Приложение 3. Протокол экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса трикетонов

Приложение 3
к MP 1.2.0301-22

Протокол
экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса трикетонов

Критерий	Соответствие
1. Лаборатория, выполнившая эксперимент, имеет действующую аккредитацию в системе (ГОСТ ISO/IEC 17025, ГОСТ 33044)	ГОСТ ISO/IEC 17025, сертификат аккредитации POCC.RU.0001.510122, дата внесения в Реестр сведений об аккредитованном лице 06.04.2015. Лаборатория имеет опыт работ более 10 лет и имеет историческую базу данных
2. Испытания выполнены в соответствии с методиками (методами) (например, ГОСТ, МУ, руководство)	1. Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях	ГОСТ 32376 МУ 1.2.3364-16
	2. Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих	МУ 1.2.3364-16 ГОСТ 34660
	3. Щелочной кометный анализ in vivo на млекопитающих	МУ 1.2.3364-16
3. Критерии качества проведения экспериментов:
3.1. Название метода: Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора растворителя в соответствии с физико-химическими свойствами вещества и цитотоксичностью		Приведено
3. Подтверждение генотипа каждой индикаторной культуры		Выполнено
4. Комбинация штаммов (не менее 5 штаммов)		Исследование проведено на 5 штаммах Salmonella typhimurium, включая штаммы, выявляющие перекрестные сшивки и замены пар оснований
5. Титр бактериальной суспензии (не менее 10 9 клеток/см 3)		Соответствует
6. Количество и диапазон концентраций (не менее 5 концентраций, рекомендуемая максимальная концентрация не менее 5 мг/чашка или нецитотоксичная концентрация)		Основной эксперимент - 6 концентраций 0,005; 0,05; 0,125; 0,5; 1,25; 5,0 мг/чашка; повторный эксперимент - 0,05; 0,5; 2,5 и 5,0 мг/чашка
7. Выбор растворителя		Адекватный. ДМСО
8. Позитивные контроли		Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Для штаммов ТА97, ТА98, ТА1535, ТА100. ТА102: 2-аминоантрацен в условиях метаболической активации. Без метаболической активации: 2-нитрофлуорен (ТА98), азид натрия (ТА100, ТА1535), метилметансульфонат (ТА102), митомицин С и 9-аминоакридин (ТА97)
9. Условия проведения эксперимента (температура, время инкубации, количество чашек на концентрацию, присутствие/отсутствие смеси S9)		Стандартный чашечный тест в вариантах с присутствием и отсутствием системы метаболической активации при температуре плюс 37 °C, инкубация 64 - 72 часов, три повтора на концентрацию
10. Контроль фона спонтанного мутирования		Соответствует литературным данным
11. Статистический анализ		Адекватный. Использован критерий Даннетта t и ранговый метод Спирмена (при = 0,05)
12. Критерии приемлемости тест-системы: - соответствие генетических характеристик, присущих каждому штамму, согласно его паспорту: наличие rfa-мутации, ауксотрофность по гистидину, наличие плазмиды рКМ101 (кроме ТА1535) и pAQ1 для ТА102, чувствительность к УФ; - число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле должно укладываться в диапазон известной частоты спонтанных ревертантных мутаций по гистидину для каждого штамма; - положительные контроли проявляют выраженную мутагенную активность на всех штаммах в условиях метаболической активации и без нее		Соблюдены
13. Критерии определения положительного результата: - вещество рассматривают как обладающее мутагенной активностью, если оно вызывает воспроизводимое, зависящее от дозы и статистически достоверное увеличение частоты мутаций по сравнению с соответствующими отрицательными контролями у одного или более штаммов в условиях метаболической активации или без нее по меньшей мере в 2 независимых экспериментах. При этом число ревертантных колоний на чашку в опыте должно в 2 или более раз превышать число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле в случае штаммов ТА97, ТА98, ТА100, ТА102 и в 3 или более раз в случае штамма ТА1535		Адекватны. Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Наблюдали зависимое от дозы и статистически значимое превышение числа ревертантных колоний при действии пестицида из класса трикетонов по сравнению с отрицательным контролем: для штамма ТА97 при дозах 1,25 мг/чашка и выше в присутствии системы метаболической активации и без нее; для ТА100 при дозах 0,125 мг/чашка и выше в присутствии S9 и 0,5 мг/чашка и выше в отсутствие S9; для ТА102 при 0,125 мг/чашка и выше в присутствии S9 и 1,25 мг/чашка и выше в отсутствие S9. В повторном эксперименте с предварительной инкубацией значимые мутагенные эффекты наблюдали в случае штамма ТА97 при дозе 5,0 мг/чашка без метаболической активации и в случае штамма ТА102 при дозе 5,0 мг/чашка в присутствии системы метаболической активации. Во всех случаях кратность увеличения числа ревертантных колоний по сравнению с отрицательным контролем превышала 2. Согласно критериям оценки мутагенной активности, с биологической точки зрения данное вещество рассматривается как мутагенное для бактерий
3.2. Название метода: Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Приведены необходимые данные
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		В соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Растительное масло
3. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		5 особей каждого пола на группу
4. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 14,5 % самцы, не более 18,0 % самки
5. Путь введения вещества		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
6. Положительный контроль		Циклофосфамид в дозе 40 мг/кг МТ. Выбран в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2)
7. Количество доз (не менее 3, с шагом 2 - 4 раза)		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
8. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности и влияния на пролиферацию костного мозга (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) - 2000 мг/кг МТ
9. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 18 - 24 часа после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 22 часа после 2-го введения
10. Кодирование микропрепаратов		Выполнено
11. Микроскопический анализ микропрепаратов: - количество просчитанных клеток для доли ПХЭ среди общего числа эритроцитов - не менее 500 на животное; - количество просчитанных ПХЭ на животное - не менее 4000		- 500 клеток на животное - не менее 4000 ПХЭ на животное
12. Критерии приемлемости тест-системы: - не наблюдается смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдается смертности, связанной с воздействием тестируемого вещества в группах экспозиции; - данные по частоте ПХЭ с микроядрами в сопутствующем отрицательном контроле находятся в пределах 95 %-го распределения исторического отрицательного контроля лаборатории; - доля незрелых ПХЭ от общего числа эритроцитов после экспозиции с исследуемым веществом не должна быть менее 20 % от уровня в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе положительного контроля должна быть статистически значимо выше этого же показателя в группе отрицательного контроля и согласовываться с базой данных положительного контроля (далее - ПК) в лаборатории		Критерии соблюдены: - не наблюдали смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдали связанной с воздействием тестируемого вещества смертности в группах экспозиции; - средняя частота ПХЭ с микроядрами в отрицательном контроле уровне исторического контроля лаборатории; - доля ПХЭ от общего числа эритроцитов в группах экспозиции с пестицидом из класса трикетонов составляла не менее 81 % от уровня, определенного в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе мышей, получавших циклофосфамид, была значимо выше, чем значения этого параметра для отрицательного контроля, и сопоставима с историческими данными ПК в лаборатории
14. Статистический анализ: - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля выбран подходящий статистический метод, например метод построения 95 %-х доверительных интервалов обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона; - для обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы (или для оценки тренда) выбран подходящий статистический метод, например Мантеля-Хензеля		Адекватный. Использованы: - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля - метод построения 95 %-х доверительных интервалов профильного правдоподобия в рамках обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона (при = 0,05); - метод Мантеля-Хензеля для оценки тренда (обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы)
15. Критерии определения положительного результата: Исследуемое вещество является генотоксичным, если в исследовании обнаружено: - что по меньшей мере в одной из групп экспозиции наблюдается статистически значимое повышение частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению с сопутствующим отрицательным контролем; - такое повышение частоты ПХЭ с микроядрами связано с дозой (на основании подходящего теста оценки тренда); - какой-либо из полученных результатов находится вне границ распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (например, выходит за 95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)		Адекватны. Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2): - при дозе 2000 мг/кг МТ обнаружено статистически значимое превышение количества ПХЭ с микроядрами по сравнению с отрицательным контролем; - обнаружена линейная зависимость частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы при внутрижелудочном введении пестицида из класса трикетонов при = 0,05 (р = 0,037); - количество ПХЭ с микроядрами в группе экспозиции, получавшей пестицид в дозе 2000 мг/кг МТ, находится за пределами распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)
3.3. Название метода: Щелочной анализ ДНК-комет на млекопитающих in vivo
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		Приведено. Выбор растворителя корректный
3. Выбор животных для исследования (здоровые половозрелые грызуны в возрасте 6 - 10 недель)		Соблюдено
4. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		По 5 особей каждого пола в группе
5. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 17,2 % самцы, не более 18,7 % самки
6. Выбор тканей для исследований (исходя из предполагаемого механизма действия, пути введения)		Адекватно - костный мозг, печень
7. Выбор положительного контроля (должен давать явно выраженный позитивный эффект)		Метилметансульфонат - генотоксикант прямого действия, выбранный в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) и подходящий для используемых тканей (печени и костного мозга)
8. Количество доз (не менее 3 с шагом менее )		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
9. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) - 2000 мг/кг МТ
10. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 - 3 введения с интервалом 24 часа; забор образцов тканей через 2 - 6 часов после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга и печени через 3 часа после 2-го введения
11. Путь введения вещества (с учетом пути воздействия).		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
12. Время и условия хранения суспензий клеток от извлечения до приготовления микропрепаратов. Клетки должны храниться на льду в охлажденном буфере как можно более короткое время.		Соблюдено. Образцы клеток хранили на ледяной бане вплоть до наслаивания на стекло. Время хранения образцов было не более 1,5 - 2 часов
13. Условия и параметры лизиса и электрофореза в соответствии с методиками (методами) (лизис - не менее часа при температуре плюс 2 - 8 °C в отсутствие белого света, продолжительность релаксации не менее 20 мин; электрофорез - напряженность электрического поля 0,7 В/см, сила тока 300 мА, продолжительность электрофореза не менее 20 мин при температуре плюс 2 - 10 °C)		Соблюдены. Лизис - 18 часов при 2 - 8 °C в отсутствие белого света. Температура буфера для электрофореза плюс 5 - 10 °C, сила тока 300 мА, напряженность электрического поля 0,7 В/см, время релаксации 20 мин, время электрофореза 30 мин
14. Микроскопирование и подсчет клеток (проводят с использованием автоматической или полуавтоматической системы анализа изображений, микропрепараты должны быть закодированы; подсчитывают не менее 150 клеток на животное. Количество клеток "ежей" должно быть учтено отдельно. Для оценки индукции первичных повреждений ДНК используют показатель "% ДНК в хвосте")		Использована программа с автоматическим подсчетом параметров клетки, микропрепараты были закодированы, просчитаны не менее 150 клеток каждой ткани каждого животного. Количество клеток "ежей" подсчитывали отдельно. При оценке повреждающего действия пестицида из класса трикетонов использован показатель "% ДНК в хвосте"
15. Наличие базы исторических данных, устанавливающей диапазоны распределения отрицательного и положительного контролей		Да
16. Статистический анализ: - Для уменьшения эффекта нулевых значений первичные данные трансформируют путем логарифмирования или извлечения квадратного корня и/или добавления ко всем значениям малого числа, например, 0,001; - рассчитывают медианное значение для каждого микропрепарата и среднее медианных значений для каждого животного; - выбраны подходящие методы статистической обработки данных, включающие: проверку нормальности распределения данных; проверку однородности дисперсии; сравнение групп отрицательного и положительного контролей; выявление наличия/отсутствия эффекта в группах экспозиции и оценку наличия/отсутствия дозозависимого эффекта		Адекватный. Данные были трансформированы (логарифмирование и прибавление малого числа (0,001) ко всем значениям). Рассчитаны: - медианное значение логарифма "% ДНК в хвосте" для каждого микропрепарата и среднее медианных значений для каждого животного; - проверку нормальности распределения данных производили методом Шапиро-Уилка; проверку однородности дисперсии - методом Ливиня; сравнение групп отрицательного и положительного контролей было осуществлено t-тестом Стьюдента для независимых выборок; сравнение эффектов в группах экспозиции с отрицательным контролем осуществляли тестом Даннетта; - оценку наличия зависимости эффекта от дозы производили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена
17. Критерии приемлемости тест-системы: - отрицательный контроль оценивают по процентному содержанию ДНК в хвосте комет клеток животных отрицательного контроля. Значения ожидаемо низкие и считаются приемлемыми для включения в исторический контроль лаборатории; - в группе положительного контроля получен ожидаемый высокий процент содержания ДНК в хвосте, статистически значимый по сравнению с отрицательным контролем и сопоставимый с историческим положительным контролем лаборатории; - проанализировано достаточное количество клеток (не менее 150 клеток на животное в каждой ткани и не менее 3 доз); - при выборе МПД соблюдены критерии, установленные в соответствии с методиками (методами) (для нетоксичных веществ не более 2000 мг/кг МТ; для остальных случаев МПД, найденная в предварительном эксперименте, не вызывает смертности или состояний, требующих эвтаназии, вызывает явные клинические признаки слабой токсичности)		Выполнены. - среднее значение "% ДНК в хвосте" для костного мозга в группе отрицательного контроля 2,520,56; - среднее значение "% ДНК в хвосте" для печени в группе отрицательного контроля 3,131,04; - среднее значение "% ДНК в хвосте" комет в группе положительного контроля в костном мозге 19,87,2; в печени 25,85,4; - проанализировано не менее 150 клеток на животное в каждой ткани и 3 дозы; - пестицид из класса трикетонов, по литературным данным, является малотоксичным, МПД - 2000 мг/кг МТ
18. Критерии определения положительного результата: - как минимум для одной из групп экспозиции наблюдают статистически значимое увеличение показателя повреждения ДНК по сравнению с соответствующим отрицательным контролем; - при анализе зависимости эффекта от дозы подходящим методом найден положительный тренд; - какие-либо результаты выходят за пределы распределения данных исторического отрицательного контроля для данного вида, носителя, пути введения, ткани и количества введений		- ни в одной из групп обработки экспозиции эффект статистически значимо не отличался от значений в параллельном отрицательном контроле; - не обнаружено зависимости эффекта от дозы методом ранговой корреляции Спирмена; - все результаты не выходят за пределы распределения данных исторического отрицательного контроля для данного вида, носителя, пути введения, ткани и количества введений
Оценка результатов в тестах in vitro и in vivo
Метод: а) метод оценки обратных генных мутаций на бактериях; б) микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих; в) щелочной анализ ДНК-комет на млекопитающих in vivo		Результат: а) положительный (вещество индуцирует обратные генные мутации); б) положительный (вещество индуцирует образование микроядер); в) отрицательный (не индуцирует разрывы в молекулах ДНК)
Заключение: Представлены необходимые результаты исследований для проведения экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса трикетонов. Исследования проведены с использованием тестов, позволяющих выявлять все основные типы генетических повреждений В одном из тестов in vitro и в микроядерном тесте in vivo получены положительные эффекты. Таким образом, общее заключение - вещество является мутагеном