МУ 1.2.3364-16 ГОСТ 34660
	3. Щелочной кометный анализ in vivo на млекопитающих	МУ 1.2.3364-16
3. Критерии качества проведения экспериментов:
3.1. Название метода: Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора растворителя в соответствии с физико-химическими свойствами вещества и цитотоксичностью		Приведено
3. Подтверждение генотипа каждой индикаторной культуры		Выполнено
4. Комбинация штаммов (не менее 5 штаммов)		Исследование проведено на 5 штаммах Salmonella typhimurium, включая штаммы, выявляющие перекрестные сшивки и замены пар оснований
5. Титр бактериальной суспензии (не менее 10 9 клеток/см 3)		Соответствует
6. Количество и диапазон концентраций (не менее 5 концентраций, рекомендуемая максимальная концентрация не менее 5 мг/чашка или нецитотоксичная концентрация)		Основной эксперимент - 6 концентраций 0,005; 0,05; 0,125; 0,5; 1,25; 5,0 мг/чашка; повторный эксперимент - 0,05; 0,5; 2,5 и 5,0 мг/чашка
7. Выбор растворителя		Адекватный. ДМСО
8. Позитивные контроли		Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Для штаммов ТА97, ТА98, ТА1535, ТА100. ТА102: 2-аминоантрацен в условиях метаболической активации. Без метаболической активации: 2-нитрофлуорен (ТА98), азид натрия (ТА100, ТА1535), метилметансульфонат (ТА102), митомицин С и 9-аминоакридин (ТА97)
9. Условия проведения эксперимента (температура, время инкубации, количество чашек на концентрацию, присутствие/отсутствие смеси S9)		Стандартный чашечный тест в вариантах с присутствием и отсутствием системы метаболической активации при температуре плюс 37 °C, инкубация 64 - 72 часов, три повтора на концентрацию
10. Контроль фона спонтанного мутирования		Соответствует литературным данным
11. Статистический анализ		Адекватный. Использован критерий Даннетта t и ранговый метод Спирмена (при = 0,05)
12. Критерии приемлемости тест-системы: - соответствие генетических характеристик, присущих каждому штамму, согласно его паспорту: наличие rfa-мутации, ауксотрофность по гистидину, наличие плазмиды рКМ101 (кроме ТА1535) и pAQ1 для ТА102, чувствительность к УФ; - число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле должно укладываться в диапазон известной частоты спонтанных ревертантных мутаций по гистидину для каждого штамма; - положительные контроли проявляют выраженную мутагенную активность на всех штаммах в условиях метаболической активации и без нее		Соблюдены
13. Критерии определения положительного результата: - вещество рассматривают как обладающее мутагенной активностью, если оно вызывает воспроизводимое, зависящее от дозы и статистически достоверное увеличение частоты мутаций по сравнению с соответствующими отрицательными контролями у одного или более штаммов в условиях метаболической активации или без нее по меньшей мере в 2 независимых экспериментах. При этом число ревертантных колоний на чашку в опыте должно в 2 или более раз превышать число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле в случае штаммов ТА97, ТА98, ТА100, ТА102 и в 3 или более раз в случае штамма ТА1535		Адекватны. Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Наблюдали зависимое от дозы и статистически значимое превышение числа ревертантных колоний при действии пестицида из класса трикетонов по сравнению с отрицательным контролем: для штамма ТА97 при дозах 1,25 мг/чашка и выше в присутствии системы метаболической активации и без нее; для ТА100 при дозах 0,125 мг/чашка и выше в присутствии S9 и 0,5 мг/чашка и выше в отсутствие S9; для ТА102 при 0,125 мг/чашка и выше в присутствии S9 и 1,25 мг/чашка и выше в отсутствие S9. В повторном эксперименте с предварительной инкубацией значимые мутагенные эффекты наблюдали в случае штамма ТА97 при дозе 5,0 мг/чашка без метаболической активации и в случае штамма ТА102 при дозе 5,0 мг/чашка в присутствии системы метаболической активации. Во всех случаях кратность увеличения числа ревертантных колоний по сравнению с отрицательным контролем превышала 2. Согласно критериям оценки мутагенной активности, с биологической точки зрения данное вещество рассматривается как мутагенное для бактерий
3.2. Название метода: Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Приведены необходимые данные
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		В соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Растительное масло
3. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		5 особей каждого пола на группу
4. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 14,5 % самцы, не более 18,0 % самки
5. Путь введения вещества		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
6. Положительный контроль		Циклофосфамид в дозе 40 мг/кг МТ. Выбран в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2)
7. Количество доз (не менее 3, с шагом 2 - 4 раза)		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
8. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности и влияния на пролиферацию костного мозга (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) - 2000 мг/кг МТ
9. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 18 - 24 часа после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 22 часа после 2-го введения
10. Кодирование микропрепаратов		Выполнено
11. Микроскопический анализ микропрепаратов: - количество просчитанных клеток для доли ПХЭ среди общего числа эритроцитов - не менее 500 на животное; - количество просчитанных ПХЭ на животное - не менее 4000		- 500 клеток на животное - не менее 4000 ПХЭ на животное
12. Критерии приемлемости тест-системы: - не наблюдается смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдается смертности, связанной с воздействием тестируемого вещества в группах экспозиции; - данные по частоте ПХЭ с микроядрами в сопутствующем отрицательном контроле находятся в пределах 95 %-го распределения исторического отрицательного контроля лаборатории; - доля незрелых ПХЭ от общего числа эритроцитов после экспозиции с исследуемым веществом не должна быть менее 20 % от уровня в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе положительного контроля должна быть статистически значимо выше этого же показателя в группе отрицательного контроля и согласовываться с базой данных положительного контроля (далее - ПК) в лаборатории		Критерии соблюдены: - не наблюдали смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдали связанной с воздействием тестируемого вещества смертности в группах экспозиции; - средняя частота ПХЭ с микроядрами в отрицательном контроле уровне исторического контроля лаборатории; - доля ПХЭ от общего числа эритроцитов в группах экспозиции с пестицидом из класса трикетонов составляла не менее 81 % от уровня, определенного в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе мышей, получавших циклофосфамид, была значимо выше, чем значения этого параметра для отрицательного контроля, и сопоставима с историческими данными ПК в лаборатории
14. Статистический анализ: - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля выбран подходящий статистический метод, например метод построения 95 %-х доверительных интервалов обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона; - для обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы (или для оценки тренда) выбран подходящий статистический метод, например Мантеля-Хензеля		Адекватный. Использованы: - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля - метод построения 95 %-х доверительных интервалов профильного правдоподобия в рамках обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона (при = 0,05); - метод Мантеля-Хензеля для оценки тренда (обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы)
15. Критерии определения положительного результата: Исследуемое вещество является генотоксичным, если в исследовании обнаружено: - что по меньшей мере в одной из групп экспозиции наблюдается статистически значимое повышение частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению с сопутствующим отрицательным контролем; - такое повышение частоты ПХЭ с микроядрами связано с дозой (на основании подходящего теста оценки тренда); - какой-либо из полученных результатов находится вне границ распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (например, выходит за 95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)		Адекватны. Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2): - при дозе 2000 мг/кг МТ обнаружено статистически значимое превышение количества ПХЭ с микроядрами по сравнению с отрицательным контролем; - обнаружена линейная зависимость частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы при внутрижелудочном введении пестицида из класса трикетонов при = 0,05 (р = 0,037); - количество ПХЭ с микроядрами в группе экспозиции, получавшей пестицид в дозе 2000 мг/кг МТ, находится за пределами распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)
3.3. Название метода: Щелочной анализ ДНК-комет на млекопитающих in vivo
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		Приведено. Выбор растворителя корректный
3. Выбор животных для исследования (здоровые половозрелые грызуны в возрасте 6 - 10 недель)		Соблюдено
4. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		По 5 особей каждого пола в группе
5. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 17,2 % самцы, не более 18,7 % самки
6. Выбор тканей для исследований (исходя из предполагаемого механизма действия, пути введения)		Адекватно - костный мозг, печень
7. Выбор положительного контроля (должен давать явно выраженный позитивный эффект)		Метилметансульфонат - генотоксикант прямого действия, выбранный в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) и подходящий для используемых тканей (печени и костного мозга)
8. Количество доз (не менее 3 с шагом менее )		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
9. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) - 2000 мг/кг МТ
10. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 - 3 введения с интервалом 24 часа; забор образцов тканей через 2 - 6 часов после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга и печени через 3 часа после 2-го введения
11. Путь введения вещества (с учетом пути воздействия).		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
12. Время и условия хранения суспензий клеток от извлечения до приготовления микропрепаратов. Клетки должны храниться на льду в охлажденном буфере как можно более короткое время.		Соблюдено. Образцы клеток хранили на ледяной бане вплоть до наслаивания на стекло. Время хранения образцов было не более 1,5 - 2 часов
13. Условия и параметры лизиса и электрофореза в соответствии с методиками (методами) (лизис - не менее часа при температуре плюс 2 - 8 °C в отсутствие белого света, продолжительность релаксации не менее 20 мин; электрофорез - напряженность электрического поля 0,7 В/